הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת אספרטט גליצין התווית על-ידי Ga ארגינין (RGD) 68-פפטיד של אנגיוגנזה

6.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58218

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Applied RI, Korea Institute of Radiological and Medical Sciences

במאמר זה

סיכום

אינטגרין3 α βvהוא סוג של חלבון אדהזיה מתבטאת במיוחד בתאי אנדותל מופעל שעברו אנגיוגנזה. לכן, הערכת שלמות אינטגרין הוא עניין רב באונקולוגיה. כאן, אנחנו מציגים שיטה להכין 68התווית על-ידי Ga radiopeptides, שיטה להערכת יעילותו ביולוגי.

תקציר

אינטגרין3 α βvהוא מולקולה אדהזיה heterodimeric מעורב נדידת תאים סרטניים אנגיוגנזה. אינטגרין הוא overexpressed ב האנגיוגנזה אנדותל תאים סרטניים, שבו הוא בדרך כלל ריכוז נמוך. ביטוי ספציפי זה של β αv3 מקל סמן חוקי עבור אנטי-אנגיוגנטי וסמים הדמיה. כמו מודאליות הדמיה תפקודית, טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) מספק מידע אודות הביוכימי פיזיולוגיים משתנה ויוו, עקב רגישות גבוהה הייחודי שלה את המשקל nanomolar. לפיכך, המבוסס על radiometal radiopharmaceuticals מחמד קיבלו תשומת לב רבה עבור כימות לא פולשנית של אנגיוגנזה. מאמר זה מספק פרוטוקול מערכתית כדי להכין פפטיד התווית על-ידי radiometal חדשה על ההערכה של אנגיוגנזה. פרוטוקול זה מכיל מידע אודות המהימנות רדיוכימי, lipophilicity, ספיגת תא, סרום יציבות המאפיינים פרמוקוקינטיים. 68Ga-RGD-פפטיד הוא אחד ליגנדים חיית המחמד נציג לכיוון αvβ3 אינטגרין. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול להכין 68Ga-RGD-פפטיד והערכת יעילותה ביולוגי.

מבוא

אנגיוגנזה היא תהליך ביולוגי זה מאופיין על ידי ההתפתחות של כלי דם חדשים. בין גורמים רבים angiogenetic,vα β3 אינטגרין מזוהה עם invasiveness, כי אינטגרין מתבטא מאוד בכלי גידול האנגיוגנזה אבל נעדר הרקמות1.

פפטידים איגוד קולטן radiolabeled עם התחום אספרטט (RGD) גליצין ארגינין, אשר יש זיקה גבוהה כלפי β α-v3 אינטגרין קולטנים, נחשבים אנגיוגנזה מבטיח הדמיה סוכנים2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. מספר radiopharmaceuticals נוצרו עבור חיית המחמד ואת תכונותיו ביולוגי יש מאומתים שונים בבעלי חיים8,9,10,11. במונחים רדיונוקלידים, 68Ga יש כמה יתרונות על פני רדיואיזוטופים אחרים. ראשית, יש נגישות גבוהה עבור משתמשים והוא כלכלית יתרון כי ציקלוטרון אינה נדרשת. שנית, 68מבוסס-Ga radiopharmaceuticals לייצר ברזולוציה מרחבית גבוהה בהשוואה טומוגרפיית פליטת פוטון בודד (SPECT), המאפשר כימות מדויקת יותר. לבסוף, 67.71 דקות זמן מחצית החיים של 68Ga עשוי להיות מספיק עבור הכנת פפטידים קטן או חלבונים.

כדי לייצר מתחם יציב עם 68Ga, פותחו chelators רבים. נציג chelators הם diethylenetriaminepentaacetic 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic חומצה (NOTA), חומצה 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic (דוטה), חומצה 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic (תטא) חומצה (DTPA), ו- N, N'-di(2-hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N'-חומצה diacetic (HBED). NOTA דווח להקים קומפלקס יציב מאוד עם 68Ga (יומן יציבות מתמדת 30.98)12,13,14.

מטרת המחקר הנוכחי היא לספק פרוטוקול תמציתי לפיתוח radiopeptide חדש (איור 1). לדוגמה, אנו מכינים 68התווית על-ידי Ga RGD-פפטידים ושיטות הנוכחי הערכת ביולוגיים אלה מקבילים במודל xenograft.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות על טיפוח ועל שימוש של מחקר חיות תחת פרוטוקולים אושרה על ידי קוריאה המכון של רדיולוגי רפואי מדעי בעלי חיים ועדת. כל ריאגנטים, ממיסים היו שנרכשו, ללא טיהור נוסף. . טרייסי-RGD-פפטידים הוכנו על פי ספרות שיטות15.

התראה: 68Ga פולט פוזיטרון והן קרני גמא. כל הניסויים, כולל קשר ישיר או עקיף עם חומרים רדיואקטיביים, חייב להתבצע על ידי אימן, מותר רק סגל. בעת טיפול בחומרים רדיואקטיביים, ציוד מגן מתאים מיגון, קרינה לדוקטור התג, טבעות, מד הסקר אמור לשמש.

1. radiolabeling את RGD-פפטידים עם 68GaCl3

הערה: 68Ga (t1/2 = 68 דקות, β+ = 89% ו EC = 11%) היה המתקבלים 68Ga /68ג ' נרל אלקטריק גנרטור.

  1. Elute את 68GaCl3 מן הגנרטור עם 4 מ"ל של 0.05 M HCl.
  2. נקה עם גז חנקן ב 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לייבוש 68GaCl3 (333 kBq, 1 מ"ל) בבקבוקון התגובה מ.
  3. להוסיף פתרון של RGD-פפטיד (100 µg) ב 1 מ' סודיום אצטט (100 µL, pH 5-6) התגובה למבחנה המכילה 68GaCl3 מ שלב 1.2.
  4. מחממים את התערובת התגובה ב 80 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. . אז, תירגע עד לטמפרטורת החדר.
  5. לטהר את המוצר גולמי עם ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC). להשתמש במערכת הבאים: עמודה C-18, קצב זרימה של 0.5 mL/min, מדרון הדרגתי של acetonitrile של 1.17%/min (5% - 40% 30 דקות), ורכיבים • תנאי: A = 0.1% חומצה trifluoroacetic (TFA) acetonitrile, B = 0.1% TFA במים.
    הערה: HPLC מצויד גלאי מערך פוטודיודה, גלאי קרינה רדיואקטיבית. 68Ga-RGD-פפטיד נאסף בזמן השמירה של 12.5 דקות (איור 2).
  6. לטהר וכתוצאה מכך 68Ga-RGD-פפטיד באמצעות מערכת מיצוי מעבדתי.
    1. להעביר את הפתרון באמצעות מחסנית הפוכה-פאזי סי18, לשטוף עם 2 מ ל תמיסת מלח.
    2. Elute 68Ga-RGD-פפטיד עם 0.7 מ של 95% אתנול. הסר הממס ב 80 ° C תחת גז חנקן כעשרים דקות, לשקם עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) לפני השימוש.
    3. לסנן את המוצר radiolabeled דרך מסנן סטרילי מיקרומטר 0.22 ולגבש ב 1 מ"ל תמיסת סטרילית.
  7. בדוק את התשואה רדיוכימי על ידי רדיו-דק-שכבה כרומטוגרפיה (TLC).
    1. במקום 1 µL בצלחת כרומטוגרפיה מיידית שכבה דקה (ITLC, 10 ס מ אורך). לפתח את הצלחת בתוך תא המכיל את eluent (חומצה ציטרית 0.1 M מימית, pH 5.0) עד 9 ס מ מן המקום.
      הערה: הגורם השמירה עבור 68Ga-RGD-פפטיד הוא 0, והוא הגורם השמירה עבור unreacted 68Ga3 + 1.
  8. לחשב את הפעילות המסכמת ספציפי מן היחס של רדיואקטיביות המקביל הלא-הרדיואקטיביות כמו MBq/nmol.
    הערה: לאחר ההזרקה של 100 µL של ניסח 68Ga-RGD-פפטיד כדי HPLC, הכמות של רכיב שאינו רדיואקטיבי מחושב של עקומת כיול סטנדרטי באמצעות nonradioactive Ga-RGD-פפטיד.

2. במבחנה ספיגת הסלולר

הערה: אופסלה 87 Glioma ממאירים (U87MG) גליובלסטומה האדם התאים גדלו בתקשורת הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), בתוספת 10% עוברית שור סרום ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. התאים גדלו במנות 150 מ מ- 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO2. התאים היו לקצור או על-ידי trypsinization: 0.25% (w/v) טריפסין וחומצה 0.02% (w/v) ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב- PBS ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.

  1. תאי זרע תאים U87MG לוחות 6-ובכן-צפיפות של עונה 1 פרק 10 6/טוב.
  2. דגירה התאים עם 68Ga-RGD-פפטיד (111 kBq) ב 37 ° C 30, 60, 90 של דגימות הכן מינימלית 120 דולר.
  3. לשטוף את התאים 2 x 2 מ של PBS ו הקציר על-ידי trypsinization. השתמש טריפסין 0.25% (w/v) וחומצה ethylenediaminetetraacetic 0.02% (w/v) (EDTA) ב- PBS ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
  4. לאסוף את התא ההשעיה (500 µL) ולמדוד בγ-מונה.
  5. לחשב את שיעור קליטת המתחם על ידי התאים ב- % (סעיפים ב ספירת תאים/סה כ).

3. במבחנה סרום יציבות

  1. להוסיף 500 µL של העכבר הטרי נסיוב µL 500 בנסיוב אדם, µL 500 ל- PBS. דגירה התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
  2. להעריך על ידי ITLC ב מרווחי הזמן (30, 60, 90 ו- 120 דקות). מקום 1-2 aliquot µL של התערובת לצלחת ITLC (שלב ניידים: חומצה ציטרית 0.1 M). לפתח את הצלחת כמו שלב 1.7.
    הערה: 68Ga3 + צפוי לעבור עם חזית הממס, ואילו המתחם שכותרתו יישאר על המקור.

4. קביעת Lipophilicity

  1. הוסף 68Ga-RGD-פפטיד (3.7 MBq, 3.7 µL) למערכת octanol-PBS (1:1, וי/v, סה כ 1 מ"ל).
  2. מערבבים את הבקבוקונים נמרצות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ב 10,000 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. אקח 100 דגימות µL כל שכבה ומדידת הרדיואקטיביות עם γ-מונה. הערך שדווח log P מבוסס על הממוצע של שלוש דוגמאות.

5. גידול מודל

הערה: BALB/c עכברים עירום (6-8 שבועות הישן, נקבה, n = 23) נעשה שימוש במחקר זה. העכברים שלאחר מכן היה ללימודי PET (n = 3), biodistribution (n = 20) כאשר אמצעי האחסון הגידול יגיע 200-300 מ מ3 (1-2 שבועות לאחר ההשתלה).

  1. טען תאים סרטניים 28 גרם, 1/2 אינץ ' אינסולין מזרקים.
  2. מזריקים תאים U87MG (5 x 106) ב µL 100 ל- PBS לתוך האזור הזרוע השמאלית.
  3. עזים ומתנגד את העכבר עם 2% איזופלוריין גז חמצן בזמן הזרקת תאים.
    1. ודא כי מרדימים העכבר על אובדן נסיגה פדלים רפלקס הבאים צובט עם מלקחיים בין האצבעות של הרגל ממש האחוריות. אין להשאיר בעל חיים ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.

6. in Vivo כימות של αvβ3 אינטגרין באמצעות PET

  1. עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין 2% חמצן.
    1. ודא כי מרדימים העכבר על אובדן נסיגה פדלים רפלקס הבאים צובט עם מלקחיים בין האצבעות של הרגל ממש האחוריות. אין להשאיר בעל חיים ללא השגחה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
  2. שים את ראשך במרכז gantry חיית המחמד.
  3. דרך הווריד לנהל את 68פתרון Ga-RGD-פפטיד (7.4 MBq, 200 µL) את xenograft העכבר דגם דרך הווריד של הזנב עבור 1 דקות.
  4. במקביל, לבצע סריקה טומוגרפית במצב רשימה (סריקה דינמי) 150 דקות.
    הערה: הנתונים הגולמיים של חיית המחמד שוחזרו על ידי על-ידי המשתמש מסגרת זמן (כלומר, כל 30 דקות). לאחר הסריקה חיית המחמד, סריקה מיקרו-שחושב טומוגרפיה ממוחשבת (CT) (50 kVp של רנטגן, 0.16 mA) נערך לתיקון הנחתה.

7. Biodistribution Vivo לשעבר

  1. להזריק 68Ga-RGD-פפטיד (0.37 MBq, 200 µL) לתוך וריד הזנב המודל העכבר xenograft. עזים ומתנגד את העכבר עם 2% איזופלוריין גז חמצן במהלך הזריקות.
    הערה: עכברים עירום BALB/c, כפי שמתואר בסעיף 5, היו מחולק ל 4 קבוצות והקריב בנקודות זמן שונות (n = 5 לכל קבוצה).
  2. להעיר את העכברים מיד לאחר הממשל של 68Ga-RGD-פפטיד, להקריב אותם ב 30, 60, 90, 120 דקות postinjection עם פחמן דו-חמצני המתת חסד.
    הערה: הרקמות עניין חולצו. יעדים נבחרים היו דם, שרירים, הלב, ריאות, כבד, טחול, הקיבה, המעי, הכליות, עצם, הגידול.
  3. שוקל את הרקמה ומדידת הרדיואקטיביות עם γ-מונה.
    הערה: תוצאות שבאו לידי ביטוי כמו המנה מוזרק אחוז לגרם של רקמות (% מזהה/g).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

קלאציה של 68GaCl3 עם NOTA-RGD-פפטיד הייתה פשוטה, התשואה radiolabeling היה 99%. התגובה זיהומים הוסרו בהצלחה כפי שמוצג באיור2. טוהר רדיוכימי של 68Ga-RGD-פפטיד היה גדול מ- 99%, פעילות ספציפית בסוף הסינתזה היה 90-130 MBq/nmol (איור 3).

תפיסה תא ערכים עבור 68Ga-RGD-פפטיד היו 1.49%, 0.85%, 0.36% ו- 0.39% 30, 60, 90, 120 דקות, בהתאמה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בהווה לומדים, הצגנו פרוטוקול להכין radiopeptide מיקודvα β3 אינטגרין והערכה הביולוגי שלו. פיתוח תרופות מסורתיות כרוך הליך מסובך. זה דורש כמות גדולה של חומר הפניה ופעם הערכה ארוכות יחסית. אף על פי המתודולוגיה המוצע לא יכול להחליף את תהליך ההערכה עדינה, מערכת זו ניתן לסינון למטרות. זה הציע מערכת יפחית במידה ניכרת את זמן ועלות.

בעשור האחרון, רבים radiolabeled RGD-פפטידים נחקרו בהרחבה ככל radiotracers הדמיה גידולים16. כדי לקבל radiopharmaceuticals מבטיח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המחקר הגרעיני תוכנית פיתוח המענק הלאומי מחקר קרן של קוריאה (NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה (מספר 2017M2A2A6A02019904).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
68Ga/68Ge גנרטורITGCompany-10 mCi 
תמיסת מימן כלוריSigma-aldrich84429
נתרן אצטטSigma-aldrichS2889
C18 מחסנית פאזה הפוכהWatersWAT020515
0.22-μ m מסנן סטריליMillliporeSLGV033RS
סורק רדיו-TLCBioscanAR2000
ITLC AgilentSGI001
חומצת לימוןסיגמא-אולדריץ'251275
HPLCWaters-Waters1525 מערכת המכילה משאבה בינארית, מערך דיודות צילום (Waters 2998), גלאי רדיואקטיביות (Raytest, Gabi)
אצטוניטרילJ.T. בייקר14-650-359
חומצה טריפלואורואצטיתסיגמא-אולדריץ'302031
מדיה נשר שונה של דולבקו תרמו פישר 11965092
סרום בקר עובריתרמו פישר 16000044
צלוחיות T175 קורנינגCLS431080
טריפסין-EDTA (0.25%)תרמו פישר מדעי25200072
פניצילין-סטרפטומיציןתרמו פישר מדעי15240112
&גמא;-דלפקפרקיןאשף 3
מזרק אינסונליןבקטון דיקינסון326105
משאבת סינרינגהרווארד מכשיר70-4500
מיקרו-PET/CTסימנס Inveon-
נייר מדעימדעי אלמר-1480

מקורות

  1. Friedlander, M., et al. Definition of Two Angiogenic Pathways by Distinct alpha v integrins. Science. 270 (5241), 1500-1502 (1995).
  2. Janssen, M. L., et al. Tumor Targeting with Radiolabeled alpha v beta 3 Integrin Binding Peptides in a Nude Mouse Model. Cancer Research. 62, 6146-6151 (2002).
  3. Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as αvβ3 integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).
  4. Garanger, E., et al. New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors. Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).
  5. Dijkgraaf, I., et al. PET imaging of αvβ3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).
  6. Liu, Z., et al. 68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin αvβ3 PET imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).
  7. Li, Z. B., Chen, K., Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides for microPET imaging of integrin αvβ3expression. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (6), 1100-1108 (2008).
  8. Liu, S., et al. Isomerism and solution dynamics of 90Y-labeled DTPA-biomolecule conjugates. Bioconjugate Chemistry. 12 (1), 84-91 (2001).
  9. Haubner, R., et al. Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. Journal of Nuclear Medicine. 42 (2), 326-336 (2001).
  10. Sivolapenko, G. B., et al. Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RGD-containing synthetic peptide. Euroean Journal of Nuclear Medicine. 25 (10), 1383-1389 (1998).
  11. Haubner, R., et al. Noninvasive Imaging of αvβ3 Integrin Expression Using 18 F-labeled RGD-containing Glycopeptide and Positron Emission Tomography. Cancer Research. 61, 1781-1785 (2001).
  12. Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles. Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).
  13. Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid. Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).
  14. Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. M. 68Ga-labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography. Nuclear Medicine Molecular Imaging. 44 (4), 233-240 (2010).
  15. Shin, U. C., et al. Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3. Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).
  16. Cai, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

סימון בגליום 68סינתזת פפטיד RGDדימיון אנגיוגנזהתרופות רדיואקטיביות ל-PETכרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוההבדיקת ספיגה תאיתבדיקת יציבות בסרוםמדידת ליפופיליותהתפלגות ביולוגית בגידולתפוקה רדיוכימית
הכנת אספרטט גליצין התווית על-ידי Ga ארגינין (RGD) 68-פפטיד של אנגיוגנזה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.