מאמר שיטה

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

DOI:

10.3791/58088

⸱

7 באוגוסט 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. מדווחים שיטות אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע necroptosis כולל מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי לחיות תאים הדמיה, סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, ואיגוד מבוסס-NMR השומנים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necroptosis הוא שביל מוות תאים מתוכנת המופעלות על-ידי הפעלה של קולטן אינטראקציה קינאז 3 (RIPK3), אשר phosphorylates ומפעיל את שושלת היוחסין מעורב קינאז כמו תחום pseudokinase, MLKL, קרע או permeabilize קרום פלזמה . Necroptosis הוא מסלול דלקתיות המשויך פתולוגיות מרובות, כולל מחלת חיסון עצמי, זיהומיות ומחלות לב וכלי דם, שבץ מוחי, הקשורים ניוון מוחיים של סרטן. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים יכול לשמש כדי לאפיין MLKL כמו המוציא של קרום פלזמה קרע necroptosis. עלינו לדמיין את התהליך של necroptosis תאים באמצעות הדמיה לחיות תאים עם מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי פלורסצנטיות, וכן תאים קבוע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, אשר יחד חשף הפצה מחדש של MLKL מ ציטוזול כדי פלזמה ממברנה לפני אינדוקציה של חורים גדולים קרום הפלזמה. אנו מציגים במבחנה תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ניתוח באמצעות ליפידים לזיהוי מאפננים בשם של necroptosis בתיווך MLKL. מבוסס על שיטה זו, אנו מזוהות phosphatidyl-אינוזיטול מלחי (פיפס) ונותנת השומנים מחייב כמותיים קלסרים קריטי של MLKL הנדרשים עבור מיקוד קרום פלזמה ו permeabilization ב necroptosis.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי רכיבים גנטיים של necroptosis הנחתה את השימוש במודלים לבחון את ההשלכה של necroptosis פיסיולוגיה ומחלות1,2,3,4,5. נוקאאוט של RIPK3 או MLKL בעכברים הייתה מינימלית במשתמע הומאוסטזיס מבוגר ופיתוח רומז ש-necroptosis זו אינה חיונית עבור החיים3,6. יתר על כן, מינים מסוימים אינם מכילים גנים או RIPK3 או MLKL, תומך את תפקיד שאינם חיוניים necroptosis של בעלי חיים7,8. מצד שני, מאתגר חייתיים נוקאאוט עם פתולוגיות שונות המושרה במעבדה חשף תפקיד חשוב של necroptosis דלקת, מולדת חסינות, זיהום נגיפי9,10, 11 , 12.

Necroptosis יכול להיות מופעל במספר דרכים על-ידי איתות באמצעות חיישנים שונים מולדת חסינות, כל אילו התוצאה הפעלת13,1,RIPK314. RIPK3 פעיל phosphorylates בתורו ומפעיל MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. למד ביותר, אולי הדרך המורכבים ביותר, שמוביל הפעלה של RIPK3 כרוך מוות קולטן מצדו, אשר bifurcates מבוסס על הרכב במורד הזרם של מתחמי איתות לזירוז או אפופטוזיס או necroptosis1. Necroptosis מתפתח כאשר איתות באמצעות RIPK1 הוא המועדף ותוצאות האירוסין של RIPK319,20. התוצאה היא חביבה עליהם בקלות על עיכוב תרופתי או מחיקה גנטי של קספאז 8, מעכב אנדוגני בשם של necroptosis שמחזיק necroptosis במפרץ. RIPK1 נקשר ומפעיל RIPK3. דרך נוספת להפעיל את necroptosis היא דרך רצפטורים כמו אגרה TLR3/TLR4 איתות, אשר עוסקת ומפעיל RIPK3 דרך טיר-תחום-המכיל בתדר מתאם אינטרפרון-β (TRIF)21. עוד דרך נוספת למות על ידי necroptosis היא על-ידי הפעלת את חיישן ה-DNA דאי, אשר עוסקת ישירות ומפעיל RIPK322.

MLKL הוא חלבון cytosolic מורכב תחום bundle (NB) החורש N-מסוף, תחום pseudokinase C-מסוף (psKD) מקושרים על ידי אזור רגולטוריות מסולסל3. בתאים נורמליים, MLKL נמצא את ציטוזול שבו הוא חשב להיות קומפלקס לא פעיל עם RIPK314. הפעלה של necroptosis מפעיל זרחון RIPK3 של MLKL בתמונה ההפעלה של psKD, וכן אתרים נוספים שעלולים NB ו הסד3,15,23. זרחון גורם בשינוי הסתגלותי MLKL שתוצאתו דיסוציאציה מ RIPK314. ממעטים להבין שינויים הסתגלותי לשחרר את הסוגר המסולסל מ- psKD24. הסוגר, אשר מכיל את 2 helices, ומתווך oligomerization של MLKL לתוך trimer בשם דרך סליל C-מסוף25. הסליל N-מסוף הסוגר מעכב את התחום NB, אשר חיוני ממברנה permeabilization24,26. בבידוד, תחום NB מספיקה לגרום permeabilization קרום פלזמה ו-24,necroptosis16,27. פעילות פרו-necroptotic של NB הוקמה מחדש העכבר מתחלקים fibroblasts בנכונותם MLKL (mlkl- / - MEFs). NB הוא תחום הכריכה השומנים העוסק מעדיפים את diphosphate phosphatidylinositol 4.5 פוספוליפיד (פיפ2). אנחנו הציע מנגנון stepwise של ההפעלה של MLKL, שבו מסולסל oligomerization מקלה על גיוס של MLKL את קרום פלזמה דרך אינטראקציות החלש של NB עם קבוצה ראש קוטב2 24פיפ. -הקרום, NB עובר מוסדר חשיפה של אתר קשירה גבוהה-זיקה נוספים פיפ2, אשר מוסווה על ידי הסוגר המסולסל ב MLKL לא פעיל. בסך הכל, האינטראקציות מרובים של NB עם פיפ2 יציבות קרום פלזמה המוביל שלה קרע, למרות המנגנון המולקולרי של אירועים אלה לא הובהר.

כאן אנו ממחישים שיטות ספציפיות שימוש כדי לאפיין את הפונקציה של MLKL כמו המוציא להורג של necroptosis24. בפרט, אנו מתמקדים התחום הכי מזערי של MLKL, NB ו הסד (NBB), אשר מווסת על ידי עיכוב הסד והוא יכול להיות מופעל דרך dimerization שנאכפת לזירוז necroptosis ולמסמנים של קרום פלזמה. נתאר מערכת ביטוי inducible שלנו בשילוב עם שנאכפת שיכרון בתיווך FKBP dimerization עבור הדמיה לחיות תאים, ואלקטרון מיקרוסקופי של תאים שעברו necroptosis. בנוסף, אנו ממחישים את הניתוח שלנו במבחנה NMR של האינטראקציות של NBB עם phosphatidylinositols (פיפס).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שיבוט וסלולרי קו הדור

  1. PCR להגביר את אזור NBB, המקביל חומצת אמינו שאריות 1-140 (NBB140), מ- cDNA MLKL אנושי עבור מסגרת סטנדרטית מבוססת אנזים הגבלה שיבוט עם oligomerization תחום 2 x FK506 מחייב חלבון (2xFKBP או 2xFV), ונוס פלורסנט החלבון לתוך דוקסיציקלין (Dox) - וקטור retroviral inducible pRetroX-TRE3G להשיג NBB140- 2xFV-ונוס (טבלה 1, דמויות 1A-B).
  2. להנציח את ראשי mlkl- / - או ripk3- / - mlkl- / - העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) המתקבל העכברים המתאימים זמינים במעבדה ירוק מאת ארעי תרביות תאים עם אנטיגן SV40-גדול הבעת פלסמיד. בחר תאים מונצחים ~ 1-2 שבועות, ולתחזק ב DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) 2 מ מגלוטמין, 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין, 1 מ מ נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן חיוניות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ברקמת סטנדרטי חממות תרבות.
  3. מגלי מונצחים SV40 mlkl- / - MEFs עם transactivator טטרציקלין הפוכה מבוקר (rtTA)-המכיל הרטרווירוס הביע מ פלסמיד המכיל הגן ההתנגדות blasticidin (שלנו פלסמיד ששונה) ולטפל 1 בשבוע עם blasticidin 5 μg/mL כדי לבחור עבור תאים stably לבטא rtTA28.
  4. מגלי MEFs את הבעת-rtTA עם וקטור retroviral Dox-inducible המכיל את MLKL chimeric (pRetroX-NBB140-2xFV-ונוס-puro) ובחר באמצעות 4 μg/mL puromycin אחד בשבוע, 2 ימים לאחר התמרה חושית.

2. לחיות תאים במיקרוסקופ הדמיה של בתיווך MLKL Necroptosis

  1. צלחת mlkl- / - MEFs לבטא NBB140-2xFV-ונוס-צפיפות של תאים 50,000 לכל טוב (1 מ"ל/טוב) 24 צלחות, ואוהבים דגירה בין לילה (איור 2א). השתמש לחיות תאים צביעת עבור תא אוטומטית ספירה (ראה טבלה של חומרים).
  2. יטפל בתאים של 12 שעות עם Dox (0.5 μg/mL) כדי לעודד את הביטוי של NBB140-2xFV-ונוס.
  3. זירוז necroptosis עם 25 ננומטר FKBP dimerizer (לדים) בנוסף 25 ננומטר ממברנה-אטום ירוק פלורסנט לצבוע (ראה טבלה של חומרים) ב- DMEM רגיל (ראה 1.2). תאים שעברו necroptosis לצבור לצבוע כמו שלהם שלמות קרום פלזמה נפרצת על ידי NBB140-מתווכת קרע. ביצוע מבחני שהפקידים או ארבע פעמים.
  4. כדי לפקח על necroptosis באמצעות מערכות הדמיה צבע יחיד או כפול (ראה טבלה של חומרים), מקם את כלי ביחידת ההדמיה המתאימות בבניין של חממה בתרבית של תרביות רקמה.
  5. לפתוח את התוכנה (ראה טבלה של חומרים), בחר בכרטיסיה לוח הזמנים הקרוב סורק תחת הרשימה משימות.
    הערה: פרוטוקול זה הוא עבור הדמיה באמצעות מערכות צבע יחיד, אך תוכנה דומה זמין עבור מערכות צבע כפול.
  6. בחר "מגש, קיבול, סוגי סריקה", והתבנית "סריקה" הכרטיסיה "פריסה פיזית" ואת "זריחה מהר" בכרטיסיה מאפיינים.
  7. להוסיף "סרוק הזמן" על-ידי לחיצה על חלון "ציר זמן" ואת המספר הכולל של נקודות זמן ותדירות של רכישה (בדרך כלל 1 רכישת כל h 0.5 כדי 1h לציון 6 קמ ש 12, או כל 5 דקות עבור necroptosis מהיר-קינטיקה) ולהתחיל ייבוא תמונות על-ידי בחירה "App ly"(הכפתור האדום).
  8. לכמת necroptosis שימוש בתוכנת ניתוח התמונה (ראה טבלה של חומרים) על-ידי בחירת מחלונית"משימות", "אובייקט ספירת ניתוח חדש עם סף פילוח קבוע מעל פני רקע", אשר יכול להיקבע על-ידי ריחוף סמן העכבר מעל הרקע אזורים במספר תמונות ניתוח.
  9. לבחון פלורסנט אובייקטים על-ידי בחירת תצוגה מקדימה באמצעות התמונה הנוכחית ולמקד את רמות הסף כנדרש.
  10. לשלב את ספירת פלורסצנטיות ירוק על-ידי פתיחת הכרטיסיה "להפעיל ניתוח חדש", לבחור את הזמן טווח, בחר את הבארות כדי להיות מנותח, הכנס "שם המשימה ניתוח", והקש "אישור".
  11. גישה ניתחו נתונים הכרטיסייה "ניתוח עבודות" על-ידי לחיצה כפולה על שם המשימה בהתאמה וייצוא מהחלון גרף/ייצוא לניתוח נוסף ב תוכנה graphing חיצוני (ראה טבלה של חומרים).
  12. Quantitate נתונים כמו זריחה ירוק חיובי (+ ve) מ"מ/סעיפים2 או לנרמל את ספירת על ידי הנהרות ולבטא את הנתונים כמו זריחה ירוק + ve ספירות/זרימה.
  13. לחלופין, על נקודת הקצה ניסיוני, כתם תאים עם 100 ננומטר של פלורסנט ירוק ממברנה-permeant צבע (ראה טבלה של חומרים). לנרמל את הנתונים לתאים necroptotic % כיחס בין זריחה זריחה/ירוק ירוק בנקודת קצה.

3. לחיות תאים מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה של קרום פלזמה גיוס, Permeabilization על ידי MLKL

  1. צלחת mlkl- / - MEFs לבטא NBB140-2xFV-ונוס על צפיפות של תאים 20,000 לכל טוב (0.5 mL/טוב) בכוס למטה 4-ובכן מיקרוסקופ קאמרית pretreated עם 50 fibronectin µg/mL. ב- PBS ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, תקופת דגירה של ~ 12 h ( איור 2B).
  2. לטיפול תאי עם Dox (0.5 μg/mL) עבור ~ 12 h לזירוז הביטוי של NBB140-2xFV-ונוס.
  3. זירוז necroptosis על ידי המקננת בינונית טרייה (1 מ"ל/טוב) המכיל 25 ננומטר דים כדי לגרום NBB140-2xFV-ונוס ההפעלה של טרנסלוקציה כדי קרום פלזמה.
  4. למקם את התא מיקרוסקופ קונפוקלי בנוי על העמדה ההפוכה מצוידים הסביבתי, 63 סורק לייזר דיסק ספינינג המטרה נה 1.4 ולהתחיל imaging. רכישה באמצעות תוכנה של בחירה (ראה טבלה של חומרים).
  5. אתחל את התוכנה, בחר "פוקוס" סמל של תצורת המסנן YFP (עירור גל 515 ננומטר).
  6. אתר את שדה הראיה ואת במישור המוקד, וקיום של מערכת אחזקה פוקוס באמצעות הכרטיסיה "פוקוס מובהק".
  7. כדי להתחיל רכישה, בחר בכרטיסייה "ללכוד" ואחריו הקצאה של תצורת המסנן, המתאים EMCCD מצלמה חשיפה התעצמות וזמן רווח ופרמטרים רכישת זמן לשגות כולל מרווח זמן ואורך של רכישה.
  8. לפקח על הסלולר הפצה של NBB הניאון140-2xFV-חלבון ונוס במהלך necroptosis על ידי רכישת תמונות כל 10 s על ידי מצלמה EMCCD באמצעות לייזר nm 515 (1 סרטים).
    הערה: Photobleaching היא דאגה עם חלבון פלואורסצנטי הדמיה. ונוס הוא אחד החלבונים פלורסנט עמידים יותר photobleaching29. אם נעשה שימוש פלורסנט חלבונים אשר רגישים יותר photobleaching, תמונה כל 30 s או יותר כדי לאפשר התאוששות של האות בין נקודות זמן הדמיה.
  9. כדי לפקח על קרום פלזמה התאחדות NBB140-2xFV-ונוס במהלך necroptosis, תמונה כל 10 s המדגם המבושלות 3.3 על-ידי קרינה פלואורסצנטית גמורה מיקרוסקופ (TIRF) באמצעות מיקרוסקופ מצויד של המחוון TIRF אוטומטיות ו- a 100 X 1.4 נה אובייקטיבית, מצלמה EMCCD (2 סרטים). בצע שלבים 3.5 – 3.7, אבל לכוון את זווית TIRF בתוך הכרטיסייה להתמקד TIRF על פי עובי זכוכית מדגם והחלק התחתון של התא מיקרוסקופ.
    הערה: קרום פלזמה סמנים כגון LCK-C-RFP עשוי לשמש כפקדי בלוקאליזציה קרום פלזמה בניתוח TIRF.
  10. לבצע עיבוד כדי לשפר את איכות על ידי קונבולוציה עם הנגזרת השנייה מנורמל שלילי של פונקציה לפי עקומת גאוס (מאר אלגוריתם) תמונה.

4. מיקרוסקופ אלקטרונים

  1. צלחת mlkl- / - MEFs לבטא NBB140-2xFV-ונוס על צפיפות של 5 מיליון תאים מצופים פלזמה 150 מ מ תא תרבות מאכל, תקופת דגירה של 12 שעות (איור 3).
  2. מתייחסים התאים באמצעות דוקסיציקלין (0.5 μg/mL) כדי לעודד את הביטוי של NB1-140-2xFV-ונוס במשך 12 שעות.
  3. זירוז NBB140-2xFV-ונוס ההפעלה של טרנסלוקציה כדי קרום פלזמה עם 25 nM של homodimerizer במשך 5 דקות. הפעם הוא הקים את קינטיקה של necroptosis הנהוגות הדמיה לחיות תאים.
  4. להסיר את המדיה ולתקן תאים באמצעות 10 מ"ל של 2.5% גלוטראלדהיד, 2% paraformaldehyde ב 0.1 M נתרן cacodylate מאגר pH 7.4 (מאגר cacodylate) מראש חימם ב 37 º C.
  5. איסוף הדגימה על ידי גירוד ולסובב את הדגימות 10 דקות ב 500 x g. למחוק את תגובת שיקוע.
  6. Postfix המדגם עבור 1.5 ש ח בחודש מופחתת 2% אוסמיום ארבע-חמצני עם 1.5% אשלגן ferrocyanide במאגר cacodylate נתרן 0.1 M. אוסמיום ארבע-חמצני הוא סוכן מכתימים בשימוש נרחב TEM לספק ניגוד. השתמשנו TEM כמו ניתוח ראשוני לפני SEM של התא שעברו necroptosis.
  7. לשטוף את הדגימה 5 פעמים במים הנדסה גנטית למשך 5 דקות ב 500 x g, ואחריו שטיפות במאגר (ראה 4.6), מים, אתנול על מעבד אוטומטית. למחוק את תגובת שיקוע.
  8. עבור תצורת ה-SEM, מכתים את הדגימות בעבר קבוע עם 1% uranyl אצטט ולהוביל אספרטט מטאל הכתם31.
  9. מייבשים את הדגימות דרך סדרה מדורגת של אלכוהול פרופילן אוקסיד פתרונות.
  10. להטביע את הדגימה קשה שרף32 להשיג בלוק שרף.
  11. לחתוך קטעים בעובי של 0.5 μm כדי לקבוע את האזור הנכון של ניתוח.
  12. מעיל הדגימות עם סרט דקים של מתכת ניצוח (אירידיום).
  13. תמונה ולנתח את הדגימות (איור 3). על כימות, תמונת נמוך-הגדלה של פני השטח בלוק של שרף עם תאים החשופים נסרק בחמש קוו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני.
  14. דמיינו תאים מעבר בודדים תמונות שנלכדו SEM או הדמיה בתוכנה היכולה לשמש להצטרף מספר שדות-of-view לתוך תמונה רציפה אחת30. בערך 100 תאים עשוי לשמש כדי להעריך את השבר של תאים שעברו necroptosis באופן זה על ידי יצירת מצרף ברזולוציה גבוהה בתוכנה של בחירה (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: ניקוד מורפולוגיה נמק מאת SEM השוואת תכונות תאים נורמליים עם ההתקדמות של פנוטיפים מראש עם נמק או נמק. תכונות אלה כוללות שינויים קרום פלזמה לרבות העלמות microvilli, שיטוח, יתבקע בתאים החל מ 10 nm 1 µm גודל, או אובדן של אברון מבנה מעבר לפחות 30-40% של השטח תא cytosolic.

5. השומנים קשירה של MLKL על ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה

  1. להכין 15NBB התווית על-ידי N1-156 על ידי חלבון רגיל ביטוי וטיהור כמו שתואר לעיל24.
  2. להמיס µg 500 של אמוניום 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol מלח (18:0 PI) ומלח 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) אמוניום (18:1 PI) ב- 500 µL של קרח CHCl3 כל הסופי ריכוזי 1 מ"ג/מ"ל.
  3. Sonicate 1 מ"ג/מ"ל 18:0 ו- 18:1 PI באמבט מים sonication עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר או עד 5 דקות בתוך תערובת קרח-מים.
  4. Aliquot 1 מ"ג/מ"ל 18:0 ו- PI 18:1 לתוך מבחנות זכוכית נקי לסדרה בודדים NMR טיטור (איור 4). העברת שומנים, ממיסים אורגניים בעזרת מזרקים לאוויר זכוכית.
    1. Aliquot µL 132 של 1 מ"ג/מ"ל 18:1 PI (המסה טוחנת = g 880.137/mol) CHCl3 עבור אמצעי אחסון resuspension הסופי של µL 1,200-125 µM ריכוז.
      הערה: עבור צינורות 5 מ מ NMR, להכין דילול טורי נפחי > 1,000 µL ל NMR הסופי לטעום כרכים של > 500 µL. עבור צינורות 3 מ מ NMR, להכין דילול טורי נפחי > 300 µL ו- NMR הסופי לטעום כרכים של > 150 µL.
  5. Aliquot 1 מ"ג/מ"ל חזירי המוח L-α-phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate אמוניום מלח 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (המוח PI (4.5) P2) לתוך מבחנות זכוכית נקי.
  6. מניחים צלוחיות תחת זרם גז של ארגון (Ar) או חנקן (N2) עם זרימה בינונית מתמוססות הממס האורגני ללא להתיז הקירות בקבוקון זכוכית. חמש עד שלושים דקות מספיקה בדרך כלל עבור אמצעי אחסון של 10 – 200 µL הממס האורגני.
  7. לארגן זכוכית vial(s) בחלק התחתון של ביכנר או flask ואקום באמצעות פינצטה גדולה, חותם עם פקק גומי, ולצרף את צינורות פלסטיק חיבור לקו ואקום. לפנות את הבקבוק תחת ואקום עדין בן לילה כדי להסיר שאריות אורגניקס.
  8. כיסוי השומנים aliquots סרט עם גז אינרטי, לסגור עם מכסה אטום ואחסן ב-20 ° C לשימוש בתוך חודש אחד או -80 ° C עבור אחסון ארוך טווח.
  9. להכין NMR מאגרי דגימה ללא דטרגנט (-Det) המכיל 20 מ מ נה-xH-yפו-4 pH 6.8, 10% D2O, ללא דטרגנט (+ דט) המכיל 20 מ מ נה-xH-yפו-4 pH 6.8, 10% D2O, 0.34 ממ n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
  10. הוסף + מאגר דט כדי בקבוקון זכוכית עם סרט השומנים לריכוז הרצוי, sonicate באמבט מים למשך עד 30 דקות, מתחלפים sonication 10 דקות ולאחריו בדיקה ויזואלית.
    הערה: ייתכן Sonication חמים לדוגמה. לאפשר להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני שיחזור מדגם החלבון הסופי.
  11. לבצע דילול טורי של השומנים-דטרגנט הקזאין ב + מאגר דט באמצעות sonication של 1:1 תערובות עבור הסידרה הריכוז הרצויה. החל מ- 125 µM שומנים בדם ריכוז, שלוש חזרות תניב מיקרומטר 62.5 מיקרומטר 31.3, השומנים מיקרומטר 15.6 ב- 0.34 ממ DDM.
  12. להכין שליטה וההתייחסות NMR דגימות של חלבון ותוספים ב- Det ו + מאגרי דט, בהתאמה. להוסיף חלבון ו תוספות כל דילול של השומנים ב + מאגר דט.
    הערה: עבור 15N NBB156, חלבון נוסף ריכוז סופי של 40 µM, בתוספת 2 מ מ deuterated dithiothreitol להשאיר שאריות Cys מופחתת.
  13. להעביר את אמצעי האחסון המתאים של דגימות 5 מ מ או 3 מ מ מרעד (ראה הערה בשלב 5.4).
  14. דוגמיות NMR בייצור מכשירים או לארגן פלטפורמה אוטומציה כגון מטעין SampleCase באופן ידני.
  15. לרכוש ללא הפרדות צבע ספקטרום NMR באמצעות תוכניות הדופק הרגיל עבור 1H הפרוטון ספקטרום כמו בקרת איכות ואחריו 2D 1H -15N מתאם ספקטרה או הרפיה רוחבי ממוטב ספקטרוסקופיה (TROSY) או heteronuclear קוונטית מרובים קוהרנטיות (SOFAST-HMQC)33.
    הערה: השימוש של צינורות 3 מ מ NMR מחייבת סריקות 64 H 1 -15N TROSY (~ 3 h) או 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 דקות). סרוק מספרים הם חצוי עבור צינורות 5 מ מ NMR.
  16. ניתן להוסיף ספקטרום NMR 2D מעובד מאגר קארה34 עבור ניתוח או תוכנה אחרת של בחירה עבור המשתמש.
  17. לנתח את התוכנה על ידי הוספת ביאורים מגנטיים NMR 2D עבור שלוש פסגות מפוזר היטב והחליט לכל מדינה חלבון. להקליט את amplitudes שיא לכל אחת הפסגות 6 עבור כל תנאי מאגר המכיל NBB156 (איור 5א).
    1. השתמש קארה כדי להכין רשימת אצווה-אינטגרציה (בתפריט הראשי לחץ על הכותרת "ספקטרום | הגדרת רשימת אצווה"...) של הספקטרום שנאספו ולנתח באמצעות קובץ המשימה שיא יחיד (בתפריט הראשי לחץ על הכותרת "פסגות | יבא Peaklist". והוא בחר קובץ על-ידי המשתמש .peaks עם פסגות הכולל 6, 3 לכל מדינה חלבון, המוגדר בתוך).
    2. כוונן את ההגדרות ("אינטגרטור | Tune שיא דגם"...) של X רוחב 0.06 ppm ו- Y-רוחב 0.30 ppm (בתפריט הראשי לחץ על הכותרת "אינטגרטור | Tune שיא דגם"...) לפני הקלטת הפלט הסופי במתפריט שתי בחירות (1. לחץ על כותרת בתפריט הראשי "אינטגרטור | שילוב רשימת אצווה") (2. לחץ על כותרת בתפריט הראשי "פסגות | ייצוא טבלה שילוב") (איור 5B).
      הערה: מגנטיים אמיד המרכזי (backbone) עבור שאריות M21, V53, ואת L105 הוקצו עבור מצב סגור-הסד156 NBB. מצב פתוח-הסד שובץ עמוד השדרה מגנטיים אמיד של משקעים G130 ו- A141 ואפסילון פרוטון צד-שרשרת התהודה של W133 באמצעות NMR 3D ניסויים24.
  18. לנרמל דוגמיות להשוואה ישירה מגנטים שונים או מדגם תנאים על ידי חישוב ממוצע של amplitudes פתוח-הסד שלושה של הדגימות הפניה וחישוב פקטור נרמול הנוגעות לשתי ההפניות. לחשב את amplitudes מדורגים עבור NBB156 מגנטיים באמצעות פקטור הנירמול הגדרה amplitudes שלילי כאפס (טבלה 2).
    דוגמאות: 1) השוואת דגימות מגנטים שונים: מגנט, NBB156+ DDM, מגנט B, NBB156+ DDM. 2) השוואה דטרגנט: 0.34 מ"מ DDM ו 1.7 מ"מ DDM.
  19. לחשב עבור כל תהודה השבר המשנה את גודלו של סגור - או פתוח-הסד על-ידי חלוקת עם המגוון של משרעת המינימום למקסימום של הספקטרום שנאספו המכיל הפניות המתאים של NBB חינם156 , NBB לחלוטין פתוח-הסד156 ב דטרגנט.
  20. להתוות את amplitudes NMR מנורמל כפונקציה של ריכוז השומנים ולהשוות את חלק NBB פתוח-הסד156 בתנאים שונים (איור. ג 5).
    הערה: לחלופין, ניתוח של השבר של הסד סגור קונפורמציה נגד שומנים בדם ריכוז ניתן לבצע כדי להשוות בין השומנים מחייב NBB156. אנחנו מעדיפים הניתוח לשעבר כי זה מהיר יותר, טוב יותר דיווחים על השבר-מעורבת לגמרי על ידי שומנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להמחיש necroptosis מוסדרים ביצוע בתאים חיים היה אפשר דרך ביטוי inducible של מבנה MLKL קטום מינימלית, NBB140-2xFV-ונוס. את המבנה הזה, שומר על היכולת לגרום permeabilization קרום פלזמה, מופעל באמצעות דים-induced oligomerization בקלטת FKBP (2xFV). עלינו להתבונן, לכמת necroptosis על ידי מיקרוסקופ לחיות תאים הדמיה, ניטור kinetically (כל 5 דקות) ספיגת של צבע הכריכה DNA פלורסצנטיות ירוק אטום (איור 6א) תא. מערכת inducible זו הוא מאוד חזקים,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מספקים פרוטוקולים טכניקות שילבנו ל ערבו MLKL כמו המוציא בשם של קרום פלזמה קרע24. בנוסף לפענח את רשת גנטית המווסת בתיווך MLKL necroptosis, שיטות אלה ניתן באופן עצמאי לאפיון מערכות ביולוגיות מתאימים אחרים. מבחינה מעשית, טכניקות אלה הן כלי גילוי בינונית-נמוכה תפוקה.

באופן שגרתי השתמשנו הדמיה לחיות תאים של NBB140-2xFV-ונוס-לתווך necroptosis, וכי המושרה על ידי בונה MLKL אחרים, לנתח mechanistically ברגולציה של MLKL ב necroptosis דרך מוטגנזה מכוונת ועל -ידי שימו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שיבוט ויצירת קו תאים
pRetroX-TRE3GClontech631188
Tet-On transactivator פלסמידLlambi et al., 2016
פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) mlkl-/-Dillon et al., 2014
Blasticidin S Hydrochlorideתרמו פישר סיינטיפיקBP2647100 CAS#3513-03-9
<חזק>כימות מוות תאים ומיקרוסקופיה של תאים חיים
דוקסיציקליןקלונטק631311 CAS# 24390-14-5
B/B Homodimerizer AP20187Takara635059 CAS# 195514-80-8
SYTOX GreenThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
<חזק>NMR
15 N אמוניום כלורידמעבדות איזוטופ קיימברידג'NLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterated DTTCambridge Isotope LaboratoriesDLM-2622-1
תחמוצת דאוטריוםסיגמא אולדריץ'617385-1 CAS# 7789-20-0
n-Dodecyl-β-D-MaltopyranosideAnatraceD310 CAS# 69227-93-6
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (מוח, חזיר) (מלח אמוניום)Avanti Polar Lipids840046X CAS# 383907-42-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (מלח אמוניום) (18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS# 849412-67-5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (מלח אמוניום) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS# 799268-53-4
Specialized Equipment
IncuCyte FLR או ZOOMEssen BioScience, Inc.הדמיית מיקרוסקופיה של תאים חיים
Helios NanoLab 660 DualBeam Thermo Fisher ScientificElectron microscope
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comניתוח הדמיה
FEI MAPSThermo Fisher Scientifichttps://www.fei.com/software/maps/ EM ניתוח
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comאיסוף נתוני NMR
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ ניתוח נתוני תמ"ג
Slidebook3i (חידושי הדמיה חכמים)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookמיקרוסקופיה קונפוקלית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  3. Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
  4. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  5. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  6. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  7. Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
  8. Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
  9. Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
  10. Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
  11. Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
  12. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  13. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
  14. Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
  15. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  16. Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
  17. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
  18. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
  19. Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
  20. Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
  21. Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
  22. Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
  23. Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
  24. Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
  25. Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  26. Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
  27. Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  28. Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
  29. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586(2011).
  30. Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).
  31. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  33. Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
  34. Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
  35. Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
  36. Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MLKL NecroptosisLive cell ImagingNuclear Magnetic ResonanceLipid Binding AnalysisConfocal MicroscopyElectron MicroscopyNecroptosis InductionMLKL TranslocationPhosphatidyl inositol Phosphates

מאמרים קשורים