מאמר שיטה

Co-immunoprecipitation Assay באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני מתאי תרבותי בתנאים ובשפתיים

DOI:

10.3791/57836

⸱

2 באוגוסט 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר פרוטוקול co-immunoprecipitation ללמוד אינטראקציות חלבון בין חלבונים גרעיניים אנדוגני בתנאים ובשפתיים. שיטה זו מתאימה הפגנה של אינטראקציות בין גורמי שעתוק גנים ברמת השעתוק הרגולטורים שותף ב היפוקסיה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רמות חמצן נמוכות (היפוקסיה) לעורר מגוון תגובות מסתגלת עם הגורם היפוקסיה-inducible 1 (HIF-1) מורכבים מתנהג כמו הרגולטור הראשי. HIF-1 כוללת יחידת משנה α מוסדר חמצן heterodimeric (HIF-1α) והביע צורונים β יחידה משנית (HIF-1β) הידוע גם בשם aryl פחמימן קולטן הגרעין translocator (ARNT), ויסות גנים המעורבים בתהליכים מגוונים כולל אנגיוגנזה , אריתרופויזה, גליקוליזה. זיהוי חלבונים שמעצבת HIF-1 היא המפתח להבנת היפוקסיה איתות. מלבד ויסות HIF-1α יציבות, היפוקסיה מפעיל גם רוברטסונית הגרעין של גורמי שעתוק רבים כולל HIF-1α ו- ARNT. ראוי לציין, מרבית השיטות הנוכחיות המשמשות ללימוד כזה אינטראקציות חלבון-חלבון (להדברה) מבוססים על מערכות שבו רמות החלבון גדלו באופן מלאכותי באמצעות ביטוי חלבון. ביטוי חלבון לעיתים קרובות מובילה לתוצאות-פיזיולוגיים הנובעים חפצים הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית. כאן נתאר co-immunoprecipitation שונה של פרוטוקול בעקבות טיפול היפוקסיה באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני, וכהוכחה של המושג, כדי להציג את האינטראקציה בין HIF-1α ARNT. פרוטוקול זה, התאים ובשפתיים נבצרו בתנאים שתקבעו, מאגר שטיפת מלוחים Phosphate-Buffered (DPBS) של Dulbecco היה גם מראש equilibrated לתנאים ובשפתיים לפני השימוש כדי להמתיק חלבון השפלה או החלבונים דיסוציאציה במהלך reoxygenation. בנוסף, שברים גרעיני חולצו לאחר מכן להתרכז, ייצוב חלבונים גרעיניים אנדוגני, להימנע מתוצאות כדין ניתן לראות לעיתים קרובות במהלך ביטוי חלבון. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להדגים אנדוגני, יליד האינטראקציות בין גורמי שעתוק, תעתיק שיתוף הרגולטורים בתנאים ובשפתיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היפוקסיה מתרחשת כאשר חמצן לקוי מסופקים של תאים ורקמות של הגוף. זה ממלא תפקיד קריטי תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים כגון התמיינות תאי גזע, דלקת סרטן1,2. היפוקסיה-inducible גורמים (לשתול) לפעול heterodimers מורכב של יחידת משנה של α מוסדר חמצן של יחידת משנה של β צורונים ביטוי ידוע גם ARNT3. שלושה איזופורמים של subunits HIF-α (HIF-1α, HIF-2α ו- HIF-3α), שלושה subunits HIF-β (ARNT/HIF-1β, ARNT2 ו- ARNT3) זוהו עד כה. HIF-1α ו- ARNT ubiquitously מבוטאים, ואילו HIF-2α, HIF-3α, ARNT2, ARNT3 שיש יותר מוגבלת דפוסי ביטוי4. החלבונים HIF-1 הוא המתקן מפתח של התגובה היפוקסיה. בתנאים שתקבעו, HIF-1α הופך התייצב, ואז translocates את הגרעין, dimerizes עם ARNT5. לאחר מכן, מתחם זה נקשר נוקלאוטידים ספציפיים המכונה רכיבי מגיב היפוקסיה (HREs), מסדיר את הביטוי של היעד גנים המעורבים בתהליכים מגוונים כולל אנגיוגנזה, אריתרופויזה, גליקוליזה6. בנוסף תגובה זו "קנונית", מסלול איתות היפוקסיה ידוע גם crosstalk עם תגובת תאי מרובים איתות משעולים כגון חריץ גרעיני גורם-kappa B (NF-κB)7,8,9.

זיהוי חלבונים שמעצבת את הרומן HIF-1 חשוב להבין טוב יותר היפוקסיה איתות. בניגוד ARNT, אשר הוא רגישות רמות החמצן צורונים ביטוי, רמות חלבון HIF-1α מוסדרים בחוזקה על ידי רמות החמצן הסלולר. Normoxia (21% חמצן), חלבונים HIF-1α הם מפורק במהירות10,11. מחצית החיים הקצר של HIF-1α-normoxia מציג אתגרים טכניים ספציפיים עבור זיהוי החלבון מן התא תמציות, כמו גם לצורך זיהוי חלבונים HIF-1α-אינטראקציה. יתר על כן, מספר גורמי שעתוק, כולל אלה של המתחם HIF-1 translocate לתוך הגרעין תחת תנאים ובשפתיים12,13,14. רוב השיטות הנוכחי המשמש ללימודי PPI מבוצעות באמצעות ביטוי-פיזיולוגיים של חלבונים. ביטוי חלבון כזה דווח כדי לגרום למומים הסלולר שונים באמצעות מנגנונים מרובים כולל עומס יתר של משאבים, חוסר איזון stoichiometric, אינטראקציות מופקרת של מסלול אפנון15,16. מבחינת לימודי PPI, ביטוי חלבון יכול להוביל שלילי חיובי, או אפילו שקר שקר, תוצאות בהתאם החלבון המאפיינים והפונקציות של חלבונים overexpressed. לכן, השיטות ללימודי PPI חייב להיות שונה על מנת לחשוף את להדברה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתנאים ובשפתיים. בעבר הראו את האינטראקציה בין HIF-1 גורם שעתוק משפחה של Ets GA מחייב חלבון (GABP) בתאי P19 מחוסר חמצן, אשר תורמת התגובה של האמרגן Hes1 היפוקסיה17. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול co-immunoprecipitation ללמוד להדברה בין חלבונים גרעיניים אנדוגני בתנאים ובשפתיים. האינטראקציה בין HIF-1α ו- ARNT מוצג בתור הוכחה של המושג. פרוטוקול זה מתאים הממחיש את האינטראקציות בין גורמי שעתוק גנים ברמת השעתוק הרגולטורים לעבודה בתנאים שתקבעו, לרבות אך לא רק לזיהוי של חלבונים שמעצבת HIF-1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סעיף זה פרוטוקול, אשר משתמשת כליה אנושית עובריים 293A תא (HEK293A), s מנחים את ועדת האתיקה האנושית מחקר בסינגפור, אוניברסיטת הטכנולוגי Nanyang.

1. אינדוקציה של היפוקסיה בתאים HEK293A

  1. הכינו ארבע מנות 10 ס מ ואת הזרע 3-5 x 10 תאים6 HEK293A לכל מנה ב- 10 מ"ל של Dulbecco שונה בינוני של הנשר (DMEM, גלוקוז 4.5 g/L) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מגלוטמין, 110 מ ג/ליטר נתרן פירובט, 100 פניצילין U/mL, 100 מ ג / mL סטרפטומיצין. התרבות התאים 37 ° C, 5% CO2 מיכלים.
    הערה: תא זריעה צריכה להתבצע ב בטיחות ביולוגית cabinet (BSC). המשטחים של כל החומרים להציב BSC שאמור להימחק עם 70% אתנול.
  2. 24 שעות לאחר זריעה, כאשר התאים הגיעו 80-90% confluency, להכניס שתי מנות היפוקסיה subchamber בתא הכפפות חממה (ראה טבלה של חומרים) עם 1% או2 ו- 5% CO2 -37 מעלות צלזיוס, והשאר השניים האחרים מנות ב- normoxia (21% O 2, 5% CO2 ב 37 ° C) במשך 4 h להשתמש ערכה אחת של normoxic ותאים ובשפתיים להעריך את הטיפול היפוקסיה מאת תספיג ולנצל את הסט השני של תאים עבור הניסויים co-immunoprecipitation.
    הערה: רמות החמצן ניתן להגדיר ב- 0 – 5%, וכן את משך הזמן של הטיפול היפוקסיה יכולים להיות מגוונים בהתאם לסוג התא וללמוד אובייקטיבי.

2. כל תא והפקת גרעינית

הערה: ראה טבלה 1 למידע על מאגרי בשימוש בפרוטוקול זה.

  1. לקצור תאי בקרה normoxia.
    1. להסיר את התקשורת התרבות על ידי השאיפה ולשטוף את התאים עם 10 מ"ל DPBS (PH 7.0-7.2) באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
      הערה: להימנע מלגעת חד שכבתי את התא עם פיפטה. במהלך הכביסה, pipette בעדינות את DPBS מטה לאורך הקיר של צלחת התרבות התא כדי למנוע איבוד תאים.
    2. פיפטה 5 מ"ל DPBS הקר המשקולת לשפשף את התאים מעל פני השטח של הצלחת ב- PBS קר כקרח עם המגרד התא.
    3. להעביר את המתלים תא לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל ולשמור על קרח.
  2. לקצור את התאים תרבותי בתנאים ובשפתיים.
    1. Equilibrate את DPBS לתנאים ובשפתיים מראש על-ידי הצבת חשפו 100 mL ניסוי ריאגנט בקבוק זכוכית מלאים DPBS ב subchamber היפוקסיה (1% או2 ו- 5% CO2 ב 37 ° C) במשך 24 שעות מראש.
    2. כ 1 h לפני הקטיף תאי היפוקסיה מטופלים, מקום מקרר המכיל קרח לתוך התא עיבוד של בתא הכפפות, אשר יש כבר equilibrated 1% או2 , 5% CO2. להעביר את הבקבוק המכיל את DPBS שתקבעו מראש equilibrated מן subchamber היפוקסיה אל התא עיבוד ומניחים אותו על קרח.
    3. 4 שעות לאחר הטיפול היפוקסיה, להעביר את התאים היפוקסיה subchamber תא עיבוד כי כבר מראש equilibrated 1% או2 , 5% CO2.
    4. להסיר את התקשורת התרבות על ידי השאיפה ולשטוף את התאים ברגע עם 10 מ"ל כקרח DPBS שתקבעו מראש equilibrated עם 10 מ"ל פיפטה.
    5. הוסף 5 מ ל DPBS מראש equilibrated קר כקרח 5 מ ל פיפטה ועוקרות התאים על ידי גירוד עם המגרד התא.
    6. להטות את הצלחת תרבות תא ולאסוף את התאים מנותקים באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. להעביר התליה תא ב DPBS לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל ולשמור על קרח.
    7. פתח את הדלת. בין העיבוד ומאגר לאהלי בתא הכפפות, אשר שניהם כבר מראש equilibrated ל- 1% O2 ו- 5% CO2. העברת הצינורות חרוט 15 מ"ל על הקרח המכיל תאים היפוקסיה מטופלים מן החדר עיבוד לתא מאגר. לפתוח את הדלת של החדר מאגר, להסיר התאים לחלוטין בתא הכפפות.
  3. גלולה הן התאים normoxic מ 2.1 והן תאים ובשפתיים מן 2.2 על ידי צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
  4. להכין כל התא תמציות.
    1. Resuspend כדורי תא ב- 500 µL רדיו כקרח immunoprecipitation assay (ריפה) פירוק מאגר המכיל 50 מ"מ Trisaminomethane הידרוכלוריד (טריס-HCl) pH 8.0, 150 מ מ נתרן כלורי (NaCl), 1% tergitol-סוג NP-40 (NP-40), 0.5% נתרן deoxycholate, ו 0.1% dodecyl סולפט נתרן (מרחביות), בתוספת 1 x מעכב פרוטאז קוקטייל (ראה טבלה של חומרים) על ידי pipetting כדורי תא לאורך מספר פעמים.
    2. להעביר את lysates תא לתוך צינורות microcentrifuge החדש של 1.5 mL ולשמור בקירור למשך 30 דקות עם vortexing מדי פעם.
    3. Centrifuge את lysates תא ב x 13,000 g 10 דקות ב 4 º C.
    4. לאסוף את µL 50 supernatant, aliquot של תגובת שיקוע לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
  5. הכנת תמציות גרעינית באמצעות מיצוי הגרעין של קיט (ראה טבלה של חומרים).
    1. Resuspend בעדינות את כדורי תא µL 500 של פירוק מאגר NL בתוספת 1 x מעכב פרוטאז קוקטיילים ו- 0.1 M dithiothreitol (DTT) מאת pipetting כדורי תא לאורך מספר פעמים.
    2. להוסיף 25 µL של דטרגנט פתרון NP תא ההשעיה, מערבולת 10 s במהירות המרבית.
    3. צנטריפוגה ב 10,000 x g למשך 5 דקות ב 4 º C.
    4. לאסוף את תגובת את (תמציות cytoplasmic), שיקוע aliquot 50 µL של תגובת שיקוע לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
    5. Resuspend בגדר המכיל גרעינים תא ב- 500 µL פירוק מאגר NL בתוספת 1 x מעכב פרוטאז קוקטיילים ו- 0.1 M DTT על ידי vortexing על 5 s במהירות המרבית.
    6. צנטריפוגה ב x 10,000 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ולשמור בגדר גרעינית.
    7. Resuspend בגדר גרעינית ב- 50 µL של מיצוי מאגר NX1 בתוספת 1 x מעכב פרוטאז קוקטייל על-ידי pipetting בגדר לאורך מספר פעמים.
    8. תקופת דגירה של 30 דקות על קרח, vortexing 10 s כל 5 דקות במהירות המרבית.
    9. צנטריפוגה ב 12,000 x g 10 דקות ב 4 º C.
  6. Desalt תמציות גרעינית.
    1. לאסוף את תגובת שיקוע שלב 2.5.9 והעברת לתוך המכשירים דיאליזה מיני עם נפח מרבי של µL 100 לכל יחידה.
    2. קאפ המכשירים דיאליזה מיני ומניחים השטה.
    3. לשים את חגורת הצלה גביע המכיל 500 מ"ל של מאגר צוננת טרום דיאליזה (20 מ מ טריס-HCl pH 7.4, גליצרול 20%, 100 מ מ אשלגן כלורי (אשלגן), 0.2 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 0.2 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) ו- 0.5 מ מ DTT) תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 ° C עם ערבוב עדין.
      התראה: PMSF. הוא דבר מסוכן להימנע ממגע ישיר עם העור או באינהלציה.
    4. לאסוף הדגימות מן הפינה של המכשירים דיאליזה מיני ולהעביר לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL החדש.
    5. צנטריפוגה ב x 12,000 g 10 דקות ב 4 ° C, aliquot 25 µL של כל תגובת שיקוע לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.

3. הערכת הטיפול היפוקסיה על ידי זיהוי של ביטוי חלבון ו- Subcellular לוקליזציה של HIF-1α

  1. לקבוע את ריכוז חלבון כל התא או גרעיני/cytoplasmic תמציות באמצעות וזמינותו microplate של bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון assay ערכת לפי הוראות היצרן18.
  2. לדלל את lysates תא 1 מאגר מדגם x Laemmli, המכילה 5% מרקפטואתנול והרתיחו ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    התראה: אל תיגע השטח של בלוק חימום, שכן הוא עלול לגרום לכוויות.
  3. להפריד את החלבונים על-ידי נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד).
    1. לטעון כמויות שוות של חלבון (25 µg) כל טוב של ג'ל הדרגתיות מרחביות-דף טרומיים (4 – 20%), יחד עם 3 µL של דה מרקר משקל מולקולרי.
    2. להפעיל את הג'ל הפעלת מאגר המכיל 2.5 מ"מ טריס, גליצין 19.2 מ"מ, מרחביות 0.01%, PH8.3 במשך 30 דקות ב- 200 וולט.
  4. להעביר את החלבונים כדי מן הג'ל קרום ניטרוצלולוזה.
    1. להרכיב את הכריך העברה (נייר סינון-ג'ל-ממברנה-מסנן נייר) עם הג'ל על הצד אנודת ואת הקרום בצד קטודית בקלטת.
    2. מקם את הקלטת במיכל העברת מלא עם העברת מאגר המכיל trisaminomethane 2.5 מ מ (טריס), 19.2 מ"מ גליצין ו- 20% מתנול.
      התראה: מתנול הוא דליק ויש לאחסנו בתוך האחסון נוזל דליק בארון.
    3. לבצע את ההעברה עבור 1 h ב- 100 וולט החדר הקרה.
  5. לחסום את האבן החשופה במאגר חסימה 10 מ"ל המכיל 50 מ"מ טריס-קלרנית (pH 7.6), 150 מ מ NaCl, 0.1 Tween 20 ו- 5% שומן חלב לשעה בטמפרטורת החדר על מטרף.
  6. דגירה את האבן החשופה עם נוגדן anti-HIF-1α (1/500 דילול) במאגר חסימה באותו לילה ב 4 º C.
  7. לשטוף את האבן החשופה 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם 50 מל TBS-טי
  8. דגירה את האבן החשופה עם חזרת peroxidase (HRP)-נוגדנים משניים מצומדת (1/1000 דילול) ב- 10 מ"ל TBS-T המכילה 5% שומן חלב יבש לשעה בטמפרטורת החדר.
  9. לשטוף את האבן החשופה 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם 50 מל TBS-טי
  10. מיקס 500 µL כל של chemilumescent משופרת (ECL) ריאגנט A ו- B צינור microcentrifuge 1.5 mL ו מערבולת בקצרה.
  11. להחיל את המצע ECL האבן החשופה, תקופת דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. ללכוד את אותות chemiluminescent באמצעות של תשלום מצמידים מכשיר (CCD) מערכת הדמיה מבוסס מצלמה.
    1. ניקוז עודפי ECL המצע על ידי לגעת בקצה של הקרום עם נייר טישו ולמקם את הקרום מגן גיליון.
    2. במקום הקרום על המגש דגימה של ה-CCD מצלמה המבוסס על מערכת הדמיה.
    3. השקת תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים) ללכוד התמונות עם ההגדרות הבאות: קובץ ← החדש פרוטוקול → ערוץ אחד ← ההתקנה הפרוטוקול ← ג'ל הדמיה (יישום: חמי; איזור הדמיה: ביו-ראד מוכן ג'ל; הדמיה חשיפה: התוכנה יהיה באופן אוטומטי לייעל את זמן החשיפה ללהקות אינטנסיבי) ← בניהול הפרוטוקול
      הערה: זמן החשיפה ניתן להגדיר באופן ידני כדי להשיג את התמונות אופטימלית.

4. Immunoprecipitation וזיהוי של החלבונים Immunoprecipitated

  1. 50 µL של חלבון A/G sepharose חרוזים ב µL 500 TBS מאגר 1.5 mL microcentrifuge צינורות וקונטה הצניפה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g למשך 2 דקות ב 4 º C.
  2. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את החרוזים ב 100 µL מאגר TBS.
  3. להוסיף 2 µL של נוגדן monoclonal anti-ARNT העכבר (1.4 מ"ג/מ"ל) או עכבר אימונוגלובולין G (IgG) (1.4 מ"ג/מ"ל) זה הוכן על ידי לשחזר מ"ג 0.7 העכבר IgG במאגר TBS 500 µL.
  4. מקם הצינורות microcentrifuge 1.5 mL המכיל את החרוזים ב rotator שפופרת ולאחר תקופת דגירה של 2 h ב- rpm 10 בחדר הקר.
    הערה: להתמודד עם הצינורות בעדינות ולשמור את המתלים המכיל את החרוזים בחלק התחתון של הצינור.
  5. גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g למשך 2 דקות ב 4 ° C וזורקים את supernatants.
  6. לדלל µg 200 של גרעיני החלבון lysate ב שלב 2.6.5 ב 800 µL של המאגר IP בהיקף של 50 מ מ טריס-HCl (pH 7.4), 180 מ"מ NaCl, 20% גליצרול, מעכבי פרוטאז NP-40 ו- 1 x 0.2% קוקטייל. דגירה של lysate עם החרוזים מצמידים נוגדן שהושג בשלב 4.5 בן לילה ב 4 º C.
  7. גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g למשך 2 דקות ב 4 ° C, למחוק את supernatants ולשטוף את החרוזים 3 פעמים עם 1 מ"ל TBS כקרח המכיל 0.2% NP-40.
  8. מרתיחים את החרוזים מאגר מדגם Laemmli µL 50-95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  9. Centrifuge את החרוזים ב x 10,000 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, לאסוף את תגובת שיקוע, ולמחוק את החרוזים.
    הערה: תגובת שיקוע שניתן לאחסן ב 4 ° C לטווח הקצר או-20 ° C לטווח ארוך.
  10. לזהות הנוכחות של HIF-1α מ מתחמי חלבון immunoprecipitated על ידי תספיג כאמור שמתואר בשלב 3.3 ואילך.
    הערה: חלבון כימות אין צורך בשלב זה. לטעון בפול ווליום (50 µL) של תגובת שיקוע של כל מדגם לתוך כל טוב של ג'לים הדרגתיות מרחביות-דף טרומיים (4 – 20%)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להעריך את התגובה התאית היפוקסיה, הביטוי נבדקו רמות ולוקליזציה subcellular של רכיבי HIF-1 מתחם הבאים היפוקסיה הטיפול. HEK293A תאים בתרבית בתנאים ובשפתיים במשך 4 שעות או שמרו ב normoxia כפקדים. רמות חלבון HIF-1α ו- ARNT נבחנו בתא כל או תמציות גרעיני/cytoplasmic מאת תספיג חלבון. כמו הצפוי, הכולל רמות HIF-1α היו upregulated על ידי היפוקסיה, ואילו רמות ARNT סה כ lysates הסלולר לא היו באופן משמעותי שינו (איור 1 א'). בנוסף, היפוקסיה המושרה גרעיני הצטברות HIF-1α ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתחם HIF-1 הוא מווסת הבסיס של חמצן הסלולר הומאוסטזיס ומסדיר שפע של גנים המעורבים שונים התגובות היפוקסיה מסתגלת הסלולר. זיהוי של הרומן HIF-1 שמעצבת חלבונים חשוב להבנה של אותות ובשפתיים. Co-immunoprecipitation ניסויים משמשים בדרך כלל ללימודי להדברה להתוות מסלולים התמרה חושית אות סלולרי. עם זאת, ביטוי חלבון עדיין נפוצה, זה עשוי להוביל חפצים ניסיוני. בנוסף, HIF-1α הוא חלבון מאוד לא יציב, הוא הופך להיות מפורק במהירות במהלך חמצון מחדש11. בנוסף, היפוקסיה מפעיל רוברטסונית הגרעין של רכיבים HIF-1 שורות תאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים פרופ ' / ח' חטא Tiong אונג לשימוש של תחנת העבודה היפוקסיה. עבודה זו נתמכה על ידי הבאות: סינגפור משרד החינוך, מו 1T1-02/04, MOE2015-T2-2-087 (כדי דיאגנוסטיקה), לי קונג Chian בית הספר לרפואה, אוניברסיטת הטכנולוגי Nanyang סטארט-אפ מענק M4230003 (ת. ד.), המועצה למחקר השבדי, קרן משפחת ארלינג-פרסון, קרן נובו נורדיסק, את af Stichting Jochnick קרן, האגודה לסוכרת שוודית, חברת הביטוח Scandia, במחקר הסוכרת, בריאות קרן, הקרן של דרגש פון Kantzow, תוכנית מחקר אסטרטגי סוכרת-Institutet קרולינסקה, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage, ואת קנוט אליס ולנברג קרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומר
1.0 מ' מאגר Tris-HCl, pH 7.4 1st BASE1415
חלבון A/G חרוזי ספרדAbcamab193262
חלבון IgG טבעי של עכברAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli מאגר דגימהBio-Rad1610737
2-MercaptoethanolBio-Rad1610710
ניטרוצלולוז ממברנה    Bio-Rad1620112
חוסם בדרגת ספיגהBio-Rad1706404חלב יבש ללא שומן ליישומי כתמים מערביים
10x Tris Buffered Saline (TBS)Bio-Rad1706435
10% Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/Glycine Buffer Bio-Rad1610771
Precision Plus חלבון תקני צבע כפולBio-Rad1610374
Anti-rabbit IgG, נוגדנים מקושרים HRPאיתות תאי7074
IgG נגד עכברים, נוגדן מקושר HRP איתות תאים7076
SignalFire ECLאיתות תאים6883
קורנינגמי מלח עם חוצץ פוספט של Dulbecco21-030-CV
פניל מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1 נוגדן בטא נובוס ביולוגיתNB100-124 ריכוז: 1.4 מ"ג/מ"ל
HIF-1 אלפא נוגדןנובוס ביולוגיNB100-479ריכוז: 1.0 מ"ג/מ"ל
YY1 נוגדןנובוס ביולוגיNBP1-46218ריכוז: 0.2 מ"ג/מ"ל
ערכת חלבון גרעיני Qproteome Qiagen37582מאגר ליזה NL ומאגר מיצוי NX1 מסופקים בערכה
GAPDH נוגדןסנטה קרוזsc-47724ריכוז: 0.2 מ"ג/מ"ל
גליצרול (≥ 99%)SigmaG5516
אשלגן כלוריSigmaP9541
RIPA bufferSigmaR0278
נתרן כלורי (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco' s שונה Eagle' s medium (DMEM, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז)Thermo Fisher Scientific11995065
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
סרום בקר עובריThermo Fisher Scientific10270106
קו תאים HEK293A ThermoFisher ScientificR70507
מתנול תרמו פישר סיינטיפיק67-56-1
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15140122
פירס מעכב פרוטאז טבליות Thermo Fisher Scientific88660
Pierce BCA ערכת בדיקת חלבוןThermo Fisher Scientific23225
QSP טיפ לטעינת ג'ל Thermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 uL
ציוד/מכשיר סינון כתמים עבה>
חזקעבה, חתוך מראש, 7.5 x 10 ס"מBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN  תא אלקטרופורזה אנכי Tetra עבור מיני ג'לים טרומיים, עם מיני Trans-Blot  מודול וספק כוח בסיסי PowerPacBio-Rad1658034
4– 15% ג'ל חלבון טרומי Mini-PROTEAN TGXBio-Rad4561083
ChemiDoc XRS+ SystemBio-Rad1708265
כפפהBioSpherixכפפות
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader BioTekBTS1LFTA
Costar 5 מ"ל צנרת סרולוגית רצועהקורנינג4487
קוסטאר 10 מ"ל צנרת סרולוגיתקורנינג4488
קוסטאר 25 מ"ל צנרת סרולוגית רצועהקורנינג4251
קורנינג 96 באר תחתון שקוף שחור פוליסטירן מיקרופלטותקורנינג3631
15 מ"ל גבוה צינורות צנטריפוגה חרוטיים Clarity PPקורנינג352095
מגרד תאים קטניםקורנינג3010
גילסון  ערכת פיפטמן L 4 פיפטות גילסוןF167370P2, P20, P200, P1000 ואביזרים
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילןגריינר ביו-וואן 
PIPETBOY acu 2 PipettorINTEGRA Biosciences155 000 
ארונות אחסון נוזלים דליקים JustriteJustrite Manufacturing Co.896000
מערבולת מערבולתLabnetS0200
CO2 חממהNuAireNU-5820
Orbital ShakersסטיוארטSSL1
צינור מסובב SB3סטיוארטSB3
MicroCL 21R מיקרוצנטריפוגהתרמו פישר מדעי75002470
Sorvall ST 16 צנטריפוגהתרמו פישר סיינטיפיק75004240
כלי תרבית רקמות (100 מ"מ)תרמו פישר סיינטיפיק150350
Slide-A-Lyzer MINI מכשיר דיאליזהתרמו פישר סיינטיפיק6958010K MWCO, 0.1 מ"ל
מצופים לצוף עבור 0.1 מ"ל Slide-A-Lyzer MINI מכשירי דיאליזה ThermoFisher Scientific69588
LSE מחממי אמבטיה יבשים דיגיטלייםThermo Fisher מדעי1168H25
תרמו מדעי  1300 סדרה A2 Class II, סוג A2 ארונות בטיחות ביולוגייםתרמו פישר סיינטיפיק13-261-308
<חזק>תוכנה
תוכנת מעבדת תמונהBio-Rad1709691
מגיב 616201

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819(2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HIF 1 AlphaARNTProtein AG SepharoseImmunoprecipitation BufferLaemmli

מאמרים קשורים