שיטה תרבות Proximal ללמוד Paracrine איתות בין תאים

סיכום

אינטראקציות סלולרי Paracrine ו- juxtacrine תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל התקדמות הגידול, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה ופיתוח. כאן, שיטה תרבות proximal משמש כדי ללמוד paracrine איתות שבו ריכוז המותאמות לשפות אחרות של הגורמים המופרש נשמרים תוך מניעת מגע ישיר הסלולר.

תקציר

אינטראקציות המערכת תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל התקדמות הגידול, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה ופיתוח. Paracrine או juxtacrine איתות שמתווכת אינטראקציות כאלה. השימוש במדיום ממוזגים ולימודי coculture הן השיטות הנפוצות להפלות בין שני סוגים אלה של אינטראקציות. אולם, השפעת ריכוזים גבוהים המותאמות לשפות אחרות של גורמים המופרש microenvironment במהלך אינטראקציות paracrine לא recapitulated במדויק על-ידי מדיום ממוזגים, לפיכך, עשוי להוביל למסקנות מדויק. כדי להתגבר על בעיה זו, אנו המציאו שיטה תרבות proximal ללמוד paracrine איתות. סוגי תאים בשני גדלים גם פני קרום בעובי מיקרומטר פוליקרבונט 10 עם נקבוביות מיקרומטר 0.4. הנקבוביות לאפשר החליפין של גורמים המופרש ומעכבות, באותו זמן, juxtacrine איתות. התאים ניתן לאסוף ולהשתמש lysed-נקודת הקצה כדי לקבוע את ההשפעות של האיתות paracrine. בנוסף מאפשר למעברי ריכוז המותאמות לשפות אחרות של גורמים המופרש, שיטה זו היא לבצע ניסויים הקשורים תקופות ממושכות של תרבות, כמו גם השימוש של מעכבי. בעוד אנחנו להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את האינטראקציות בין תאים סרטניים בשחלות התאים mesothelial שהם נתקלים באתר של גרורות, אותה ניתן להתאים לכל סוגי תאים חסיד שני לחוקרים ללמוד paracrine איתות בתחומים שונים, כולל גידול microenvironment, אימונולוגיה ופיתוח.

מבוא

התפקיד של פורה אינטראקציות הדדיים בין תאים סרטניים microenvironment את הגידול בהתקדמות הגידול הוכח גם, הפך מוקד מרכזי מחקר הסרטן ביולוגיה¹. מקרים דומים של איתות דו-כיווניים מכריעים במהלך ריפוי, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה, גומחות תאי גזע, הפצע ובמהלך ההתפתחות^{2,3,4,5,6 , 7 , 8}. נושא משותף כל התהליכים הביולוגיים האלה הוא התאים מגיבים בדרכים שונות כדי רמזים חוץ-תאית מ שלהם microenvironment הקובעים גורל, פיזיולוגיה של רקמות, התקדמות המחלה. לכן, המוקד הפך יותר ויותר לכיוון פיתוח הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים בתקשורת תא-תא כזה. רוב האינטראקציות כזה כרוך paracrine או juxtacrine איתות בין תאים. Paracrine איתות כרוך ההפרשה של גורמים איתות ספציפית בתא אחד אשר נתפסים על ידי רצפטורים המתאימים על תא אחר בסביבה, מפעילה תגובה בה^9,10, ואילו juxtacrine איתות דורש מגע ישיר בין מרכיבי התא לשני תאים מעורב^11,12.

איתות כזה הוא מרכיב קריטי רקמות הומאוסטזיס, כמו גם את microenvironment הגידול. התאים הסרטניים תועלת paracrine גורמים juxtacrine של תאי הגידול stroma, לרבות סרטן הקשורים fibroblasts (CAFs), תאים חיסוניים adipocytes^13,14,15,16. Paracrine איתות להיות מתווכת על-ידי גורמי גדילה, ציטוקינים, נוגדנים, וכדומה, ואילו האיתות juxtacrine כרוך ליגנדים juxtaposed קולטנים חריץ איתות, או אינטראקציות בין אינטגרינים שלהם בהתאמה מטריצה חוץ-תאית חלבונים. הראו את החשיבות של אינטראקציות הדדיים בין תאים סרטניים בשחלות CAFs התקדמות, גרורות הגידול¹⁴. באופן דומה, לווסת האינטראקציות של תאים סרטניים בשחלות metastasizing עם התאים mesothelial כיסוי האתר של גרורות מיקרו Rna מפתח ואת גורמי שעתוק של תאים סרטניים אשר לקדם קולוניזציה גרורתי^{17, 18}.

רוב המחקרים על paracrine איתות לערב את השימוש שנאספו מכל סוג תא אחד להתייחס את סוג התא השני עם מדיום ממוזגים. בעת גישה זו כבר בשימוש נרחב, זה ביעילות לא לשכפל את רמות ריכוז גבוהה המותאמות לשפות אחרות של הגורם המופרש microenvironment של התא המקבל. זה גם לא יצליח לשחזר את קינטיקה של הזרם רציפה של הגורם המופרש שיופקו בתא אחד, שהתקבלו על-ידי התא הסמוך. Paracrine איתות יעילה במרחקים קצרים כמו הגורמים המופרש נמצאים בריכוזים נדרש רק בקרבת מקור התא, נוטים לפזר ו לדלל את המרחק גודלת. זה הריכוז הגבוה המותאמות לשפות אחרות של הגורם המופרש חיונית כדי לעורר תגובה התא קולטן. יתר על כן, התגובה בתאים הנמען הוא גם תלוי האיזון של דלדול רציפה שלהם דרך השפלה, איגוד, הפנמה תאים הנמען, דיפוזיה מן התא מקור וגורמי לאחרונה המופרש. ממוזגים בינוני יכול להיות מרוכז לחשבון עבור ריכוז מקומי גבוה נוכח microenvironment, אבל זה לא במדויק לשכפל את הריכוזים המדויק. יתר על כן, זה לא יכול לחקות את קינטיקה הטבעית של ייצור, דלדול של הגורם מעורב. באופן מדויק יותר לשכפל paracrine איתות ולהפריד אותו מן juxtacrine איתות מנגנונים, אנחנו המציאו שיטה תרבות proximal חדשניים, אשר כולל גוברת על סוגי תאים שני במשטח או של קרום נקבובי. הנקבוביות הם קטנים מספיק כדי למנוע juxtacrine אינטראקציות, עדיין לאפשר החליפין של גורמים המופרש בריכוזים גבוהים לשפות אחרות. בדרך הזאת, המערכת שומרת את קינטיקה של ייצור, דלדול של הגורמים paracrine.

פרוטוקול

הפרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של לוח רגולטוריים מוסדי של אינדיאנה האוניברסיטה.

1. תא הכנה

1. בידוד של התרבות התאים mesothelial האנושית ראשי
   1. ולבודד ראשי התאים mesothelial האנושית (HPMCs) מ omentum האנושי כפי שתואר לעיל^17,18 . ותגדל אותם להשלים את מדיום הגידול [בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) המכילה סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו וויטמינים 1%]-CO 37 ° C ו-5%₂.
      הערה: HPMCs גדלים בדרך כלל 100% הנהרות (איור 1 א').
2. תנאי הגידול של תאים סרטניים בשחלות
   1. לגדול HeyA8 תאים סרטניים בשחלות במדיום גידול מלאה-CO 37 ° C ו- 5%₂.
      הערה: שימוש HeyA8 תאים בוגרים עד כ 80% הנהרות (איור 1B).

2. תרבית תאים

1. הגדרת התרבות צינתור
   1. שימוש Transwell מוסיף עבור 6-ובכן לוחות עם קרום μm בעובי רקמת תרבות-שטופלו פוליקרבונט 10 עם μm 0.4 נקבוביות (10⁸ נקבוביות/cm²) ואזור הגדילה 4.67 ס מ² . אם יש צורך, למטב לגדלים שונים הוספה בעזרת שינוי מספר התאים נזרע על פי הצמיחה את פני השטח. מדיום הגידול מלאה חמה טריפסין, באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עד 37 ° C לפני השימוש.
2. הכנת את המכסים
   1. כדי להפיץ את התאים HeyA8 על המשטח התחתון של הקרום של הקדמי, הסר את תותב מאריזתו באמצעות מלקחיים סטרילי ולמקם אותו הפוך לצלחת תרבות סטרילי 15 ס מ.
   2. השתמש צלחת 15 ס מ, שכן יש את עומק כדי להכיל את תותב הפוכה, או תחליף את זה עם שום מיכל סטרילי המתאים. בהתאם הניסוי, הכנס את המספר הנדרש של מוסיף המנה 15 ס מ.
   3. תווית הפקדים, שלושה תנאים ניסיוני בהתאם עם סמן על קצה השרוול.
3. הכנת התאים הסרטניים
   1. כדי trypsinize את התאים HeyA8 גדל ב- 80% הנהרות בבקבוקון² 25 ס מ (~ 2 x 10⁶ תאים), להוסיף 1 מ"ל של טריפסין (0.25%) עבור s 40-60 ולנטרל את טריפסין עם 6 מ של מדיום הגידול מלאה.
   2. Centrifuge התאים ב x 500 g בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב 5 מ של מדיום הגידול מלאה. לספור את התאים הפועלים בשיטת אי-הכללה של צבע כחול של trypan.
4. זריעה של תאים סרטניים
   1. להשעות 100,000 תאים למ"ל של תאים חיים HeyA8 במדיום גידול מלאה. בזהירות זרע 80,000 HeyA8 תאים הושעו ב 800 μL של מדיום הגידול המלא בתחתית תותב (אשר כעת מול, מאז זה היא הפוכה).
   2. זרע התאים כדי ליצור צורת הכיפה, כמו אז התאים נשארים על תותב (איור 1C). מהמרכז של הקרום ומתחילים לנוע כלפי חוץ במעגלים תוך לאט pipetting. הימנע הולך יותר מ 3 מ מ מהקצה כדי למנוע כל שפיכת המדיום.
      הערה: מספר התאים נזרע תלויות הצמיחה של התאים ושל משך הניסוי. מספר התאים HeyA8 נזרע לתרבות הזאת צינתור אופטימציה, התאים יהיה 80-90% confluent בסוף היום השלישי.
5. סרטן התא מצורף
   1. מכסים את הכלי 15 ס מ ולהעביר בזהירות את המנה המכיל את המכסים את החממה₂ CO. זה חיוני לא לשבש את טיפת בינוני ותאים על תותב בשלב זה. להשאיר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות לאפשר את התאים הסרטניים לצרף הכנס.
6. הכנת התאים mesothelial
   1. לאחר כ 4 שעות, trypsinize את HPMCs גדלו ב 100% הנהרות בבקבוקון² 75 ס מ (~ 4 x 10⁶ תאים) עם 2 מ של טריפסין (0.25%) 1-2 דקות, לנטרל את טריפסין עם 12 מ של מדיום הגידול מלאה.
   2. Centrifuge התאים ב 500 x g ב- RT למשך 3 דקות, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום הגידול מלאה, ולספור את התאים הפועלים בשיטת אי-הכללה של צבע כחול של trypan.
7. זריעה התאים mesothelial
   1. להשעות 300,000 תאים למ"ל של HPMCs בשידור חי במדיום הגידול מלאה. להוסיף 2.5 מ של מדיה טריים צמיחה מלאה כל טוב של צלחת 6-. טוב. בקפידה להביא את המנה 15 ס מ המכיל את המכסים את מכסה המנוע אבטחה. באמצעות מלקחיים סטרילי, להפוך את תותב ומניחים אותו בתוך הבאר של צלחת 6-ובכן כך הוא זקוף, עם תאי HeyA8 המחובר למשטח התחתון שקוע בתוך מדיום הגידול מלאה (איור 1C).
   2. HPMCs זרע 450,000 הושעו ב- 1.5 מ של מדיום הגידול בתוך החלק הפנימי של התוספות עם תאי HeyA8 אל פני השטח פונה לחלק התחתון של הבאר (איור 1C) או מוסיף ללא תאים HeyA8 עבור הפקדים HPMC. להוסיף 1.5 מ של מדיום הגידול ללא תאים לפקדים HeyA8.
8. גדל את התרבות צינתור
   1. תן את התרבות proximal לגדל בחממה CO₂ -37 ° C ו- 5% CO₂ עבור 72 h. אם נדרש, המדיום ניתן לחידוש כדלקמן.
      1. הפנימי של תותב, להסיר 750 µL ולהוסיף µL 750 של מדיום הגידול שלם טרי.
      2. על החלק החיצוני של תותב (לוח 6-טוב), להסיר 1 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול שלם טרי. 1 mL נבחרה עבור הנוחות של שינוי המדיום בצעד אחד. אם רצונך בכך, 1.25 mL יכול להיות הוסר, החליף במקום.
9. איסוף התאים
   1. לאסוף את התאים לאחר 72 h של תרבות הפרוקסימלית. לקחת טיפול מיוחד בשלב זה כדי למנוע זיהום צולב בין התאים HeyA8 HPMCs. Trypsinize את התאים, centrifuge אותם, ואת lyse בגדר במקום התאים על קרום למניעת זיהום צולב של lysing.
10. Trypsinizing תאים
    1. לשטוף את שני צידי תותב עם 1 x PBS.
    2. להעביר את הכיסויים באר חדשה והוסף טריפסין. להוסיף 0.5 מ של טריפסין הפנימי של תותב ולהוסיף 2 מ של טריפסין לצלחת 6-טוב כדי trypsinize את התאים הסרטניים המצורפת המשטח התחתון של הקדמי. דגירה את הצלחת למשך 2 דקות ב 37 º C.
11. נטרול של טריפסין
    1. להוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול מלאה בתוך התותב, כדי לנטרל את טריפסין, פיפטה למעלה ולמטה, לקחת את התאים ואז להעביר אותם ל צינור אוסף תוויות. הוסף אוטם 2 נוספים של מדיום הגידול מלאה על נטרול מוחלט. צריך לקחת לא לחדור את הקרום בעת pipetting כדי למנוע של זיהום צולב של התאים.
    2. כדי לאסוף את התאים על החלק התחתון של הקדמי, pipette של טריפסין 2 מ"ל שנוסף בשלב 12.2 על גבי המשטח התחתון 2 – 3 x כך התאים ליפול לתוך החלק התחתון של הלוח 6-. טוב. לנטרל את טריפסין בתחתית הצלחת עם 6 מ של מדיום הגידול ולהעביר את התוכן של הצלחת צינור אוסף תוויות.
12. איסוף של lysing את התאים
    1. Centrifuge התאים ב x 500 g למשך 3 דקות, וארוקן את המדיה. Resuspend ואת lyse כדורי תא 0.7 מ של ריאגנט פירוק פנול guanidine thiocyanate-מבוססות על החילוץ RNA. לבודד את הרנ א באמצעות כל ערכת מתאימים.

3. תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת

הערה: השלבים הבאים מתארים את תגובת שרשרת כמותיים פולימראז בזמן אמת (qPCR) ללמוד את השינויים ביטויים ג'ין בעקבות התרבות הפרוקסימלית.

1. היכונו cDNA מדגימות RNA qPCR. השתמש רוורס טרנסקריפטאז מתאימים לכל עם מאגר המתאימים, תחל אקראי כדי להבטיח שעתוק לאחור של כל ה-mRNA (ראה טבלה של חומרים).
2. להעריך את השינויים ברמות ביטוי mRNA של fibronectin (FN1) ו- E-קדהרין (CDH1), גורם הגדילה בטא 1 (TGFβ1) על ידי qPCR עם גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) כפקד פנימי של שינוי צורה. זה אפשרי להשתמש מתוקננת מבחני ביטוי גנים זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים) או לעצב תחל.
3. להשוות את התאים HeyA8 גדלו בתרבות צינתור עם HPMCs עם הפקדים HeyA8, את HPMCs גדלו בתרבות צינתור עם הפקדים HPMC.

תוצאות

Metastasizing תאים סרטניים בשחלות נתקלים התאים mesothelial באתר של גרורות בתוך חלל הצפק¹⁹. אינטראקציות paracrine ו- juxtacrine פרודוקטיבי בעזרת התאים mesothelial ב גרימת תגובות מסתגלת בתאי סרטן השחלות, אשר מאפשרים גרורות מוצלחת^17,18,20,21 . כדי לבדוק את האפקטיביות של שיטת תרבות צינתור, בדקנו את האינטראקציות paracrine בין תאים סרטניים בשחל...

דיון

הבנת המנגנון של paracrine ו- juxtacrine איתות בין תאים חיוני לפיתוח ידע טוב יותר של הרקמות הומאוסטזיס ומחלות תנאים^7,8. רוב paracrine איתות הלימודים מתנהלים על ידי איסוף ממוזגים בינוני בין תא אחד סוג משתמש בו כדי לטפל בסוג התא השני. בשיטה זו יש יתרון הפשטות הטבועה. עם זאת, זה לא מדויק מסכם את הדברים את ריכוזי הגורמים המופרש microenvironment הסלולר מקומי או את קינטיקה של ייצור, דלדול של הגורמים המעורבים. בעוד שהראשון ניתן לטפל במידה מסוימת, אבל לא במדויק, על ידי רי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיכה חדירה של Transwell 24 מ"מ עם 0.4 ומיקרו; m נקבוביות פוליקרבונט קרום הכנסת קרום	(Costar)	3412	• 10 ומיקרו; קרום פוליקרבונט שקוף עבה מ ושור; מטופל לחיבור תאים אופטימלי ושור; ארוז 6 תוספות בצלחת 6 בארות, 4 צלחות למארז ושור; יש לצבוע את הממברנה לצורך נראות התא ושור; מעוקר על ידי קרינת גמא
צלחת 6 בארות	קורנינג (פלקון)	353046	תחתית שטוחה, מטופלת TC, סטרילית, עם מכסה
15 ס"מ צלחת תרבית	קורנינג (פלקון)	353025	צלחת תרבית תאים סטרילית, מטופלת
TC DMEM	קורנינג (Cellgro)	10-013-CV
פניצילין סטרפטומיצין	קורנינג	30-002-CI
MEM אמינו לא חיוני חומצות	קורנינג (Cellgro)	25-025-CI
MEM ויטמינים	קורנינג (Cellgro)	25-020-CI
0.25% טריפסין, 2.21 מ"מ EDTA	קורנינג	25-053-CI
סרום בקר עוברי	אטלנטה ביולוגית	S11150
Pipets			כל ייצור הוא
בסדר חממת			כל ייצור הוא בסדר
		רמת בטיחות ביולוגית II	כל ייצור הוא בסדר
FN1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs00998133_m1
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01023895_m1
GAPDH TaqMan Gene Expression מבחן	ThermoFisher Scientific	Hs99999905_m1
miRNeasy מיני RNA ערכת בידוד	Qiagen	217004
ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה	ThermoFisher Scientific	43-688-13
HeyA8 תאי סרטן שחלות	שהושגו ממעבדת ארנסט לנגיל, אוניברסיטת שיקגו
TGFβ נוגדנים מנטרלים	R& די סיסטמס	MAB1835-100

CO2 ארון