מאמר שיטה

צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin

DOI:

10.3791/57765

⸱

24 במאי 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FM צבעים משמשים כדי ללמוד את מחזור שלפוחית סינפטית (SV). הגששים amphipathic אלה יש הידרופילית בראש וזנב הידרופובי, הפיכתם מסיסים במים עם היכולת להיכנס ולצאת ממברנה השומנים bilayers הפיכה. צבעי styryl אלה הם יחסית ללא-פלורסנט במדיום מימית, אבל הכניסה לתוך העלעל החיצוני של קרום פלזמה גורם > 40 X לודיג זריחה. ב הסינפסות עצביים, צבעי FM הם הפנימו במהלך SV אנדוציטוזה, אקסוציטוזה SV הנסחרות הן בתוך והן בין בריכות SV, ואשר פורסמו עם, מתן כלי רב עוצמה כדי להמחיש presynaptic שלבי עצבית. מודל גנטי העיקרי של glutamatergic סינפסה התפתחות ותפקוד היא דרוזופילה צומת עצב-שריר (NMJ), איפה FM לצבוע הדמיה שימש בהרחבה לכמת SV dynamics במגוון רחב של תנאים מוטציה. הטרמינל סינפטית NMJ הינו נגיש בקלות, עם מגוון יפה של גדול סינפטית עם העיתון ons אידיאלי עבור הדמיה יישומים. כאן, אנו משווים חדות משלוש דרכים לעורר את דרוזופילה NMJ לנהוג תלויי-פעילות FM1-43 צבע ספיגת/שחרור...: אמבט 1) יישום של גבוהה [K+] depolarize רקמות עצב-שריר, 2) יניקה עצבים מוטוריים אלקטרודה גירוי depolarize העצב presynaptic מסוף, ו 3) לפלח הטרנסגניים ביטוי של משתנים channelrhodopsin עבור שליטה גירוי האור, המרחבי של דפולריזציה. כל השיטות האלה יש יתרונות וחסרונות לחקר השפעות מוטציה גנטית על מחזור SV- דרוזופילה NMJ. נדון אלה יתרונות וחסרונות לסייע הבחירה של הגישה גירוי, יחד עם מתודולוגיות ספציפיות לכל אסטרטגיה. בנוסף הדמיה פלורסנט, FM צבע יכול להיות photoconverted לאותות צפיפות אלקטרונים visualized באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הילוכים (TEM) ללמוד SV מנגנונים מחזור ברמה ultrastructural. אנו מספקים את ההשוואות של קונאפוקלית ואלקטרון הדמיה של השיטות השונות של גירוי דרוזופילה NMJ, כמדריך הבחירה של פרדיגמות ניסיוני בעתיד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאופיין להפליא דרוזופילה צומת עצב-שריר זחל (NMJ) glutamatergic סינפסה הדגם שימש ללמוד סינפסה היווצרות ותפקוד עם מגוון עצום של לפליטת גנטי1. הטרמינל מוטור נוירון מורכב רב ענפים האקסון, כל אחד עם העיתון ons מוגדלת סינפטיים רבים. אלה varicosities מרווח (עד 5 מיקרומטר בקוטר) לכלול את כל המנגנון עצבית, כולל הסינפטיות glutamatergic אחיד (SVs; ~ 40 ננומטר בקוטר) שמורת cytosolic ובריכות בקלות releasable2. שלפוחית אלה עוגנות קרום פלזמה presynaptic פיוז'ן אתר פעיל אזורי (AZs), שבו אקסוציטוזה שמתווכת שחרור נוירוטרנסמיטר גלוטמט עבור טרנס-סינפטית תקשורת. לאחר מכן, SVs מאוחזרות של קרום פלזמה דרך נשיקה-וברח מיחזור או בתיווך clathrin אנדוציטוזה (CME) מחזורים חוזרים ונשנים exo/אנדוציטוזה. דרוזופילה NMJ ונגיש בקלות מתאים היטב הן בידוד ואפיון מוטנטים מחזור SV. באמצעות מסכי גנטי קדימה, מוטציות הרומן הובילו זיהוי גנים חדשים קריטיים עבור מחזור SV3. יתר על כן, הפוך גישות גנטיות מתחיל עם הגנים ידוע כבר הובילו הבהרה של מנגנוני מחזור SV חדשים דרך התיאור זהיר של מוטציה רכיבה על אופניים פנוטיפים4. דרוזופילה NMJ אידיאלי כמעט כהכנה סינפטית ניסיוני ניקוד אנדוציטוזה SV מנגנונים אקסוציטוזה באמצעות שיטות שטיחות שלפוחית מסלול רכיבה על אופניים במהלך עצבית.

מגוון של סמנים פלורסנט לאפשר מעקב ויזואלי של שלפוחית במהלך רכיבה על אופניים dynamics, אבל הרב-גוניים ביותר הם תחליפי לצבוע FM אשר הוא קודם מסונתז על ידי מאו,. פ, ואח. 5. מבחינה מבנית, FM צבעים מכילים הידרופילית ראש וזנב lipophilic מחובר באמצעות טבעת ארומטית, עם אזור מרכזי היוועצות ספקטראליות. אלה styryl צבעי למחיצות הפיכה של ממברנות, לא 'משתנים' בין קרום פליירים, וכך גם אף פעם לא להכניס ציטוזול, ויש הרבה יותר פלורסנט בתוך ממברנות יותר מים5. הכניסה הפיך לתוך ליפידית גורמת עלייה 40-fold קרינה פלואורסצנטית6. ב הסינפסות עצביים, ניסויים תיוג לצבוע FM קלאסי מורכב רחצה ההכנה סינפטית עם לצבוע במהלך depolarizing גירוי לטעון לצבוע באמצעות SV אנדוציטוזה. צבע חיצוני ואז נשטף הרחק, מחזור SV נעצר בפתרון צלצול נטולת סידן לשיקוף הסינפסות טעון7. סיבוב שני של גירוי באמבט ללא צבע מעורר שחרור FM דרך אקסוציטוזה, תהליך זה יכול להיות מלווה מדידה הירידה עוצמת קרינה פלואורסצנטית. אוכלוסיות SV מן שלפוחית יחיד אל בריכות המכיל מאות שלפוחית יכול להיות מנוטרים באופן כמותי6,7. צבעי FM שימשו לנתח תלויי-פעילות גיוס של בריכות SV נפרדים פונקציונלית, והשווה נשיקה-וברח לעומת CME רכיבה8,9. השיטה שונתה כדי בנפרד assay עורר, ספונטנית, זעיר סינפטית מחזור פעילות (עם ציוד רגישה מאוד לזהות שינויים קטנים מאוד פלורסצנטיות ולהפחית את photobleaching)10. מבחני ניתן להרחיב את רמת ultrastructural על ידי photoconverting האות FM פלורסנט לתוך תווית צפיפות אלקטרונים עבור שידור מיקרוסקופ אלקטרונים11,12,13,14 .

מבחינה היסטורית, רחצה ההכנות סינפטית בריכוז גבוה של אשלגן (ןלהל "גבוהה [K+]") הייתה השיטה של בחירה עבור depolarizing גירוי לזירוז SV רכיבה על אופניים; החל הצפרדע שימוש NMJ5, מחונן המוח מכרסמים נוירונים בהיפוקמפוס15, דרוזופילה glutamatergic NMJ דגם16,17 הגישה [K+] גבוהה זו היא פשוטה, דורש אין ציוד מיוחד, ולא נגיש ולכן רוב מעבדות, אבל יש מגבלות עבור היישום והן פרשנות הנתונים. שיטה המתאימה יותר מבחינה פיזיולוגית היא להשתמש אלקטרודה היניקה גירוי חשמלי של עצב4,5,12. גישה זו נוהג פוטנציאל הפעולה הפצת לגירוי ישיר של העצב presynaptic מסוף, ואת התוצאות ניתן להשוות ישירות אל מבחני אלקטרופיזיולוגיות עצבית פונקציה13,14, 15, אבל דורש ציוד מיוחד, היא טכנית הרבה יותר מאתגר. עם כניסתו של optogenetics, השימוש של גירויים עצביים channelrhodopsin יש יתרונות נוספים, כולל שליטה הדוקה ייתכן ערוץ ביטוי באמצעות מערכת Gal4/UAS בינארי20. גישה זו טכנית הרבה יותר קל מאשר שאיבה אלקטרודה לגירוי ואינו דורש לא יותר מאשר מקור אור LED זול מאוד. כאן, אנו מעסיקים הדמיה של FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) לעשות הן השוואות אלה שלוש שיטות שונות גירוי- דרוזופילה NMJ: high פשוטים [K+ ], מאתגר גישות channelrhodopsin חשמל וחדשים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זחל דבק לנתיחה

  1. ביסודיות מערבבים 10 חלקים elastomer סיליקון הבסיס עם חלק 1 של סיליקון elastomer אשפרה הסוכן הערכה אלסטומר (טבלה של חומרים).
  2. מעיל coverslips זכוכית דקה 22 x 22 מ מ עם elastomer, התרופה על פלטה חמה ב- 75 הלעפה תרוטרפמט למשך מספר שעות (עד כבר לא דביק למגע).
  3. הצב coverslip זכוכית מצופים elastomer יחיד של החדרה plexi מחוייט זכוכית לנתיחה (איור 1, התחתון) לקראת הקרע זחל.
  4. הכינו את פיפטות דבק של נימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות פולר microelectrode סטנדרטיים כדי להשיג את להתחדד הרצוי ואת עצה גודל.
  5. בעדינות לשבור את הטיפ micropipette, וכניסה אל הקצה האחר, לצרף 2 מטרים של צינור פלסטיק גמיש (1/32" קוטר פנים, מזהה; 3/32" מחוץ קוטר, OD; 1/32" קיר; טבלה של חומרים) עם הפה הולם (P2 פיפטה tip).
  6. למלא מיכל קטן (0.6 מ"ל גלאים הצינורית) עם נפח קטן (µL ~ 20) של דבק (טבלה של חומרים) לקראת הקרע זחל.
  7. למלא את החדר עם תמיסת מלח (במ מ): 128 NaCl, 2 אשלגן כלורי, 4 MgCl2, 1 CaCl2, סוכרוז 70 ו חומצה 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic (HEPES) pH 7.2.
  8. הוספת נוגדן peroxidase (HRP) נגד חזרת מצומדת כדי אלקסה עבור חיל הים 647 (anti-HRP:647; 1:10 שתדללו מניה 1 מ"ג/מ"ל) עבור תיוג NMJ את טרמינל presynaptic במהלך ניתוח21,22.
  9. שימוש במכחול בסדר (גודל 2), להסיר לחלל השלישי נודד של המבחנה מזון ומניחים על גבי הזכוכית מצופה elastomer כיסוי.
  10. למלא את הטיפ micropipette זכוכית עם נפח קטן של דבק באמצעות לחץ אוויר שלילי שנוצר על ידי הפה עם קובץ מצורף (שלב 1.5).
  11. מיקום זחל בצידו הגבי למעלה עם מלקחיים דבק לראש coverslip מצופים elastomer עם קטן טיפת דבק באמצעות לחץ אוויר חיובי על ידי הפה.
  12. חזור על הליך זה בקצה האחורי של הזחל, מוודא כי החיה נמתחת מתוח בין הקבצים המצורפים דבק שני.
  13. בעזרת מספריים (להבים 3 מ מ; טבלה של חומרים), עושים חתך אופקי (~ 1 מ מ) את ישבנה ואת חתך אנכי לאורך הקו האמצעי הגבי.
  14. בעזרת מלקחיים בסדר (מס ' 5, טבלה של חומרים), בעדינות להסיר את קנה הנשימה הגבי, הבטן, הגוף השמן ובאיברים פנימיים אחרים המכסים את מערכת השרירים.
  15. חזור על הפעולות הדבקה לכנפיים לגוף החומה 4, מוודא למתוח בעדינות את הקיר הגוף אופקית ואנכית.
  16. להרים את חוט עצבי הגחון (VNC) באמצעות מלקחיים, לחתוך בזהירות את העצבים המוטוריים עם המספריים ולאחר מכן להסיר לחלוטין את VNC.
  17. החלף את תמיסת המלח לנתיחה Ca2 +-חינם תמיסת מלח (כמו מלוחים לנתיחה לעיל מבלי CaCl2) להפסיק SV רכיבה על אופניים.

2. אפשרות 1: גבוהה [K+] צבע FM טעינה

  1. מפתרון FM1-43 מניות (4 מ מ), להוסיף 1 µL 1 מ"ל של 90 מ מ פתרון אשלגן כלורי (גבוהה [K+] בתוך הקרע תמיסת מלח) ריכוז סופי של 4 מיקרומטר.
  2. באמצעות פיפטה של, להחליף את Ca2 +-תמיסת מלח חינם בבית הבליעה הדמיה עם הפתרון צבע [K+] FM גבוהה לעורר SV אנדוציטוזה לצבוע ספיגת.
  3. מיד להתחיל טיימר דיגיטלי משך זמן שנקבע מראש הגבוה [K+] depolarizing גירוי תקופה (למשל., 5 דקות; איור 2).
  4. כדי לוודא הכנה זחל בריא, שימו לב את התכווצויות חזקות של מערכת השרירים למשך כל תקופת דפולריזציה גבוהה [K+].
  5. כאשר מסתיימת תקופת שעון עצר, להסיר הפתרון צבע [K+] FM גבוהה ובמהירות להחליף2 +Ca-תמיסת מלח חינם להפסיק SV רכיבה על אופניים.
  6. תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הפתרון צבע גבוהה [K+] FM מוסר לחלוטין.
  7. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.

3. הדמיה: מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם 40 X המטרה טבילה במים כדי התמונה NMJ לצבוע קרינה פלואורסצנטית (מיקרוסקופים אחרים ניתן להשתמש).
  2. התמונה שריר NMJ 4 מקטעי בטן 2-4 (NMJs אחרים יכולים לדימות) לאסוף תמונות בעזרת תוכנה מתאימה (טבלה של חומרים).
  3. השתמש הנה 633 ננומטר לייזר כדי לעורר HRP:647 (עם מסנן לעבור זמן > 635 nm), של ארגון 488 ננומטר לייזר כדי לרגש FM1-43 (עם bandpass מסנן 530-600 ננומטר).
  4. מבצעית לקבוע רווח אופטימלי וההיסט עבור שני ערוצים.
    הערה: הגדרות אלה יישארו קבועים במהלך המשך הניסוי.
  5. לקחת את Z-ערימה קונאפוקלית דרך כל NMJ שנבחרו מן הפסגה המסומן HRP לחלק התחתון של הטרמינל סינפטית.
  6. שימו לב זהירה NMJ עם תמונה (קטע, לצד ושרירים) כדי להבטיח עודף NMJ באותו המדויק לאחר FM לצבוע פריקה.

4. גבוהה [K+] גירוי: FM דיי פריקה

  1. להחליף Ca2 +-תמיסת מלח חינם עם תמיסת המלח [K+] גבוהה (ללא צבען FM1-43) כדי נסיעה דפולריזציה, שחרור אקסוציטוזה וצבע SV.
  2. מיד להתחיל טיימר דיגיטלי עבור משך תקופת גירוי גבוה [K+] שנקבע מראש (למשל., 2 דקות; איור 2).
  3. כאשר מסתיימת תקופת שעון עצר, מיד להסיר את תמיסת המלח [K+] גבוהה ולהחליף עם Ca2 +-תמיסת מלח חינם להפסיק SV רכיבה על אופניים.
  4. תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח תמיסת המלח גבוהה [K+] מוסר לחלוטין.
  5. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
  6. להיות בטוח תמונה של זריחה לצבוע FM1-43 ב NMJ זהה שצוין לעיל באמצעות אותן הגדרות קונפוקלי

5. אפשרות 2: גירוי חשמלי FM לצבוע טעינה

  1. הכן על פיפטה יניקה באמצעות את פולר microelectrode (טבלה של חומרים) כדי להשיג את להתחדד נדרש ואת עצה גודל.
  2. אש-פולין הטיפ microelectrode עם מיקרו-פורג עד עצבים מוטוריים יחיד יכול להישאב עם צפוף.
  3. תחליק פיפטה יניקה על המחזיק אלקטרודה micromanipulator, לצרף את צינור פלסטיק גמיש ארוך ומזרק.
  4. הגדרת פרמטרים ממריץ (למשל., 15 V, תדירות 20 Hz, משך 20 ms, זמן של 5 דקות (איור 2) או 1 דקות (איור 3)).
  5. להחליף את Ca2 +-תמיסת מלח חינם על הכנת זחל עם מעל תמיסת FM1-43 (4 מיקרומטר; CaCl 1 מ2) על האסדה אלקטרופיזיולוגיה.
  6. לשים ההכנה על הבמה מיקרוסקופ ולגדל את הבמה עד זחל של פיפטה היניקה בפוקוס (40 X טבילה במי המטרה).
  7. להתחנף לולאה של חתוך עצבים מוטוריים innervating את hemisegment שנבחר עם לחץ אוויר שליליים שנוצרו על-ידי המזרק אל האלקטרודה היניקה.
  8. מבחן הפונקציה אלקטרודה יניקה עם פרץ קצר של גירוי תוך פיקוח באופן חזותי להתכווצות השריר ב hemisegment שנבחר.
  9. לעורר את עצבים מוטוריים באמצעות הפרמטרים שנבחרו (שלב 5.4) לנהוג SV אנדוציטוזה ואת ספיגת לצבוע FM1-43 (איור 2).
  10. תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הפתרון לצבוע FM1-43 מוסר לחלוטין.
  11. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית באמצעות פרוטוקול הדמיה קונאפוקלית מלמעלה.
  12. שימו לב זהירה NMJ עם תמונה (קטע, צד, שרירים) כדי להבטיח גישה NMJ באותו המדויק לאחר פריקת לצבוע FM.

6. גירוי חשמלי: FM דיי פריקה

  1. להחליף את Ca2 +-חינם תמיסת מלח עם תמיסת מלח רגיל (ללא צבען FM1-43) ומניחים ההכנה חזרה לבמה לבוש אלקטרופיזיולוגיה.
  2. קבע את הפרמטרים ממריץ לפריקת (למשל, 15 V, 20 Hz התדר, 20 ms משך זמן של 2 דקות (איור 2) או 20 s (איור 3)).
  3. למצוץ את עצבים מוטוריים אותו לתוך האלקטרודה אותה כמתואר לעיל ולאחר מכן לעורר להפעלת SV אקסוציטוזה ושחרור לצבוע FM1-43.
  4. תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הצבע החיצוני יוסר לחלוטין.
  5. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
  6. להבטיח תמונה של זריחה לצבוע FM1-43 ב NMJ זהה שצוין לעיל באמצעות אותן הגדרות קונפוקלי.

7. אפשרות 3: Channelrhodopsin גירוי FM לצבוע טעינה

  1. העלאת לבטא ChR2 הזחלים על מזון המכיל את ChR2 גורם משותף כל טרנס רשתית (אתנול מומס ב; 100 מיקרומטר הריכוז הסופי).
  2. מקום הכנת זחל תא פלקסיגלס על הבמה מיקרוסקופ לנתיחה מצויד עם יציאת המצלמה.
  3. לצרף LED כחול (470 ננומטר; טבלה של חומרים) ממריץ לתכנות באמצעות כבל קואקסיאלי, למקם את ה-LED יציאת המצלמה.
  4. ממקדים את הקרן אור LED כחול על גבי הפונקציה זחל ביתור שימוש בפונקציה זום מיקרוסקופים.
  5. להחליף את Ca2 +-תמיסת מלח חינם על הכנת זחל עם מעל תמיסת מלח FM1-43 (4 מיקרומטר; CaCl 1 מ2) על הבמה optogenetic.
  6. להגדיר את הפרמטרים LED באמצעות ממריץ את (למשל, 15 V, תדירות, משך 20 ms וזמן של 5 דקות (איור 2) 20 הרץ).
  7. להתחיל את גירוי האור ולעקוב עם שעון עצר עבור משך הזמן שנקבע מראש של תקופת גירוי optogenetic (למשל, 5 דקות; איור 2).
  8. כאשר הטיימר מפסיק, במהירות להסיר הפתרון לצבוע FM ולהחליף עם Ca2 +-תמיסת מלח חינם כדי לעצור את ה-SV רכיבה על אופניים.
  9. תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הפתרון לצבוע FM מוסר לחלוטין.
  10. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות פרוטוקול הדמיה מלמעלה.
  11. שימו לב זהירה NMJ עם תמונה (קטע, צד, שרירים) כדי להבטיח גישה NMJ באותו המדויק לאחר פריקת לצבוע FM.

8. Channelrhodopsin גירוי: FM דיי פריקה

  1. להחליף Ca2 +-תמיסת מלח חינם עם תמיסת מלח רגיל (ללא צבען FM1-43) על הבמה מיקרוסקופ הקרע עם יציאת המצלמה LED התמקדו הזחל.
  2. להגדיר את הפרמטרים ממריץ עבור פריקה (למשל, 15 V, תדירות, משך 20 ms וזמן של 2 דקות (איור 2) 20 הרץ).
  3. להתחיל את גירוי האור ולעקוב עם שעון עצר עבור משך תקופת גירוי optogenetic שנקבע מראש (למשל, 2 דקות; איור 2).
  4. כאשר מסתיימת תקופת שעון עצר, במהירות להסיר הפתרון לצבוע FM ולהחליף עם Ca2 +-תמיסת מלח חינם כדי לעצור את ה-SV רכיבה על אופניים.
  5. תשטוף ברצף מהיר עם Ca2 +-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הצבע החיצוני יוסר לחלוטין.
  6. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים2 +-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
  7. להבטיח תמונה של זריחה לצבוע FM1-43 ב NMJ זהה שצוין לעיל באמצעות אותן הגדרות קונפוקלי.

9. זריחה כמת

  1. טען את התמונה ב- J תמונה (NIH קוד פתוח), ליצור הקרנה העוצמה המקסימלית על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | פרויקט Z.
  2. באמצעות מלחמה-ערוץ HRP:647, עבור אל התמונה | התאם | סף והחלק סרגל הכלים העליון עד רק NMJ מודגשת.
  3. באמצעות הכלי מטה, לחץ על NMJ. אם NMJ מקוטע, לחיצה ארוכה על לחצן מקש shift לחוץ ובחר כל החלקים.
  4. לשנות את התמונה לערוץ צבע FM1-43 וללכת על נתח | למדוד כדי לקבל מדידת קרינה פלואורסצנטית.
  5. חזור על צעדים 9.1-9.4 עבור התמונה "לפרוק" NMJ אותו (קטע מזוהה, לצד ושרירים).
  6. כדי לקבל את אחוז צבע זה היה לפרוק, לקחת את היחס בין עוצמות קרינה פלואורסצנטית שהמכולה/לטעון.
    הערה: הליך זה יכול להיות שונה כדי לנתח זריחה על בסיס בוטון-לכל-בוטון באמצעות כלי הבחירה "אליפסה" או "חופשי" או. ניתן להפחית קרינה פלואורסצנטית רקע באמצעות דגימת קרינה פלואורסצנטית את השריר. ניתן להוסיף סוכני גם כדי להפחית את הרקע הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג את זרימת העבודה עבור פעילות תלוית FM לצבוע הדמיה פרוטוקול. הניסוי מתחיל תמיד עם הקרע דבק זחל זהה, ללא קשר גירוי לשיטת לאחר מכן. איור 1a הוא תיאור סכמטי של זחל גזור, מציג את חוט עצבי הגחון (VNC), מקרין העצבים ותבנית שריר hemisegmental חוזרות ונשנות. VNC יוסר ושטף את ההכנה בפתרון 4 מיקרומטר של FM1-43 (איור 1b, ורוד). הכנת ואז מגורה בנוכחות FM לצבוע באמצעות אחד שלוש אופציות אפשריות לטעון לצב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גירוי גבוה [K+] מלוחים depolarizing הוא והכי מתוך שלושת האפשרויות עבור צבע FM תלויי-פעילות רכיבה על אופניים, אבל סביר להניח פיזיולוגיים לפחות29. שיטה פשוטה זו depolarizes כל תא נגיש החיה כולו, אז אינו מאפשר לימודים מכוונת. ייתכן ניתן להחיל באופן מקומי גבוה תמיסת מלח [K+] עם micropipette, אבל זה עדיין depolarize תאים טרום/postsynaptic וסביר סינפסה-הקשורים עכשיו, דונלד1. חשש מרכזי נוסף הוא זה גבוה [K+] דפולריזציה כוננים מהירה היווצרות endosome...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים Broadie מעבדה חברים לתרומות למאמר זה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01s MH096832 ו- MH084989 כדי. תן לי לראות, ואחווה NIH predoctoral F31 MH111144 כדי D.L.K.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת אלסטומר סיליקון SylGard 184Fisher ScientificNC9644388לשים זכוכית כיסוי לנתיחות
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ 22x22-1Fisherbrand12-542-Bלשים את SylGard לנתיחות
פלטה חמה עליונה מאלומיניום סוג 2200ThermolyneHPA2235Mלריפוי
תא חיתוך זכוכית SylGard PlexiN/A N/Aבעבודת יד
נימי זכוכית בורוסיליקטWPI1B100F-4להכנת מיקרופיפטות יניקה והדבקה
סאטר מושך מיקרופיפטה מבוסס לייזרP-2000להכנת מיקרופיפטות יניקה והדבקה
Tygon E-3603 Laboratory TubingComponent Supply Co.TET-031Aלפיפטה פה ויניקה
P2 קצה פיפטהארה"ב סיינטיפיק1111-3700לפיפטה
0.6 מ"ל מכסה צינור אפנדורףפישר סיינטיפיק05-408-120משמש להכנסת דבק לדיסקציה
Vetbond 3MWPIvetbondדבק המשמש לנתיחות
אשלגן כלוריפישר סיינטיפיקP-217פורסלין
נתרן כלוריMillipore SigmaS5886למי מלח
מגנזיום כלורידפישר מדעיM35-500למי מלח
סידן כלוריד דיהידראטMillipore SigmaC7902למי מלח
סוכרוז פישר מדעיS5-3למי מלח
HEPESMillipore SigmaH3375למי מלח
HRP: Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch123-605-021לתיוג ממברנות עצביות
PaintbrushWinsor & ניוטון94376864793לתפעל את הזחלים
פינצטה דומונט דומוסטאר #5WPI500233משמש במהלך דיסקציה
7 ס"מ מספריים מיקרו מקפרסון-ואנאס (להבים 3 מ"מ)WPI14177משמש במהלך דיסקציה 
FM1-43פישר סיינטיפיקT35356צבע סטיריל פלואורסצנטי
טיימר דיגיטליVWR62344-641לתזמון טעינה/פריקה של צבע FM 
LSM 510 META מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזרZeissלהדמיית הסמנים הפלואורסצנטיים
Zen 2009 SP2 גרסה 6.0Zeissתוכנה להדמיה על
לייזר קונפוקלי HeNe 633nmLasosלעורר HRP:647 במהלך הדמיה
לייזר ארגון 488nmLasosלעורר את צבע ה-FM במהלך הדמיה
Micro-ForgeWPIMF200כדי לירות מיקרופיפטות זכוכית פולניות
20 מ"ל קצה החלקה של מזרקBD301625לשאוב את האקסון לגירוי חשמלי.
מיקרו מניפולטור (בסיס מגנטי)NarishigeMMN-9לשליטה באלקטרודת היניקה לגירוי חשמלי
ממריץדשא S48לשליטה ב-LED ובגירוי חשמלי
Zeiss Axioskop מיקרוסקופZeissמשמש במהלך גירוי חשמלי.
40X Achroplan טבילה במים ObjectiveZeissמשמש במהלך גירוי חשמלי והדמיה קונפוקלית
All-trans RetinalMillipore SigmaR2500קו-פקטור חיוני עבור ChR2
Zeiss Stemi מיקרוסקופ עם יציאת מצלמהZeiss2000-Cמשמש במהלך גירוי ערוץ רודופסין
LED 470nmThorLabsM470L2משמש להפעלת ChR
דרייבר LED של T-CubeThorLabsLEDD1Bכדי לשלוט בספק
הכוח LED LEDCincon Electronics Co.TR15RA150להפעלת
מד הכוח והאנרגיה האופטיThorLabsPM100Dלמדידת עוצמת LED
מכשיר פה LED

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790(2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133(2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135(2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DrosophilaFM1 43FM1 43

מאמרים קשורים