הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר

10.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57953

⸱

26 ביולי 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine and Cardiology, Charité University Medicine, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד cardiomyocytes פרפור ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר. תקנה ידנית בלחץ intraluminal של חללים לב מיושם להניב המתאימים עירור-התכווצות-מצמד לימודי תקין מבחינה פונקציונלית נייטרלים.

תקציר

במאמר זה, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד פרפור cardiomyocytes (ACMs) ממודל עכברוש של תסמונת מטבולית (גרורות)-הקשורים אי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר (HFpEF). השכיחות של HFpEF הקשורות המטס עולה ולאחר פרפור cardiomyopathies הקשורים שיפוץ פרוזדורים פרפור פרוזדורים הן רלוונטיות קלינית גבוהה כמו שיפוץ פרוזדורים כמנבא עצמאית של התמותה. מחקרים עם cardiomyocytes תא בודד מבודדים משמשים לעתים קרובות לאמת ולהשלים ויוו ממצאים. Rarefication כלי הדם ואת רקמת ביניים פיברוזיס להוות גורם מגביל באופן פוטנציאלי לבידוד בתא יחיד מוצלחת של ACMs של מודלים חייתיים של מחלה זו.

פתרנו בעיה זו על-ידי הפעלת מכשיר המסוגל באופן ידני וויסות הלחץ intraluminal של חללים הלב במהלך ההליך בידוד, האריך את התשואה של ACMs מורפולוגית והן מבחינה תפקודית ללא פגע. התאים הנרכש ניתן להשתמש במגוון רחב של ניסויים שונים, כגון תרבית תאים הדמיה תפקודית סידן (קרי, עירור-התכווצות-מצמד).

אנו מספקים החוקר עם פרוטוקול צעד אחר צעד, רשימה של פתרונות ממוטבים, הוראות יסודיות כדי להכין את כל הציוד הדרוש, מדריך מקיף לפתרון בעיות. בעוד היישום הראשוני של ההליך עשוי להיות קשה למדי, הסתגלות מוצלחת יאפשר לקורא לבצע את המדינה-of-the-art ACM ומשום במודל של עכברים של המטס הקשורות HFpEF עבור קשת רחבה של ניסויים.

מבוא

המטס מתאר מקבץ של גורמי סיכון סוכרת סוג 2, מחלות לב וכלי דם, כולל של לחץ דם עורקי מוגברת, dyslipidemia (העלה טריגליצרידים והנמכתי כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה), גדל צום גלוקוז, השמנה מרכזית1. השכיחות של גרורות ברחבי העולם מוערך 25 – 30% ובעלייה מתמדת2. HFpEF היא תסמונת קלינית heterogenous קשורה לעיתים קרובות עם גרורות. שיפוץ לב במהלך HFpEF, בשלבים הקודמים שלה (כלומר, מחלות לב לחץ דם גבוה) מלווה גם שיפוץ של אטריה3. הפונקציה כויץ מופחתת ושינויים מבניים של אטריום שמאל קושרו עם תמותה מוגברת, פרפור פרוזדורים, אי ספיקת לב התפרצות חדשה4. שיפוץ פרוזדורים מאופיין על ידי שינויים יון ערוץ פונקציה, Ca2 + הומאוסטזיס, מבנה פרוזדורים, פיברובלסט ההפעלה, וכן רקמות פיברוזיס5. עזבו שיפוץ פרוזדורים HFpEF הקשורות מטס, שבבסיס שלה מנגנונים פתולוגיים עדיין הם הבינו, דורשים חקירה מעמיקה עוד יותר. מודלים בעלי חיים הוכיחו להיות כלי רב ערך, להוביל ופיתוחים בתחום של פרפור cardiomyopathies6,7,8,9.

מחקרים עם cardiomyocytes תא בודד מבודדים משמשים לעתים קרובות לאמת ולהשלים ויוו ממצאים. בידוד, התרבות תאים עוקבים פוטנציאליים, לאפשר החקירה של איתות המסלולים זרמי ערוץ יוניים, עירור-התכווצות-מצמד. בתנאים הפיזיולוגיות, cardiomyocytes לא להתרבות. המיזוג בין רצפי רגולטוריות גנים ברמת השעתוק גורם atrial natriuretic, וירוס קופיים 40 גדול T אנטיגן של העכברים הטרנסגניים הוביל ליצירתו של ACMs immortalized הראשונה, בשם AT-110. המשך ההתפתחות של תאים ב- 1 הולידה HL-1 תאים, אשר לא יכולים רק להיות באופן סדרתי passaged אבל גם חוזה באופן ספונטני11. הם, לעומת זאת, מראים הבדלים מבניים ופונקציונליים לעומת תאים מבודדים טרי, כמו ultrastructure פחות מאורגנים, מופע גבוהה של פיתוח myofibrils11, ו- מופעל hyperpolarization פנימה הנוכחי12. בידודו של חדרית cardiomyocytes (VCM) אצל חולדות ועכברים ממגוון רחב של דגמים הוא וותיקה13,14,15,16,17,18 , 19. בדרך כלל, הלב נכרת הוא רכוב על מנגנון Langendorff ו retrogradely perfused עם Ca2 +-חינם מאגר המכיל אנזימי עיכול, כגון collagenases, פרוטאזות. סידן ואז מופיעה שוב בצורה stepwise לכל התנאים הפיזיולוגיים. עם זאת, למרות הפרוטוקולים המוקדש בידודו של ACMs זמין20,21, בשל פיברוזיס מוגברת והבדלים הקשורות ללחץ, התועלת שלהם מחלת דגמים עם שיפוץ פרוזדורים מוגבל.

במאמר זה, יישמנו פרוטוקול עבור בידודו של פרפור cardiomyocytes תא בודד מחיות המציגים פרפור שיפוץ (קרי, במיוחד עבור דגם עכברוש ZFS1 עבור HFpEF הקשורות מטס)22. קיימים פרוטוקולים בידוד ממוטב, כהשלמה מכשיר פשוט, בהזמנה אישית לשליטה ולשינוי הלחץ intraluminal של חללים הלב, שמוביל תשואות גבוהות של cardiomyocytes מורפולוגית והן מבחינה תפקודית ללא פגע. להלן כללי התנהגות מספק החוקר עם מדריך צעד אחר צעד, תיאור מפורט של הציוד בהזמנה אישית, רשימה של פתרונות, כמו גם מדריך לפתרון בעיות מקיף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים שאושרו על-ידי ועדת האתיקה המקומית (מס ערך מוסף T0060/15 ו- T0003-15) וביצע מסכים עם הקווים המנחים על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (המכון הלאומי לבריאות, ארה ב).

הערה: תרשים זרימה מפושטת של התהליך מוצג באיור1.

1. סידור מראש

  1. להכין את המאגרים על פי טבלה 1.
פתרוןPBCBDBSBS1S2S3NT
ריאגנט (מ מ)
NaCl135135135135135135135135
אשלגן כלורי4.74.74.74.74.74.74.74
2פו ח'40.60.60.60.60.60.60.6
נה2HPO40.60.60.60.60.60.60.6
MgSO41.21.21.21.21.21.21.2
MgCl1
HEPES1010101010101010
טאורין30303030303030
גלוקוז10101010101010
BDM10101010101010
CaCl210.010.1250.250.51
BSA150707070
אנזים מטוהרים תערובת (Thermolysin בינוני)יחידות Wünsch 0.195/mL...
יש להתאים ל- pH7.47.47.47.47.47.47.47.4
pH להתאמה37 ° C4 ° C37 ° C37 ° C37 ° C37 ° C37 ° C37 ° C
pH באמצעותNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOH

טבלה 1: רשימת מאגרי. חמאת בוטנים: זלוף מאגר, אשר ניתן לאחסן במשך 3 ימים ב 4 ° C (300 מ"ל לכל חיה). CB: תעלות מאגר, אשר ניתן לאחסן במשך 3 ימים ב 4 ° C (200 מ"ל לכל חיה). מסדי נתונים: עיכול מאגר, שבו יש כדי לשמש בתוך כמה ימים (40 מ"ל לכל חיה). SB: עצירת מאגר, אשר יש לשמש בתוך כמה ימים (2 מ"ל לכל חיה). S1: שלב 1 מאגר, שבו יש כדי לשמש בתוך כמה ימים (2 מ"ל לכל חיה). S2: שלב 2 מאגר, שבו יש כדי לשמש בתוך כמה ימים (2 מ"ל לכל חיה). S3: שלב 3 מאגר, שבו יש כדי לשמש בתוך כמה ימים (2 מ"ל לכל חיה). NT: Tyrode נורמלי, שבו יש כדי לשמש בתוך כמה ימים (50 מ"ל לכל חיה).

  1. הכינו את המנגנון Langendorff (איור 2 א).
    1. לרוקן את המערכת עם 100 מ של 70% אתנול, ואחריו ריקונים 2 100 מ ל מזוקקים מים. למלא את המערכת עם 200 מ ל מאגר זלוף (PB).
    2. הגדר את קצב הזרימה של משאבת סחרור 3 mL/min.
    3. לכייל את הטמפרטורה של PB עוזבת את המנגנון Langendorff ל 39 מעלות צלזיוס.
      1. מקם את הצינורית בהזמנה אישית [16 גרם, 25 מ מ אורך, חדות קצה הסיר (איור 3 א)] על המנגנון Langendorff ולהתחיל את הזרימה. להפעיל את המודול חימום ולהתאים את הערך של מודול חימום כדי להגיע לטמפרטורה הרצויה של PB בקצה הצינורית. עם סיום כיול טמפרטורה, להעביר את הצינורית בהזמנה אישית המזרק משמש את תעלות (איור 2B).
    4. הכן את התקן בקרת לחץ (איור 3C) ליד מערכת Langendorff. לטעון את המחט פרפר על גבי חצובה המלחציים והכן 3 קשרים חסימה.
      הערה: פעילות אנזים Collagenase משתנה עם הטמפרטורה. ניטור טמפרטורה של אטריום שמאל, כמו גם התאמה דינמי הימנו, נדרש בהמשך ההליך.
  2. להגדיר את ציוד הכריתה איברים של תעלות על פי איור 2B. ממלאים את הספל, מזרק, צלחת פטרי עם מאגר תעלות קר כקרח (CB) והכן את הקשרים תעלות.
  3. Heparinize העכברוש עם 500 I.U. של הפארין לכל 100 גרם של משקל הגוף של החולדה כדלקמן.
    1. לשים 2 מ ל 100% איזופלוריין תא אינדוקציה הרדמה מתאים עבור מכרסמים. העברת בת שבוע 21 ZFS-1 החולדה שמנים מן הכלוב אל התא אינדוקציה. אפשר החולדה להזין הרדמה עמוקה, המצוין על-ידי ההאטה של הנשימה מחצית תדירותו הראשונית.
    2. הסר את החולדה התא אינדוקציה. מזריקים I.U. 500 של הפארין לכל 100 גרם של משקל הגוף של החולדה לתוך הצפק באמצעות מזרק הפארין.
    3. להחזיר את החולדה לכלוב שלה ולאפשר לו כדי להתעורר.
      הערה: אין צורך לשמור על עקרות במהלך שלב 1.4. לחכות 20 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא. בדיקות דם לא שלם יכולות לגרום קרישת דם, המוביל מיקרו-infarctions, אשר יכולים להשפיע באופן משמעותי את האיכות ואת התשואה של cardiomyocytes מבודד.

2. לב הכנה

  1. לשים 2 מ ל 100% איזופלוריין תא אינדוקציה הרדמה מתאים עבור מכרסמים. העברת בת שבוע 21 ZFS-1 החולדה שמנים מן הכלוב אל התא אינדוקציה. אפשר החולדה להזין הרדמה עמוקה, המצוין על-ידי ההאטה של הנשימה מחצית תדירותו הראשונית.
  2. להרדימו ע י עריפת ראשו באמצעות גיליוטינה מתאים עבור מכרסמים. שמלמדות את הגפיים של העכברוש על משטח פוליסטירן מוקצף. הרם, מסירים את העור המכסה את הסרעפת עם מספריים כירורגיים. פתח את הצפק מתחת הצלעות משני הצדדים ולחשוף את הסרעפת.
  3. פתח הסרעפת על-ידי ביצוע חתך לאורך הקשת הקדמי באמצעות מספריים משובחים. לחתוך הצלעות משני הצדדים לאורך לינאה mediaclavicularis עד העצם בריחי, באמצעות מספריים כירורגיים, כדי לחשוף את. החיץ הקרומי בתוך באתרו.
  4. הסר את הריאות בקצות דיסטלי הילה במספריים בסדר. לגזור התימוס לחשוף את קשת אבי העורקים.
  5. לצבוט את הבסיס של הלב באמצעות מלקחיים ומשוך בעדינות לכיוון הזנב של החיה. קיצור דרך אבי העורקים תוך שמירה על משיכה על הלב, השארת קטע ארוך 5 מ מ של אבי העורקים מצורף אל הלב. העבר במהירות את הלב לתוך 50 מ ל מגלן קרח במיכל 50 מ ל (איור 2B).
    הערה: במהלך השלבים 2.5-3.3, הלב הוא ביעילות בתנאים איסכמי. הימנע העולה על סך של 3 דקות על שלבים אלה כדי לא לגרום נזק cardiomyocytes.

3. תעלות

  1. חכו כ 10 s עבור הלב להירגע ולתפוס התכווצויות. להעביר את הלב לתוך צלחת פטרי המכילות 50 מ של רענן, CB קר כקרח. הסר בזהירות את רקמת שומן סביב העורקים באמצעות מלקחיים ומספריים.
  2. הכנס את הצינורית בהזמנה אישית (אותו הדבר כמו בשימוש שלב 1.2.3), אשר מצורף המזרק 10 מ"ל מלא עם CB קר כקרח, 3 מ מ לתוך העורקים. שמלמדות העורקים על גבי הצינורית על ידי קשירת אחד הקשרים תעלות שני (איור 3B) בשקע מקורב אל קצהו של הצינורית.
    הערה: יש להיזהר לא לגרום נזק את שסתום אבי העורקים על ידי חדירה עם הצינורית.
  3. בעדינות לרוקן את העורקים עם 5 מיליליטר CB כקרח באמצעות המזרק מחובר את הצינורית עד אין יותר דם מוצגת ב- העורקים הכליליים. בעדינות לעסות את אטריום שמאל באמצעות מלקחיים, להזריק את 5 מיליליטר CB, התרת דם עודף להסיר החלל לתוך הפטרי הנותרים.
  4. את הכוס השנייה תעלות (תפר: USP 3/0, משי) בשקע דיסטלי אל קצהו של הצינורית. טעינת את הצינורית עם הלב המצורפת של המזרק. לטעון את הצינורית עם לב המצורפת Langendorff באמצעות מתאם מתאים.
    הערה: פרוטוקול זה מעסיקה לחץ גבוה בחלל חדרית במהלך זלוף-המנגנון Langendorff. הקשר תעלות נוסף נדרש כדי לשמור על הלחץ הזה על ידי הימנעות כל זליגת מאגר anterograde דרך אבי העורקים.

4. לחץ מניפולציה ועיכול

  1. התחל את משאבת סחרור של המנגנון Langendorff ליזום את זלוף של רקמת הלב עם חמאת בוטנים. לקשור קשר בוהן כפול (תפר: USP 3/0, משי) הבסיס של הלב, למעט אבי העורקים. חזור על שלב זה עד האינפלציה של האטריום ימינה ושמאלה, כמו גם הסינוס הכלילי, הוא הבחין.
  2. לנקב האטריום עם מחט פרפר של התקן בקרת לחץ (איור 3D) ולאפשר האטריום להוצאת אוויר. לתפעל את הלחץ intraluminal של האטריום על-ידי התאמת גובה של הצינור פרפר. תמשיך האטריום בניפוח מעט במהלך המשך ההליך; לפקח ולכוונן בהתאם.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע במהירות, כמו האינפלציה ממושך של אטריום שמאל תגרום מוות cardiomyocyte.
  3. למדוד את הטמפרטורה המשוערת של אטריום שמאל על-ידי הצבת בדיקה טמפרטורה בין מימדי החדר השמאלי. להתאים את הטמפרטורה של Langendorff חימום מודול בהתאם, מיקוד משוער בטמפרטורה של 37 ° C של אטריום שמאל.
  4. Perfuse את הלב עם PB עבור סכום כולל של 3 דקות.
  5. לעבור את זלוף מאגר עיכול (DB) למשך כ- 14 – 18 דקות.
    הערה: העיכול הושלם, כאשר המבנה פרפור השמאלי כיווץ הרקמה רוכשת את מרקם חלבי.
  6. לצבוט האטריום באמצעות מלקחיים, לחוקק משיכה קלה. הסר את אטריום שמאל באמצעות מספריים בסדר ולהעביר האטריום לתוך סירה במשקל גדול המכיל 2 מ ל לעצור את המאגר (SB), מלא השוקע הרקמה.
  7. השלך רקמת הלב הנותרים לבצע את ההנחיות של המעבדה שבו מתבצע ההליך.

5. התא עיבוד והתאמה מחדש סידן

  1. מינצ הרקמה פרפור לחתיכות קטנות של בערך 2 מ"מ x 2 מ"מ באמצעות מספריים משובחים.
  2. לפזר את הרקמה על ידי יניקה עדינה וגושים הוצאה של הרקמה באמצעות פיפטה של העברה. המשך הליך זה כ 5 דקות עד יכול להיות שנצפו דיסוציאציה מאקרוסקופית של הרקמה.
    הערה: להימנע בכל בועות אוויר במהלך שלב זה, כמו חשיפת התאים לאוויר יגרום למוות cardiomyocyte.
  3. העבר את התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. לאפשר את חתיכות רקמה להסתפק העברה ס' 30 את תגובת שיקוע לתוך עוד צינור חרוטי 15 מ"ל. לאפשר את התאים להתיישב למשך 15 דקות.
  4. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 2 מ של מאגר שלב 1 (ראה טבלה 1). לאפשר את cardiomyocytes להתפשר על 10 דקות.
    הערה: תגובת שיקוע שהושלכו כוללת גם fibroblasts ותאי אנדותל. עיין בפרוטוקולים אחרים אם זה רצוי להשתמש תאים אלה עבור ניסויים14,23. בגדר תכיל בעיקר פרפור cardiomyocytes, אשר יכול להיות מאושרות על ידי מיקרוסקופ אור. מאפייני cardiomyocytes פרפור מיקרוסקופיים נידונות בשלב 6.1.
  5. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 2 מ של מאגר בשלב 2. לאפשר את cardiomyocytes להתפשר על 10 דקות.
  6. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 2 מ של מאגר שלב 3. לאפשר את cardiomyocytes להתפשר על 10 דקות.
  7. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 250 µL של נורמלי Tyrode (NT) המכיל 1 מ Ca2 +.
  8. העברת µL 50 של Tyrode רגיל המכיל cardiomyocytes פרפור על גבי צלחת זכוכית-התחתון, אשר היה מצופה laminin 25% (להתייבש מראש). לאפשר את cardiomyocytes להתפשר על 10 דקות.
  9. למלא צלחת זכוכית-התחתון µL 500 של NT המכיל 1 מ מ CaCl2.

6. הערכה תפקודית של עירור-התכווצות-מצמד

  1. להעריך את התא מורפולוגיה ואת הכדאיות תחת מיקרוסקופ אור באמצעות הגדלה X 20 (איור 4A , 4B). באופן אקראי בחרו כ 100 תאים, לסווג אותם קיימא או נבאדה כדי לאמוד את הכדאיות של ההליך בידוד תאים.
    הערה: התאים קיימא מאופיינים במבנה סימטרי סרקומר היעדר קרום מגדלים פורחים, צורת מוט.
  2. לטעון את התאים עם Ca2 +-רגיש הפלורסנט בתוך 20 דקות של השלמת שלב 5.9.
    1. להוסיף 10 מיקרומטר Fluo4-בבוקר עד 500 µL של NT. להסיר תגובת שיקוע מתוך קערה מזכוכית-התחתון (מתוך שלב 5.9). הוסף את NT המכיל Fluo4-אם למנה זכוכית-התחתון. דגירה את התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את הדגימה 2 x באמצעות µL 500 של NT.
  3. דמיינו Ca2 +-עירור עם מיקרוסקופ קונפוקלי כדלקמן.
    1. להעביר את הצלחת התחתונה זכוכית מיקרוסקופ קונפוקלי והמחש Ca2 +-עירור עם מיקרוסקופ קונפוקלי (לייזר בעוצמה 5.8%, עירור-488 ננומטר, פליטה-515 ננומטר) באמצעות 40 X הגדלה.
    2. Perfuse התאים עם NT מחומם ל 37 ° C באמצעות מכשיר superfusion המתאים. לחלופין, לחמם את התאים באמצעות חממה של חום רכוב מיקרוסקופ
    3. לעורר את cardiomyocytes בתוך שדה חשמלי עם אלקטרודות ממריץ זמינים מסחרית, רכוב מיקרוסקופ תדירות של 1 הרץ, זרם חשמלי של 24 א להמתין 1 דקות כדי לאפשר את התאים כדי להגיע למצב יציב של Ca2 + טיפול.
    4. מקם את הסריקה קו מקביל לציר חציה, במחצית הדרך בין הגרעין לבין קצה שנבחרו באקראי, בעין בלתי מזוינת קבלנות תא. לרכוש קו לסרוק תמונות על-ידי סריקת חוזרות.
    5. השתמש בתוכנת הדמיה זמינה בחופשיות כדי לאמוד את עוצמת האות מיד לפני גירוי חשמלי (F0) על-פני התא כולו. להתוות את עוצמת האות על פני התא כולו במהלך גירוי 1 מחזור (נ). לחלק (נ) (F0) כדי לקבל את הערכים המתאימים Ca2 + ארעית.

תרשים זרימה של עיבוד איברים, שלבים להזרקת הפרין, כריתת איברים, קנולציה, הדמיה.
איור 1: תרשים זרימה מפושטת של ההליך בידוד. הנוהל הוא מאוד רגיש זמן עד השלמת עיכול אנזימטי השריר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תרשים מערכת הלב וכלי הדם וכלי ניתוח למחקר אנטומי; הגדרת מיקרוסקופיה וציוד מעבדה.
איור 2: הכנת ציוד לפני הבידוד. (א) חלונית זו מציגה את מנגנון Langendorff מתוצרת עצמית: (1) כלי התגובה במקטורן עם חמאת בוטנים; (2) כלי התגובה במקטורן עם CB; (3 צימוד 3-way); (4 מזרק); (5 משאבת סחרור); (6 טבילה חימום); (7) מלכודת בועות במקטורן; ו- (8) הצינורית ואת הלב. (B) לוח זה מראה את השטויות הכריתה תעלות ו עוגב זרימת עבודה מיטביים: (1) גביע 100 מ עם 50 מ של CB הקר; (2) מזרק 10 מ"ל עם CB הקר; (3) צלחת פטרי עם CB הקר; (4) מקור אור; (5) בצינורית בהזמנה אישית עם תעלות מקמי (ראה גם להבין 3A ו- 3B); (6) מלקחיים בסדר, עקומים; (7) מלקחיים רקמות; מלקחיים בסדר (8), בזווית 45 מעלות; (9) מספריים כירורגיים בטן; (10) מספריים כירורגיים בסדר; (11) 4 x 30 G מחטים; (12) מחט 15 גרם. (C) בלוח זה מציגה בניינ מיקרוסקופ ציוד ההדמיה קונאפוקלית: אלקטרודות אחד האביזרים המקובלים לגירוי חשמלי (1); (2) עט superfusion; (3) צלחת זכוכית-התחתון עם ACMs; אלקטרודות שקוע ממריץ חשמלי פלטינה (4). (די) לוח זה מראה את השטויות מיקרוסקופ קונפוקלי ההדמיה: (1) מיקרוסקופ קונפוקלי; (2) עט superfusion; (3) מאגר מאגר superfusion; (4 וסת זרימה superfusion); (5) superfusion חימום מודול; (6 עמדות מחשב); ו- (7) אחד האביזרים המקובלים לגירוי חשמלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הגדרת שיווי משקל סטטי לניסוי רקמות; טכניקת לולאת תפר, מעמד מהדק,.
איור 3: ציוד בהזמנה אישית. (א) לוח זה מראה 15 מניפולציה בצינורית G עם מנעול סכינים סטריליים. החצים מצביעים על שתי הכניסות עבור הקשרים תעלות. (B) אלו הן התרגילים תעלות שני קשר בוהן כפול מניחים אחד על השני להידוק מהיר. החצים מצביעים ואיפה שבו סדר הקשר צריך לתגבר. (ג) לוח זה מראה המכשיר בקרת לחץ מורכבים. מחט פרפר 21 G, מחובר לבית מלחציים חצובה. . הצינור נשמרת באותו גובה כמו המחט. הבורג העליון נפתח. ניתן לשנות את גובה הצינור פרפר כפי שצוין על ידי החצים כדי לשנות את הלחץ intraluminal של אטריום שמאל. (D) שמאלה אטריום נוקב עם המכשיר בקרת לחץ תמונה זו מראה אטריום שמאל באופן אידיאלי המנופח. האליפסה מסמן את המיקום של קשר בוהן. (E) שמאלה אטריום נוקב עם המכשיר בקרת לחץ תמונה זו מראה אטריום שמאל יתר המנופח, אשר יניבו תשואה נמוכה יותר של קיימא ACMs. האליפסה מסמן את המיקום של קשר בוהן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

רוב בגיל 21 שבועות, 60 – 90% של קיימא ACMs (מוערך כפי שמתואר בשלב 6.1), לאחר הסתגלות מחדש סידן (שלב 5.4 – 5.7), יכול להיות מבודד עכברים שמנים ZSF-1. בשיטה זו (איור 4A). בחולדות, ACMs מאופיינים שונה, יותר פנוטיפ heterogenous לעומת24,VCMs25. איור 4B מראה של ACM בודדים עם ממברנות שהשתמרו ומבנה סרקומר, שני אינדיקטורים חזקים של תא נפרד מבחינה פונקציונלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו קודם תיאר עבור בידודו של תא בודד ACMs ממודל עכברוש של המטס הקשורות HFpEF המציגה מסומן שיפוץ פרוזדורים22פרוטוקול. הנוהל הוא ייחודי מאתגר כמו רקמות שומן עודף יכול לגרום ההכנה כירורגי, כמו גם את תעלות של אבי העורקים, יותר ויותר קשה. המדריך לפתרון בעיות מסופקים כתובות בטבלה 2 הבעיות הנפוצות ביותר של ההליך בידוד.

הבעיהסיבה אפשרית<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי DZHK (גרמנית מרכז למחקר קרדיו, די. בי), EKFS (Stiftung אחרת-Kröner-Fresenius, F.H.), ועל -ידי את BMBF (משרד החינוך הגרמני, מחקר), כמו גם BIH-צ'אריטה במימון תוכנית מדען קליני מאת צ'אריטה - Universitätsmedizin ברלין, ברלין מכון הבריאות (F.H.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ZSF-1 חולדה שמנהמעבדות צ'ארלס ריבר, בע"מבן 21 שבועות
מספריים איריסעדין כלי מדע עדינים GmbH14094-11
מספריים כירורגייםכלי מדע עדינים GmbH14001-18
מלקחיים מיקרו חבישה (מעוקלים, משוננים)Aesculap, Inc.BD312R
מלקחיים לרקמות (ישר, 1 x 2 שיניים)Aesculap, Inc.BD537R
מלקחיים קשירה (זוויתית)Aesculap, Inc.MA624R
גיליוטינה של מכרסמים ובעלי חיים קטניםקנט סיינטיפיק קורפבעלות נמוכה DCAP
3.0 ליטרקנט סיינטיפיק קורפ.סומנו-0730 
סט עירוי כנפי פרפר 21 GHospira, Inc.
Abbocath 16 GHospira, Inc.0G7149702
מחט היפודרמית מיקרולנסבקטון דיקינסון GmbH301300שינוי מחט להכנת צינורית
בראון מזרק פרפוזור מקורי 50 מ"לB. Braun Melsungen AG8728810F
בראון הזרקת מזרק סולו 10 מ"לB. Braun Melsungen AG2057926
50 מ"לDuran Group (DWK Life Sciences GmbH)21 106 17
צלחת פטרי Duroplan (100 x 20 מ"מ)Duran Group (DWK Life Sciences GmbH)21 755 48
Seraflex Suture USP 3/0SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KGIC208000
VWR חד פעמי סירות שקילה מרובעות 100 מ"לVWR, Inc.10803-148
משטח
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ', בע"71380
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ', בע"מP4504
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמא-אולדריץ', בע"מP5379
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמא-אולדריץ', בע"מS0876
מגנזיום סולפט הפטהידראטסיגמא-אולדריץ', בע"מ
מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ', בע"מM8266
HEPESסיגמא-אולדריץ', בע"מH3375
טאוריןסיגמא-אולדריץ', בע"מT0625
גלוקוזסיגמא-אולדריץ', בע"מG7528
2,3-בוטנדיון מונוקסימהסיגמא-אולדריץ', בע"מB0753
תמיסת סידן כלורי (1 מ')Sigma-Aldrich, Inc.21115
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ', בע"מA9647
LiberaseRoche (סיגמא-אולדריץ', בע"מ)LIBTM-RO
HeparinRotexmedica GmbH3862357
Forene (Isoflurane)Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG10182054
Laminin מקרום הבסיס של סרקומה עכברי Engelbreth-Holm-SwarmSigma-Aldrich, Inc.L2020
WillCo צלחת תחתית זכוכית 500µ l 0.005 מ"מWillCo Wells BVHBST-3522
Fluo4 AMInvitrogen (תרמו פישר סיינטיפיק, בע"מ)F142015 ומיקרו; M למשך 20 דקות ב-RT
Di-8-ANNEPSInvitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.)D316710&מיקרו; M למשך 45 דקות ב-37 מעלות; C 
Mitotracker RED FMInvitrogen (תרמו פישר סיינטיפיק, בע"מ)M2242520 ננומטר למשך 30 דקות ב-37 מעלות; C
כלי תגובה מעוטר 500 מ"לGebr. Rettberg GmbH107024414
כלי תגובה מעוטר 1000 מ"לGebr. Rettberg GmbH107025414
מלכודת בועות מעוטרתGebr. Rettberg GmbH134720001
ED חימום טבילה סירקולטורJulabo GmbH9116000
Reglo Digital MS-2/6 משאבה פריסטלטיתIsmatec (Cole-Parmer Gmbh)ISM 831
וולטקראפט מדחום 302 K/JConrad אלקטרוני SE030300546
LSM 700 מיקרוסקופCarl Zeiss, Inc.
תוכנת הדמיה ZEN 2.3Carl Zeiss, Inc.410135-1011-240 
בקר חימום ערוץ יחיד TC-324BWarner Instruments, LLC64-2400
מערכת זלוף 8 ערוציםWarner Instruments, LLC64-0185
8 ערוצים Multi-Line מחממי פתרונות בשורהWarner Instruments, LLC64-0105
תא אינדוקציה 181106101קלקרמ230391צינורות

מקורות

  1. Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
  2. International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
  3. Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
  4. Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
  5. Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
  6. Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
  7. Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
  8. Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
  9. Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
  10. Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
  11. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
  12. Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
  13. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  14. Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).
  15. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357(2014).
  16. Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289(2013).
  17. Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109(2014).
  18. Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
  19. Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
  20. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).
  21. Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823(2014).
  22. Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
  23. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033(2010).
  24. Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
  25. Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
  26. Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
  27. Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
  28. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  29. Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
  30. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  31. Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
  32. Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
  33. Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
  34. Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד קרדיומיוציטים של העלייהפרפוזיית לנגנדורףמודל חולדה ל-HFpEFלב עם תסמונת מטבוליתבידוד תא בודדפרוטוקול דימות סידןצימוד עירור-התכווצותמחקר על עיצוב מחדש של העלייהניתוח במיקרוסקופיה קונפוקליתהערכת חיוניות תאים
בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.