הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57950

⸱

3 ביולי 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology I, Heart Center Freiburg University, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine, Monash University, 3Department of Medicine I, Lighthouse Core Facility, Medical Center, University of Freiburg, 4Department of Cardiology, Augustinerinnen Hospital, Academic Teaching Hospital, University of Cologne

במאמר זה

סיכום

מחזורי מיקרו Rna הראו הבטחה כמו סמנים ביולוגיים עבור infarctions אוטם אקוטי ומחלות לב וכלי דם. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול miRNA החילוץ, שעתוק במהופך של PCR דיגיטלי עבור כימות מוחלטת של miRNAs בנסיוב של חולים עם מחלות לב וכלי דם.

תקציר

סרום מחזורי מיקרו Rna (miRNAs) הראו הבטחה כמו סמנים למחלות לב וכלי דם, אוטם אקוטי (עמי), ששוחרר מן התאים וכלי דם למחזור. MiRNAs מחזורי יציב מאוד, ניתן לכמת. ביטוי כמותי של miRNAs מסוים אפשר לקשר את הפתולוגיה, ואני קצת miRNAs הצג רקמות גבוהה וספציפיות המחלה. מציאת סמנים חדשניים למחלות לב וכלי דם יש חשיבות למחקר רפואי. די מזמן, הומצאה תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (dPCR). dPCR, בשילוב עם הגששים הידרוליזה פלורסנט, מאפשר מסוים כימות מוחלטת ישירה. dPCR תערוכות איכויות טכני מעולה, כולל השתנות נמוך, ליניאריות גבוהה, רגישות גבוהה בהשוואה את תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR). לפיכך, dPCR היא שיטה לשחזור ומדויקת יותר ישירות לכימות תנועת miRNAs, במיוחד לשימוש רב מרכזי גדול לניסויים קליניים לב וכלי דם. בפרסום זה, אנו מתארים כיצד לבצע ביעילות PCR דיגיטלי כדי להעריך את המספר המוחלט עותק הדוגמאות סרום.

מבוא

מחזורי miRNAs זוהו כסמני מבטיח עבור מספר מחלות, כולל מחלות לב וכלי דם1. MiRNAs קטנות, ללא קידוד מולקולות RNA חד-גדילי (ארוך כ 22 נוקלאוטידים) מעורבים ב תקנת post-transcriptional ויה משינוי של RNA שליח תרגום וביטוי כמשפיע ג'ין2, הם שוחרר לתוך מחזור הדם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. ביטוי כמותי של miRNAs מסוימת יכולה להיות קשורה הפתולוגיה, ולהראות כמה miRNAs רקמות גבוה ומחלת ירידה לפרטים1. מחלות לב וכלי דם, miRNAs הפכו מועמדים אטרקטיביים כמו סמנים ביולוגיים הרומן כי הם יציב להפליא הנסיוב, יכול בקלות ניתן לכמת בעזרת PCR מתודולוגיה3. הערך הפוטנציאלי של miRNAs כמו סמנים ביולוגיים של אוטם שריר הלב יוערכו במחקרים קטנים, אך אימות בקוהורטות גדולות חסר2. לדוגמה, מיר-499 נמצא ביטוי מאוד שריר שריר הלב, זה הוכח להיות גדל באופן משמעותי ב-5,4,עמי6. עוד, זה מווסת מתוכנת מוות תאי (אפופטוזיס), את הבידול של cardiomyocytes, ובכך מעורב במספר מנגנונים בעקבות של עמי7. מלבד מספר מחקרים קטנים דיווח על עליונות של ערך מצטבר של miRNAs לאבחון של עמי, עליונות או מתוך שוויון רגישות גבוהה הלב troponins לא טרם הוכח מחקרים בקנה מידה גדול2,5 6, ,8. עוד מחקרים פוטנציאליים קוהורטות גדולות, לכן, נדרשים להעריך את ערכה אבחון פוטנציאל של miRNAs. בנוסף, שיטות של כימות miRNA צריך להיות מותאם, מתוקננת באמצעות השוואה פרוטוקולים9. מבחני סטנדרטית עשויה להפחית תוצאות לא עקביות, עשוי לסייע miRNAs להפוך פוטנציאל סמנים ביולוגיים עבור יישום קליני שגרתי, כמו סמנים ביולוגיים צריך ניתן לכמת באופן לשחזור כדי להבטיח שלהם ישימות קלינית.

לאחרונה, dPCR כבר הציג כמו ניתוח מובילים. זה מחיצות המדגם לתוך תגובות בודדות כ 20,00010. מערכת dPCR ואז מנצל מתמטית פואסון ניתוח סטטיסטי של אותות פלואורסצנט (תגובות חיוביות ושליליות), הפעלת של כימות מוחלט ללא עקומת תקן10. בעת שילוב dPCR עם הגששים הידרוליזה פלורסנט, כימות ספציפי מאוד מוחלטת ישירה של miRNAs התאפשר. תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי הראה שהפגינו מעולה טכנית איכויות (כולל השתנות ירד, של הפארמצבטית היומיומית מוגברת, רמה גבוהה של ליניאריות, רגישות גבוהה) עבור לכימות רמות miRNA מחזור הדם בהשוואה כמותית בזמן אמת PCR10,11. מעולה טכנית יכול לעזור להקל על המגבלות הנוכחי על שימוש במחזור miRNAs סמנים ביולוגיים ואף עלולה להוביל הקמת miRNAs סמנים גדולים רב מרכזי ניסויים קליניים לב וכלי דם וכן שיטת אבחון ב כללי. במחקר הקודם, אנו לאחרונה חלה dPCR עבור כימות מוחלטת של מחזורי miRNAs בחולים עם עמי, הצליחו להדגים פוטנציאל אבחון מעולה בהשוואה כימות של miRNAs-qPCR12.

בפרסום זה, אנחנו רוצים להראות כי באמצעות dPCR היא שיטה לשחזור ומדויקים עבור ישירות לכימות במחזור miRNAs לב וכלי דם. כימות מוחלטת של רמות miRNA בסרום, באמצעות PCR דיגיטלי, פוטנציאל לשימוש רב מרכזי גדול לניסויים קליניים לב וכלי דם. בפרסום זה, נתאר בפירוט כיצד לבצע ביעילות PCR דיגיטלי וכיצד לזהות את המספר עותק miRNA מוחלטת בנסיוב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. חילוץ של miRNA של פלזמה/סרום

הערה: על מנת לכמת miRNAs כראוי, הבידוד microRNA הנכון של הסרום/הפלזמה היא שלב חיוני. דבר המפתח שיש לזכור, במיוחד כי פרוטוקולים שונים קיימים, היא לדבוק אותה זרימת עבודה בעת עיבוד הדגימות. ב פרוטוקול זה, miRNA מופק µL 50 של נסיוב. אל תשתמש יותר מ-200 µL כמו מגבלה זו תהליך תקינה.

  1. להכין סרום או להפשיר דגימות קפוא.
  2. להוסיף 250 µL (5 כרכים) פירוק מסחריות ריאגנט µL 50 של נסיוב. התמיכה של פירוק על ידי vortexing. במקום ברכבת התחתית עם lysate על הספסל בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  3. ספייק lysate עם 3.5 µL של ספייק-אין שליטה (1.6 x 107 עותקים/µL) ומערבבים אותם על-ידי vortexing.
  4. מוסיפים 50 µL של כלורופורם (קרי, סכום השווה לגבי המדגם סרום ההתחלתי) ההפרדה שלב. לנער את הצינור נמרצות למקום ס' 15 הצינורית על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות.
  5. לצורך הקמת מכשול ההפרדה שלב, centrifuge את הצינור ב g 12,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    הערה: הדגימות מופרדים עכשיו לשלב מימית העליון המכיל את הרנ א לאטמוספרה לבן, שלב אורגני התחתון, ורוד.
  6. העברת העליון מימית השלב (100 µL) המכילה את הרנ א לתוך צינור חדש. לא להעביר כל חומר לבן לאטמוספרה כמו זה תשריט הרוזן RNA הנכון.
  7. להוסיף 150 µL (קרי, 1.5 x הנפח של המדגם שהועברו) של 100% אתנול. מערבבים את החומרים על-ידי pipetting אותן למעלה ולמטה. לא centrifuge אותם, ולעבור במהירות הצעד הבא.
  8. פיפטה µL 250 המדגם על עמודה ספין מסחרי בשפופרת אוסף 2 מ"ל. . סגור את המכסה Centrifuge את העמודה ב > g 8,000 x בטמפרטורת החדר במשך 15 ס' להשליך הזרימה דרך.
  9. להוסיף 700 µL של כביסה מסחרי מאגר מספר 1 לעמודה ספין. סגור את המכסה, centrifuge את העמודה ב > g 8,000 x בטמפרטורת החדר במשך 15 ס' ביטול המאגר הניסיוני כביסה.
  10. להוסיף 500 µL של כביסה מסחרי מאגר מספר 2 העמודה ספין. סגור את המכסה, centrifuge את העמודה ב > 8, 000 x g בטמפרטורת החדר במשך 15 ס' ביטול המאגר הניסיוני כביסה.
  11. פיפטה 500 µL של 80% אתנול לעמודה ספין. סגור את המכסה, centrifuge את העמודה ב > 8, 000 x g בטמפרטורת החדר במשך 2 דק למחוק ברכבת התחתית אוסף עם הזרימה דרך.
  12. להעביר את העמודה ספין צינור אוסף 2 מ"ל. Centrifuge את העמודה במלוא המהירות עם מכסה נפתח לייבש את הקרום. למחוק את הצינור אוסף עם הזרימה דרך.
  13. להעביר את העמודה ספין לתוך צינור אוסף חדש של 1.5 mL. Elute את הרנ א על-ידי החלת 30 µL של מים נטולי RNase ישירות אל המרכז של הקרום. . סגור את המכסה Centrifuge את העמודה במלוא המהירות עבור 1 דקות.
  14. לאחסן את הרנ א ב-70 מעלות צלזיוס.
    הערה: האחסון של RNA מטוהרים במים נטולי RNase בין-70 ° C ל-20 ° C מבטיחה אין השפלה של RNA אחריות לשנה. בעקבות הפרוטוקול של היצרן, הכמות המינימלית של RNase ללא מים כדי לדלל את הרנ א הוא 10 µL. שימוש פחות ממה עשוי 10 µL דיו מימה הקרום ולהפחית את התשואה הכוללת של RNA.

2. שעתוק במהופך

הערה: ה-DNA משלימים (cDNA) סונתז באמצעות פרוטוקול שעתוק במהופך (RT) 15 µL הבאים (התגובה סה כ נפח).

  1. להפשיר את הקיט RT על קרח. שמור את אנזימי במקפיא ארוכה ככל האפשר למנוע מהם משפיל ולסובב אותם למטה לפני השימוש. RT תחל על הקרח להפשיר ולסובב אותם למטה לפני השימוש.
  2. מכינים את תערובת הבסיס כפי שמתואר בטבלה 1.
  3. לשלב 10 µL של מיקס מאסטר µL 5 של RNA שחולצו לכל טוב בצלחת-ובכן 96.
  4. Centrifuge את הצלחת היטב ב g x 2,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  5. השתמש בפרוטוקול המחזור התרמי המתוארות בטבלה מס ' 2 עבור שעתוק לאחור.
    הערה: כפי שמתואר להלן, cDNA ייתכן ישירות יעובדו במכונת ה-PCR דיגיטלי (ראה טבלה של חומרים); לחלופין, זה ניתן לאחסן ב-20 ° C.

3. droplet דור ו- PCR דיגיטלי

הערה: דיגיטלי PCR בוצעה באמצעות פרוטוקול 40 µL הבאים.

  1. להפשיר את המיקס dPCR מסחרי את cDNA מוכן, תחל את ה-PCR על קרח. Centrifuge להם זמן קצר לפני השימוש.
  2. מכינים את תערובת הבסיס כפי שמתואר טבלה 3-
  3. הוסף 1.33 μL טוב של המוצר RT ' centrifuge אותו בקצרה.
  4. פיפטה 20 μL של המדגם לתוך כל טוב של הקלטת. ובכן 8 (שורה בינונית).
    הערה: אם הקלטת 8-ובכן לא מתמלא לגמרי, מלא את הבארות הנותרים עם פקדים שאינם מתבנית (NTCs) להשמיט cDNA (כלומר, המוצר RT הפיק עם מים במקום מחולץ RNA) או המאגר המסחרי dPCR. המעבר הלאומית משמשת פקד זיהום. מים חייב להיות בשימוש הבארות הנותרים, כי זה יפגום ביכולת האיכות של היווצרות droplet.
  5. פיפטה 70 μL של השמן דור droplet הגששים לתוך בארות נפט (שורה תחתונה) בקלטת 8-. טוב.
  6. למקם אטם על גבי קלטת 8-ובכן ולמקם את הקלטת בגנרטור droplet. סגור את הגנרטור droplet. לחכות עד שהאור 3 מחוון ירוק קבוע.
    הערה: טיפות עכשיו להיות נוצרים.
  7. לאט ובזהירות להעביר μL 40 המדגם מעוצב-droplet (שורה עליונה) לתוך בארות נפרדים של צלחת 96-ובכן מאת pipetting.
  8. לאחר השלמת היווצרות droplet על הדגימות, לאטום את הצלחת ה-PCR בנייר כסף pierceable dPCR ב 180 מעלות צלזיוס במשך 4 s.
  9. מניחים נייר כסף אטום PCR-הצלחת הצנטרפוגה ו מחזור זה כפי שמתואר בטבלה 4, בקצב הרמפה של 2.5 ° C/s.

4. droplet קריאה וניתוח

  1. להעביר את הצלחת הצנטרפוגה תרמי הבסיס של בעל צלחת. להדק את הצלחת ה-PCR על-ידי הצבת העליון של בעל לוחית לצלחת PCR.
  2. הפעל את תוכנת dPCR מסחרי.
  3. הזן את השם לדוגמה, את השם של הניסוי, ואת המטרה תוכנית ההתקנה. בחר כימות מוחלטת.
  4. התחל ה-droplet קריאה על-ידי לחיצה על הפעל. בחר FAM/HEX או FAM/ויק כמו כימיה זיהוי בעת עבודה עם הגששים הידרוליזה.
    הערה: התוכנה dPCR מסחר אוטומטי-תנתח את הנתונים.
  5. בדוק את המספרים droplet בטבלת התוצאות כדי להבטיח דור droplet הנכון.
  6. בחר כל בארות עם miRNA כימות באותו ' ולחץ על ' ניתוח'. השתמש את האבן החשופה 2D לסמן טיפות חיובי ולתקן באופן ידני את הנתונים מנותח אוטומטי (איור 1).

5. לתקן חישובים על הדגימה

  1. לנרמל את הדגימה על ידי הכפלת המדגם פקטור הנירמול (NF).
    NF = חציון [C. elegans מיר-39 מדידות]כל דוגמאות/ [C. elegans מיר-39]מדגם נתון
  2. חשב את ריכוז סרום miRNA הסופי, התאמת דילול גורמים (DF).
    [miRNA] סופי = [miRNA]raw ערך x DFRT x DFdPCR x DFEx
    איפה:
    [miRNA] ערך raw = את miRNA לכמת על-ידי תוכנת dPCR מסחרי;
    DFRT = הגורם דילול של התבנית בשעתוק במהופך;
    DFdPCR = הגורם דילול של התבנית ב- dPCR;
    DFEx = הגורם דילול החילוץ.

6. סדרת דילול Oligonucleotide סינתטי

  1. הפשרת lyophilized oligonucleotide סינתטי על קרח. בקצרה centrifuge זה.
  2. לדלל את oligonucleotide סינתטי lyophilized במים נטולי נוקלאז כדי ריכוז סופי של 10 pmol / µL. בקצרה centrifuge זה.
  3. למהול אותו במים נטולי נוקלאז כפי שמתואר בטבלה 5. Centrifuge הדילול בקצרה בין שלב לשלב דילול ב 8000 g x 10 s.
  4. להמשיך שעתוק במהופך כפי שמתואר בשלב 2 ולנתח את הדגימות עם ה-PCR דיגיטלית כפי שמתואר בשלב 3, שלב 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

PCR דיגיטלי משולב עם הגששים הידרוליזה פלורסנט מאפשר לחוקרים ישירות לכמת בכמויות המוחלטות ספציפי miRNAs בהתפתחות של עותקים/µL. כפי המדגם של dPCR מחולק למחיצות כ 20,000 תגובות PCR בודדים, dPCR אינה דורשת טכני משכפל10. מערכת dPCR מנצל ניתוח סטטיסטי פואסון מתמטי של אותות פלואורסצנט (שונות בין תגובות חיוביות ושליליות) המאפשר כימות מוחלטת ללא הצורך תקן עקומת10. על מנת לחשב נכונה הריכוזים, נדרש של הרוזן droplet מקובל (> 15,000). אין פקדים בתבנית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

PCR דיגיטלית היא שיטה יחסית הרומן מובילים של ה-PCR המאפשר כימות מוחלטת ישירה של חומצות גרעין בתוך מדגם. השיטה בעלת יתרונות מסוימים, כולל השתנות ירד, הפארמצבטית היומיומית מוגברת של רגישות מעולה11,12. יתרה מזאת, בשל חלוקת המדגם לתוך תגובות יחיד כ 20,000 וניתוחים קצה, dPCR היא איתנה יותר כדי חומרים מפריעות ב- PCR בהשוואה ל- RT-PCR כמותי16. תכונות אלה ב- dPCR להצליח חלופה אטרקטיבית RT-PCR כמותי בתור כלי אבחון על כימות. כמו במחזור miRNAs נוכחים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים יש אין התודות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
RNA-Extraction
miRNערכת סרום/פלזמה קלה (50)Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland217184Kit למיצוי microRNA. הערכה מכילה חוצץ מסחרי RWT (נקרא מספר אחת בכתב היד)  ו-RPE (נקרא מספר שתיים בכתב היד).
miRNeasy סרום/פלזמה ספייק בבקרה; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmolQiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland219610Spike-in לנורמליזציה, רצף: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 תגובות)Applied Biosystems, Inc., פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב4366597לשעתוק הפוך של microRNA
TaqMan MicroRNA Astests MApplied Biosystems, Inc., פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב 4440887בדיקות המשמשות בשעתוק הפוך
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב4440887מספר בדיקה 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב4440887מספר בדיקה 000200
PCR לוחית, 96 בארות, מפולח, חצי חצאיתThermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"בAB090096 צלחת באר לשעתוק הפוך
Microseal ' B’ seal SealsBio-Rad Laboratories, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"בMSB1001 רדיד להבטחת אחסון תקין
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad Laboratories, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב1851196 Cycler המשמש לשעתוק הפוך
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo has-miR-499-5pטכנולוגיות DNA משולבותמותאמות אישיתרצף: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGUGUUU-3'ddPCR
Supermix לבדיקות (ללא dUTP)Bio-Rad Laboratories, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב 1863024 Supermix המשמש ביצירת טיפות
TaqMan MicroRNA AstestsApplied Biosystems, Inc., פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"4440887Astests המשמשים ב-PCR דיגיטלי (בדיקת הידרוליזה פלואורסצנטית)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב4440887מספר בדיקה 001352, פריימרים מסחריים
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב4440887מספר בדיקה 000200, פריימרים מסחריים
DG8 מחסניות ואטמיםBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1864007מחסנית לוקחת עד 8 דגימות עבור מחסנית
DG8 לדור טיפות HolderBio-Rad Laboratories, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"1863051מחזיקה מחסניות בייצור טיפות
שמן לייצור טיפות עבור בדיקותBio-Rad Laboratories, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב 1863005 שמן המשמש בייצור טיפות
ddPCR 96-Well PlatesBio-Rad Laboratories, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"12001925צלחת 96 בארות עבור ddPCR
PCR צלחת חום אטם, נייר כסף, ניתן לניקובBio-Rad Laboratories, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב1814040 נייר כסף ניתן לניקוב, תואם לקורא טיפות
ddPCR Droplet Reader OilBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863004שמן המשמש לקריאת טיפות
QX100 או QX200 מחולל טיפותBio-Rad Laboratories, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב1863002מחולל טיפות, מייצר את הטיפות מתחליב דגימה/שמן
PX1 PCR אוטם צלחותBio-Rad Laboratories, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב1814000אוטם את הצלחת לפני PCR
C1000 Touch ThermalCycler Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1851196Cycler המשמש עבור ddPCR
QX100 או QX200 Droplet Reader Bio-RadLaboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863003קורא טיפות PCR חיוביות ושליליות PCR עם גלאי אופטי
בקרת מאגר ddPCR עבור בדיקותמעבדות Bio-Rad, Inc., הרקולס, קליפורניה, ארה"ב1863052בקרת ריק  ולמלא את הבארות הנותרות של 8-cassette
Software
QuantaSof SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1864011תוכנית לקריאת טיפות
פריזמה Windows 5GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USAתוכנית לניתוח סטטיסטי
ערכת ב ב ב

מקורות

  1. Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
  2. Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
  3. Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
  4. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
  5. Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
  6. Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
  7. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
  8. Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
  9. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
  10. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
  11. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
  12. Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
  13. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
  14. D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
  15. Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
  16. Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
  17. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MicroRNA
PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.