ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

סיכום

פרוטוקול זה מתאר גישה ללא כיול עבור לכימות חלבון ההומו-oligomerization במבחנה מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה באמצעות סריקה מיקרוסקופ אור מסחרי. שיטות ניתוח וההגדרות רכישה נכונה מוצגים.

תקציר

מספר ובהירות היא טכניקה ספקטרוסקופיה (FFS) תנודות פלורסצנטיות ללא כיול לגילוי חלבון ההומו-oligomerization. זה יכול להיות מועסק באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי מצויד עם גלאי דיגיטלי. פרוטוקול עבור השימוש הטכניקה במבחנה מוצג על-ידי מקרה שימוש שבו מספר והבהירות ניתן לראות במדויק לכמת המדינה oligomeric של FKBP12F36V mVenus-מתויג לפני ואחרי התוספת של התרופה dimerizing AP20187. החשיבות של שימוש הפרמטרים רכישה מיקרוסקופ הנכונה ואת השיטות preprocessing וניתוח הנתונים הנכונים הם דנו. בפרט, הדגיש את חשיבות הבחירה של תיקון photobleaching. שיטה זולה זו יכול להיות מועסק ללמוד אינטראקציות חלבון בהקשרים ביולוגיים רבים.

מבוא

חלבון אינטראקציות אני חוץ גופית n

באופן מסורתי, קריסטלוגרפיה וניסויים תהודה מגנטית גרעינית בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה (cryoEM) הם הטכנולוגיות שבחרת לתאר במדויק את הארכיטקטורה תלת-ממדי של חלבונים, להסיק שלהם פונקציה על ידי המתחקה אחר פרטיהם מבניים ברזולוציה גבוהה. חלבונים, לעומת זאת, אינם מבנים סטטי ולא ניתן לעבור מגוון של התנודות והשינויים הסתגלותי בזמן ובמרחב. זו הסיבה מדוע מבניים מידע לחקר הגבישים או נתונים CryoEM צריך השלמה עם טכניקות אחרות (למשל, דינמיקה מולקולרית סימולציות וטכניקות מולקולה בודדת): הפונקציה של חלבון קשורה שלה הסתגלותי שינויים אינטראקציות, ואת המידע הזה אינו נוכח בתוך מבנה סטטי. על מנת לחקור דינמיקה מולקולרית התוך, טכניקות בהתבסס על מולקולה בודדת פורסטר תהודה להעביר אנרגיה (smFRET) הן יעיל מאוד¹. גישות אלה מסוגלים להעריך subpopulations שונים של מולקולות מורכבות בתקשורת. זה חשוב מאוד, כמו שינויים אלה מהירים להתרחש במהלך רכישת הנתונים (קרי, הננו לטווח השני).

שתי גישות עיקריות מועסקים בדרך כלל כדי לזהות ולכמת שינויים אלה: חלבונים פתרון ואת השטח-הנייח. איתור של האינטראקציות הבין-מולקולריות ובמיוחד, התהליך של dimerization המושרה על ידי ליגנדים, smFRET אינה תמיד הכלי הטוב ביותר. אכן, סריג תלוי לא רק על המרחק (≈10 ננומטר), אלא גם על הכיוון של שני הדיפולים (התורם ולא מקבל, χ²) ונמצא החפיפה של הפליטה תורם עם ספקטרום הבליעה של מקבל², אבל אולי המצב האחרון הזה חשוב ובלבד experimentalist יכולה בחרה הזוג סריג הנכון. חיסרון מסוים של smFRET דורשים בדיקה ההומו-dimerization נובע תיוג של החלבון עניין: עבור הטרו smFRET, dimerization ניתן רק זוהה עד 50% (קרי, הטרו-סריג יהיו רק יכול לזהות את התורם-מקבל, התורם מקבל הומו-הדימרים אך לא תורם-תורם או מקבל-מקבל, המהווה השני 50% הדימרים). השימוש של קרינה פלואורסצנטית המתאם ספקטרוסקופיה (FCS) נגזרים (FCCS, ועוד³) כדי לברר חלבון דיפוזיה קבועים, איגוד קבועים במבחנה הוא חלופה אחרת. גישות אלה אינם מסוגלים לחלוטין לכמת ההומו-dimerization גם, כמו FCS אחד האמצעים מקדם ריכוז, דיפוזיה, ואת רדיוס דיפוזיה של חלקיק באמצעי תלויים בצורה לא טובה המשקל המולקולרי; עלייה 10-fold משקל מולקולרי רק לרמוז לדוגמה שינוי 2.15 לקפל מקדם דיפוזיה⁴. במקרה של FCS שני צבעים או FCCS, רק 50% של הומו-הדימרים יראו מאותה סיבה כמפורט לעיל. גישות מעשיות ביותר כמותיים כדי לזהות הומו-dimerization במבחנה וב -vivo הם הומו-סריג⁵ , מספר, בהירות (N & B)⁶. בהתחשב בעובדה הומו-סריג דורש שחזור במכשור ספציפי של הערך חיזקו (קרי, אופטי/אנלייזרים יסודות לשחזר את קיטוב מקבילים, בניצב), N & B מוצג כאן כמו טכניקה חיובית מזהים חלבון ההומו-dimerization, צבירה. זה יכול להיות מועסק גם במבחנה וגם ויוו עם תחבולה מסחרית.

מספר ובהירות

N & B כבר שנסקרה לאחרונה⁷. הביקורת התמקדה ביישום הטכניקה תאים חיים. זה משתלם כדי לשכפל פורמליזם מתמטי כאן משוואות אלה יוחלו על הנתונים שנאספו בתוך חוץ גופית. ראשית, יש צורך להגדיר כמה מונחים וכמויות מתמטי:

• ישות היא קבוצת מולקולות אשר קשורים אחד לשני.
• חדוה הבהירות של ישות הוא המספר של פוטונים שהוא פולט ליחידת זמן (לכל מסגרת).
• n הוא המספר של ישויות הנוכחי.
• של פיקסל נתון במהלך סדרות התמונה, < I > הוא שלה כלומר עוצמת ו σ² הוא השונות בעוצמתה.

לאחר מכן, עם ספירת פוטון גלאי, בהנחה ישויות ניידים, ללא רקע,

כאשר N הוא מספר לכאורה ו- B זה בהירות נראית לעין. התוצאה היא

דלאל. et al. ⁸ הראה כי עם ציוד אנלוגי, אחד צריך תיקון 3 תנאים: על גורם S, על רקע היסט, רעש readout σ₀². לאחר מכן, שוב בהנחה ישויות ניידים,

נותן

שימו לב כי המשוואה הנ עבור שונה זה נתון דלאל. et al. ⁸ וסקירה עוקבות. ⁷ ב דלאל. ואח ה- S במכנה הושמט בשל טעות דפוס, שגיאה זו שוכפלה על הסקירה. המשוואה הנ ל היא הנכונה. הנחיות למדידת S, σ והיסט₀² - יחד עם הסבר על משמעותם - ניתנים על-ידי דלאל. et al. ⁸

חדוה הבהירות הוא יחסי המדינה oligomeric של הישויות באמצעי: חדוה יהיה פעמיים גדול עבור הדימרים כמו זה מונומרים, גדולה פי שלוש עבור trimers כפי שהיא מונומרים, פעמיים גדול עבור hexamers כפי שהוא trimers וכן הלאה. בדרך זו, מודדים את הבהירות חדוה, אחד יכול לכמת כל סוג של multimerization.

אם יש תערובת של oligomeric הברית הנוכחי, מספר והבהירות אינה מסוגלת להתאושש הברית oligomeric בודדים הנוכחי. זוהי מגבלה של הטכניקה.

Detrend אלגוריתם ותוכנות nandb

החשיבות של תיקון עבור photobleaching כבר הדגיש בעבר⁹. Photobleaching באופן בלתי נמנע מתרחשת במהלך הניסויים מיקרוסקופ אור במצב זמן לשגות; שניהם תאים חיים, חוץ גופית בתוך. גישות רבות תוארו בספרות לתיקון הלבנת⁷. טכניקת סינון מעריכית עם בחירה אוטומטית של פרמטר detrending T הוא הטוב ביותר הנוכחי. היא משולבת לתוך nandb תוכנה חופשית, קוד פתוח⁹. אכן, תוכנה הדורשים מהמשתמש לבחור באופן ידני את הפרמטר detrending שלהם יכול לגרום תוצאות שגויות בגלל בחירה פרמטר זו צפויה להיות שרירותי של שגוי. האלגוריתם אוטומטיים בודק את הנתונים וקובע את הפרמטר המתאים, ללא צורך התערבות המשתמש⁹. אפילו עם הבחירה הטובה ביותר של פרמטר המחליק, detrending יש מגבלות משלו ועובד היטב רק עם photobleaching אחוזים נמוכים יותר 25%, כפי שמוצג עם סימולציות⁹. מעניין, בעת שימוש השגרה detrending אוטומטי, רמת הדיוק שלה היא כזאת אחד יכול לעבוד עם ערכי בהירות נמוכה (אפילו B < 1.01), ומכאן עוצמות, והנמוכות עדיין להיות מדויק מספיק כדי לכמת את ההומו-dimerization.

Photobleaching גורם גם בעיה נוספת: הנוכחות של photobleached fluorophores ב multimer מורכבים. זה עושה למשל, trimer נראות דיימר כאשר אחד של שלוש יחידות ב trimer הלא-פלורסנט. עובד, מולר¹⁰ הראה כיצד לתקן בשביל זה, תיקון זה הודגש גם ב- סקירה עוקבות⁷. התוכנה nandb כולל תיקון זה⁹.

FKBP12 F36V מערכת

FKBP12F36V הוא חלבון אשר לא oligomerize באופן טבעי אך ידוע dimerize עם התוספת של AP20187 סמים (המכונה בפיהם BB dimerizing ליגנד)^11,12. זה עושה את זה מקרה מבחן אידיאלי עבור מספר והבהירות: עם FKBP12F36V עם תוויות ברורות, הכפלה של מדינת oligomeric צריך להקפיד על תוספת של BB.

פרוטוקול

1. FKBP12 F36V - mVenus טיהור

1. להפוך תאים pLysS (DE3) עם וקטור pET22b המכיל monomerized FKBP12F36V האנושי¹² ו- His6 N-מסוף ותגי mVenus (וקטורית זמינים על פי בקשה). צלחת תאים על גבי אגר LB בתוספת 50 µg/mL אמפיצילין, 34 µg/mL כלורמפניקול.
2. העברת המושבות טרנספורמציה לתוך התרבות סטרטר 100 מ ל LB ולגדול 16-20 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס ברעידות.
3. לדלל starter צפופה התרבות (OD600 > 1) מטריים במדיום ליברות (2 x 500 מ"ל אצוות) לגדול במשך 2-3 שעות כדי OD600 = 0.6 - 0.8 (37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד).
4. תרבויות מגניב על קרח. זירוז עם 250 מיקרומטר IPTG ולגדול 16-20 שעות ב 21 ° C, 200 סל ד.
5. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 2,000 x g במשך 20 דקות.
6. Resuspend צנפה ב- 40 מ של מאגר ה-IMAC (20 מ מ סודיום פוספט pH 7.5, 500 מ מ NaCl, imidazole 3 מ מ, מ מ 1 β-mercaptoethanol) בתוספת EDTA נטול מעכבי פרוטאז (1 טבליה לכל תא גלולה).
7. Sonicate תאים (500 וואט, 20 kHz, 40% משרעת, 9 עליך, 11 s. למשך 15 דקות) על חומר מסיס קרח ו הקציר על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g.
8. העברת מסיסים lysate אל בקבוק חרוט ולהוסיף 2 מ"ל של שרף (ראה טבלה של חומרים). תקופת דגירה של שעה עם סל"ד 105 סיבוב
   הערה: sepharose ניקל עשוי לשמש גם בשלב זה IMAC.
9. הקציר שרף, לשטוף עם 250 מ ל IMAC מאגר A ואחריו 500 מ ל IMAC מאגר B (20 מ מ סודיום פוספט pH 7.5, 500 מ מ NaCl, imidazole 7 מ מ, מ מ 1 β-mercaptoethanol).
   הערה: להגדיל את imidazole 50 מ מ, אם באמצעות שרף sepharose ניקל.
10. Elute מתויג His6 חלבון באמצעות מאגר IMAC C (20 מ מ סודיום פוספט pH 7.5, 500 מ מ NaCl, imidazole 300 מ"מ, 1 מ מ β-mercaptoethanol).
11. מזריקים על הדרה גודל עמודה (ראה טבלה של חומרים) equilibrated ב- 10 מ מ HEPES pH 7.5, 150 מ מ NaCl, 1 מ"מ DTT. FKBP12F36V יש שלה • תנאי שיא mL 87.71 על העמודה השתמשנו.
12. להעריך את טוהר דרך עמוד מרחביות ובריכה, להתרכז כנדרש.

2. הכנת מערך צלחת Multiwell

1. להפשיר את FKBP12F36V מטוהרים (או הנקרא חלבון עניין) מ-80 מעלות צלזיוס.
2. להכין פתרון של 100 ננומטר מטוהר FKBP12F36V (בינונית, 10 מ מ HEPES pH 7.5, 150 מ מ NaCl, 1 מ"מ DTT). Sonicate, צנטריפוגה (מהיר הספין של 13,000 סל ד) כדי למנוע היווצרות של אגרגטים.
3. Pipette µL 100-200 לתוך חדר התצפית טוב 8 עם חלק תחתון זכוכית.
4. הוסף את dimerizer BB ריכוזים הסופי של 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ו- 500 ננומטר^12,13.
5. כאסמכתא, להכין פתרון של 100 ננומטר של mVenus לבד כדי להעריך את תופעות אפשריות צבירת והמשקעים ולשחזר את ערך הבהירות מונומר את אותן הגדרות רכישה.

3. רכישת כיול ללא קונפוקלי

1. להפעיל את מערכת קונאפוקלית (איור 1). כל האור מיקרוסקופ קונפוקלי מערכת סריקה מצויד עם גלאי דיגיטלי או אנלוגי מאופיין היטב גלאי⁸, מסוגל להחזיק זמן להתעכב קבוע עבור כל פיקסל רכש יעבוד.
2. להגדיר את נתיב קרן עירור:
   1. הפעל את ננומטר לייזר 514 ואת ערכת זה ב 20-100 nW כוח ביציאה של המטרה (עבור FKBP12F36V-mVenus).
   2. בחר את המטרה 63X1.4NA או צווארון תיקון מים טבילה מטרה מיועד FCS.
   3. הפעל אחד HyD, APD או גלאי PMT מכוילת. גלאי מסוגל לספור-פוטון עדיפים, כמו במקרה זה, החישוב של S, היסט ו σ₀² אינם נחוצים.
   4. בחר חלון פליטה nm 520-560
   5. להגדיר את חריר 1 יחידה אוורירי עבור nm התואם פליטת ~ 545.
   6. הגדר את מצב רכישה-16x16 פיקסלים
   7. להגדיר את הפיקסל להתעכב זמן t_לשכון כך היא מספקת את t_מסגרת >> T_D >> t_להתעכב, איפה _D זמן מגורים של פעולות ה באמצעי חלבון ו- -t _מסגרת היא קצב המסגרות. התאים כדי הגדרת הזמן להתעכב µs ~ 13.
      הערה: חלק מהיצרנים המסחרי היה סורקים כי לא שמרתם הזמן להתעכב לפיקסל מתמדת. קביעות זו חיונית עבור פעולת השירות לעבודה.
   8. להגדיר את גודל פיקסל-~ 120 ננומטר.
   9. בחר את מצב רכישת xyt ובחר מספר המסגרות כדי לרכוש לכל רכישה ומכירה היטב (לדוגמה 5,000).
   10. אם המערכת מצויד מצב תפוקה גבוהה, מציגים את נקודות הציון של כל טוב ואת מספר רכישות לכל טוב כדי להפוך את התהליך לאוטומטי.
       הערה: להיות זהירים כדי להבטיח הנוכחות של מתקן מים עבור אם משתמש אובייקטיבית טבילה.
   11. אם המערכת הינו מצויד עם מערכת זלוף, לטעון את הפתרון BB, לתכנת זלוף להתחיל נכון-אחרי המסגרת^th 5000 כדי להעריך את קינטיקה של dimerization בעת רכישת למשל, 10,000 תמונות.
3. להוסיף טיפה של שמן לתוך המטרה טבילה בשמן / מים אם ניצול צווארון תיקון מים טבילה מטרה מיועד FCS.
4. הר לחדר התצפית טוב 8 אל הבמה.
5. בחר את הבאר הנכון ולהתמקד על הפתרון.
   הערה: חשוב: להימנע מיקוד קרוב הזכוכית התחתונה כדי למנוע השתקפות פיזור. בעת התמקדות עמוק יותר לתוך הפתרון, נתק את האפשרות פוקוס אוטומטי.
6. להתחיל הרכישה ולשמור את ערימת תמונות שנוצר בתבנית TIFF.

4. detrend וניתוח בהירות באמצעות nandb את החבילה R

1. כמו בדיקת איכות preprocessing, להשתמש ImageJ¹⁴ כדי להעיף מבט התמונות ולשחזר לפרופיל בעוצמה, כפי שמוצג באיור 2. פעולה זו שימושית לקבוע אם לאו photobleaching מדי. אם יש יותר מדי מלבין, הנתונים אינו מתאים ניתוח נוסף.
   הערה: ImageJ ניתן גם שימושי להמרת תמונות TIFF מתבניות מסחרי. התוכנה nandb המתוארים להלן יכול לעבוד רק עם קבצי TIFF.
2. הורד והתקן^15,R ו- RStudio¹⁶. מומלץ להוריד ולהתקין R קודם, ואז RStudio.
   הערה: להלן הוא תיאור של כיצד להשתמש בחבילת nandb R. ידיעת השפה R לא נדרש להשתמש nandb, אולם זה יהפוך את החיים קלים יותר.
3. התקן את החבילה nandb.
   1. פתח את RStudio ואת במסוף, הקלד install.packages("nandb") והמתן ההתקנה.
4. להכיר nandb
   1. סקירת ה-¹⁷ידנית.
   2. עיין בעזרה RStudio מובנה של פונקציות שונות. הפונקציה סביר כדי לשמש יהיה שימוש יהיה brightness(). הצג את קובץ העזרה עבור פונקציה זו על-ידי הקלדת? brightness() במסוף.
5. לחשב את הבהירות
   1. נגיד יש קובץ התמונה על שולחן העבודה שנקרא img001.tif (שים לב 'nandb' עובד רק עם קובצי TIFF). ניתן לחשב את הבהירות של התמונה:
      b <-בהירות ("~/Desktop/img001.tif", טאו = "אוטומטי")
      1. זה מקצה את הבהירות של התמונה b משתנה ב- R. טאו = "אוטומטי" מבטיחה כי התמונה כראוי detrended לפני חישוב בהירות. הדבר השכיח ביותר לעשות מכאן היא לחשב את ממוצע או החציוני הבהירות של התמונה. אחד ניתן לעשות זאת על-ידי הקלדת mean(b) או median(b). אחד יכול גם לכתוב את בהירות התמונה לשימוש שולחני
         ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. אומרים יש תיקיה של תמונות images_folder על שולחן העבודה, צריך לחשב את brightnesses של אלה תמונות ולכתוב את התמונות בהירות כקובצי TIFF. ואז רואה? brightness_folder(). פונקציה זו מעבד תיקייה שלמה בבת אחת:
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", טאו = "אוטומטי")
      . זה טוב במיוחד למי יש תוכנה שהם מעדיפים R, כי כל הקבצים יעובדו לפי פקודה יחידה אחת ולאחר מכן אחת יכולה להמשיך. לעבוד עם תמונות TIFF בהירות פלט בתוכנה שבחרת שלהם, אם זה ImageJ¹⁴ , פיתון או משהו אחר.

תוצאות

Detrending ובהירות monomeric

לאחר הנתונים הושגה אחד יכול להפעיל את החישובים בהירות כדי לקבוע את מצב oligomeric של החלבון עניין בהפתרון. גם אם ההשפעה של הלבנת בפתרון לא יכול להיות קיצוני כמו זה ניתן ויוו, המעקב בעוצמה עדיין כנראה לא יהיה אומר נייח, כנראה עקב השפעות photophysical הקשור את fluorophore,¹⁸ , אבל הסיבות מאחורי זה אינם מובנים במלואם. יש לזה השפעה בעת חישוב הבהירות; בעת ...

דיון

N & B היא טכניקה לגילוי multimerization באמצעות אור מסחרי סריקה מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם גלאי דיגיטלי. גישה זו הוא אטרקטיבי למדי בהשוואה ל נקודה אחת FCS, FCCS ו- smFRET כי זה חינם וניסוי בחישוב בהירות היא פשוטה וריכוז עצמאית⁶. זה חשיבות רבה, עם זאת, לתיקון הלבנת ולטווח עוצמת תנודות לפני ביצוע חישובים בהירות⁹; עלייה קלה של בהירות בשל הלבנת וממצאים אחרים עלול להיפרש כצעד שינוי במצב oligomeric (כפי שניתן לראות באיור 2) אם detre...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RosettaTM (DE3) תאי pLysS	Novagen	70956-3
Ampicillin	Sigma Aldrich	PubChem מזהה חומר 329824407
כלורמפניקול	סיגמא אולדריץ'	PubChem מזהה חומר: 24892250
LB תרבית התחלה	QIAGEN
LB בינוני	QIAGEN
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329815691
IMAC buffer	Medicago	09-1010-10
מעכבי פרוטאז ללא EDTA	סיגמא אולדריץ'	11873580001
שרף TALON	Clonetech
ניקל sepharose	GE Healthcare
S200 16/60 עמודה	GE Healthcare
זכוכית תחתונה 8 באר צלחת תצפית	Ibidi	80827