כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע ניתוח כמותי של הרמה של התאחדות קרום פלזמה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף. השיטה מבוססת על פירוק חישובית של קרום ומרכיב cytoplasmic של האות נצפו תאים עם תוויות עם סמן פלורסנט קרום פלזמה.
מאמר שיטה
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע ניתוח כמותי של הרמה של התאחדות קרום פלזמה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף. השיטה מבוססת על פירוק חישובית של קרום ומרכיב cytoplasmic של האות נצפו תאים עם תוויות עם סמן פלורסנט קרום פלזמה.
שיטה זו מספקת גישה מהירה על הקביעה של קרום פלזמה חלוקת כל מתויג fluorescently שמעניינת קשורה חלבון באמצעות הפרופילים של עוצמת קרינה פלואורסצנטית על פני קרום פלזמה. קרינה פלואורסצנטית נמדד פרופילים מצוידים על ידי מודל עבור ממברנה והפצה פלורסצנטיות הציטופלסמה לאורך קו שהוחל בניצב הפריפריה התא. מודל זה נבנה מתוך הערכים עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתאים הפניה לבטא סמן מתויג fluorescently הציטופלסמה ועם קרום פלזמה 4-64-שכותרתו ' FM. השיטה שניתן להחיל על סוגי תאים שונים, אורגניזמים; עם זאת, ניתן להעריך רק ממברנות פלזמה של תאים שאינם סמוכים. בשיטה זו מבוסס מיקרוסקופיה מהר מתאימה עבור ניסויים, שבה צפויים שינויים עדינים ולא דינמי של קרום פלזמה-הקשורים סמני ו צורך ניתן לכמת, לדוגמא, בניתוח של גירסאות מוטציה של חלבונים, מעכב טיפולים, האות התמרה חושית תצפיות. השיטה מיושמת בחבילה R בפלטפורמות כי זה משולב עם מאקרו של ImageJ המשמשת ממשק ידידותי למשתמש.
באופן עקיף-הקשורים פלזמה-הממברנה חלבונים הם המרכיבים העיקריים של התא איתות המסלולים. אחד התפקידים הבסיסיים שלהם הוא שלהם האגודה קרום פלזמה ארעי, דיסוציאציה, וזה חשוב עבור אותות בין קרום פלזמה לבין הציטופלסמה. יכול להיות מצורף באופן עקיף-הקשורים קרום פלזמה חלבונים על קרום פלזמה השומנים עוגנים (N-myristoylation, S-acylation או prenylation) או על ידי השומנים מחייב תחומים (אינטראקציה עם מלחי phosphatidylinositol, חומצה phosphatidic, וכו).
קרום פלזמה מחייב מאפיינים של חלבונים אלה יכול להיות בדק ויוו, למשל, כאשר חלבון מתויג fluorescently שינה מוטגנזה של חומצות אמינו מפתח, או כאשר הוא מטופל עם מעכבי שונים המשפיעים השומנים איתות. חלוקות של חלבוני ממברנה פלזמה פריפריאלי בעיקר להיות מוערכים איכותית, במיוחד במקרים, כאשר חלוקה מחדש חלבון הוא ברור. השיטה הציג היא אופטימלית במצבים כאשר חלוקה מחדש של חלבון זה רק חלקי הערכה כמותית הוא הכרחי. בגישה בשימוש תכוף של מתי קרום פלזמה האגודה מוערך מן קונאפוקלית לייזר סריקה תמונות מיקרוסקופ כמו יחס של עוצמות קרינה פלואורסצנטית קרום הפלזמה, הציטופלסמה1,2, הוא פשוט, אבל לא . זה מדויק עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב קרום פלזמה משקפים צירוף לינארי של קרום פלזמה, הציטופלסמה האות בשל תכונת עקיפה אור טכניקה מיקרוסקופית פלורסצנטיות מסוים של רכיבים אופטיים בשימוש3. כתוצאה מכך, האות cytoplasmic כלולה גם באיזור הממברנה. מסיבה זו, דפוס מכתימים FM 4-64 לא ניתן להשתמש כמסיכה עבור בחירת אות4ממברנה. יתר על כן, מדידות פשוטות של קרום אות במיקום המוגדר על-ידי FM 4-64 מכתים המרבי תמיד באופן שיטתי מגזים האות קרום פלזמה האמיתי של חלבון קרום פלזמה הקשורים באופן עקיף כתוצאה הסופרפוזיציה של ממברנה, cytoplasmic המתחם. המרבי של אותות שנצפה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף גם לא לשפה משותפת עם המרבי של דה מרקר קרום פלזמה (קרי, FM 4-64 styryl צבע), אבל הוא זז לכיוון הציטופלסמה. מגבלה נוספת היא מבוססת על העובדה FM שיא פליטת 4-64 היא רחבה יותר בהשוואה הפסגות פליטה ירוק ניאון חלבונים כמו GFP בשל אורך גל-התלות של שבירת אור3.
השיטה המתוארת כאן, האות חלבון מתויג מולבשת על ידי שתי פונקציות אמפירי המתארת את התפלגות היפותטי של קרום פלזמה ו אות ציטופלזמה, בהתאמה. זה פירוק האות מוחל על פרופילים פלורסצנטיות ליניארי שניתן להחיל על פני השטח תא בניצב קרום פלזמה בתמונות המקור, אשר רגיל, שני ערוצים מקטעים קונאפוקלית מתויג fluorescently חלבון להביע תאים עם FM 4-64 צבע תוויות.
הפונקציה הראשונה המשמש למדידות מתאר דיפרקציה של אות הציטופלסמה בקצה התא. קבלתו של פרופילי פלורסצנטיות שנרכשו בעבר נמדדו בתאים המבטאים סימן הפרוטאין. ציטופלזמה שתייגת על ידי כרומופור אותו כמו החלבון הקשורים באופן עקיף קרום פלזמה עניין. הפונקציה השנייה המתארת דיפרקציה של אות קרום פלזמה נגזרת של זריחה של FM 4-64. האות הזה מוערכת ראשית באמצעות פונקציה לפי עקומת גאוס אשר נמצא בשימוש עבור מידול משוער של אור עקיפה של המקור. שנית, מודל זה, חוקי עבור פליטת FM 4-64 אדום, מבחינה מתמטית כשהופכים את הטופס הרלוונטי עבור אורך גל פליטה של כרומופור להשתמש בתיוג של חלבונים הקשורים באופן עקיף של עניין-קרום פלזמה. שתי הפונקציות הן מנורמל עוצמת מירבית ועל ידי הממוצע מ 10% של הערכים הגבוהים ביותר עבור אות FM 4-64 ו אות cytoplasmic חלבון, בהתאמה. על ידי פירוק זה האות (שיטת המדידה מרובע לפחות לא לינאריות), היחס של קרום פלזמה לבין השבר הציטופלסמה של החלבון שנבדקו יכול להיות מוערך בקלות ובדייקנות. הממד ממשית של מקדם חלוקה למחיצות מחושב הוא בטווח של מיקרומטר, כי ריכוז עוצמה cytoplasmic מושווה ריכוז משטח על קרום פלזמה. הוא מגדיר את המרחק של קרום פלזמה אל הציטופלסמה, שבתוכו כמות זהה של חלבונים הוא מקומי כמו האזור הסמוך של קרום פלזמה. ערך זה שווה למחיצות המקדם K2 הציגה בעבר5. השיטה מהירה מאוד, הדורש יחיד רק מקטעים קונאפוקלית רכשה באמצעות סריקת מיקרוסקופ, לייזר קונפוקלי שגרתית, זה לא דורש שהמפתחות. הליבה ניתוח יושמה במארז נייד R ונכתב מאקרו נוספות של ImageJ כדי לספק ממשק משתמש גרפי להפעיל הניתוח של תיבות הדו-שיח אינטואיטיבי. תיאור מפורט יותר של השיטה ותוכנה (פורסם קודם לכן6) ניתן למצוא ב- http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
השיטה מתאימה תאים בודדים, protoplasts, רקמות, איפה קרום פלזמה של תאים בודדים ניתן להבחנה ברורה, המבטאת מבנה מתויג fluorescently של בדק חלבונים הקשורים באופן עקיף. כרומופור תואמת ל- FM צביעת 4-64 יש להשתמש. FM 4-64 פולט פלואורסצנטי אדום; לכן, יכול להיות מתויגת חלבון שנבדקו על-ידי קרינה פלואורסצנטית חלבון עם כחול, ירוק או צהוב פליטה (למשל, ה-GFP, CFP, YFP). שינוי יציב של חומר ביולוגי מומלץ מכיוון שהיא מאפשרת תצפיות ומלאכותית יותר לשחזור פחות חלבון הפצה. זה הכרחי כי החלבון שנבדקו יש התפלגות cytoplasmic יחסית הומוגנית. הלוקליזציה של חלבון את רשתית תוך-פלזמית או אחר תאיים קרום התא יכול לייצר תוצאות מלאכותי.
בנוסף, יש להשתמש באותו חומר ביולוגי לבטא סמן cytoplasmic עבור ההשוואה. תאים יכול להיהפך של chomophore חינם (זהה לזה המשמש חלבון היקפיים תיוג, למשל, ה-GFP חינם) או על ידי חלבון מתויג עניין עם קיבולת איגוד ביטל ממברנה. ממברנה איגוד קיבולת שאפשר לבטל, לדוגמה, על-ידי חיתוך של התחום מחייב ממברנה או מוטגנזה של חומצת אמינו מפתח residua (למשל, אתרים עבור N-myristoylation, S-acylation, או prenylation, וכו ').
עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקה, יש ליצור תאים על-ידי סמן קרום כמו צבען FM 4-64. אם FM 4-64 מכתים אינו מתאים חומר לימודי (עקב autofluorescence מפריעות, צבע עניים חדירה, וכו '), קרום פלזמה ניתן שכותרתו, לדוגמה, על ידי חלבון ממברנלי אינטגרלי פלזמה מתויג כדי (chomophore המתאים mCherry, RFP, וכדומה). זה חיוני כי דה מרקר יש לוקליזציה זניח בתאים ממברנה תאיים (endomembranes).
אם עובדים עם נוגדנים ודוגמאות קבוע, שניתן לתקן אנלוגי FM 4-64FX או קרום פלזמה תיוג על ידי נוגדנים נגד מטרה המתאים יכול לשמש. במקרה זה, זה חיוני כדי להעריך את התוצאות בזהירות רבה כי קיבוע הליכים יכול להוביל לאובדן סלקטיבי של חלבונים הציטופלסמה והן קרום פלזמה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. הכנת חומר ביולוגי
2. סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי
3. התקנת תוכנה נדרשים
4. תמונות ניתוח בפיג'י
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
DREPP10 הוא חלבון צמחים ספציפיים הקשורים באופן עקיף-קרום פלזמה המשויך קרום פלזמה דרך של N-myristoylation יחד עם אינטראקציה אלקטרוסטטית עם מלחי phosphatidylinositol11, 12. DREPP תוארה רכיב של מכונות איתות הסידן בתא צמח ויפעל גם עם שלד התא13,14. בניסוי שהוצגו, הטבק פראי-סוג DREPP2, לגירסתו מוטנטים שאינם-myristoylated (Gly2 מוחלף על ידי Ala) היו מתויג...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
השיטה המתוארת כאן יוצר אומדן מדויק יותר של קרום פלזמה למחיצות חלבונים הקשורים באופן עקיף לעומת גישות אחרות מבוסס על מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית5. השיפור העיקרי של שיטה זו הוא כי זה לוקח בחשבון את שבירת האור ואת עקרון הסופרפוזיציה של קרום הפלזמה, את האותות cytoplasmic. למרות התוצאות האלה שיטת מתאם עם התוצאות של שיטה פשוטה המבוססת על ההשוואה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית במיקום קרום עם הממוצע cytoplasmic אות (כפי שמוצג בעבר6), היתרון העיקרי של שיטה זו הרומן היא הקביעה של הה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים אין לחשוף.
פרויקט זה נתמך על ידי NPU, אני, LO1417 (משרד החינוך, נוער וספורט, של הרפובליקה הצ'כית).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| FM 4-64 | ThermoFisher Scientific | T13320 | צבע ממברנת פלזמה |
| דימתיל סולפוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | D4540 סיגמא | ממס צבע |
| ציוד רגיל (שקופיות מיקרוסקופיות, פיפטות, טיפים, צינורות) | ציוד לתיוג תאים ומיקרוסקופיה | ||
| סריקת לייזר קונפוקלי | |||
| מחשב רגיל |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאהAn erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University