מאמר שיטה

נוירוגנזה באמצעות P19 Embryonal קרצינומה של תאים

DOI:

10.3791/58225

⸱

27 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Embryology, Institute of Genetics and Animal Breeding, Polish Academy of Sciences, 2Department of Regenerative Medicine, Maria Skłodowska-Curie Institute - Oncology Center, 3Department of Genomics and Biodiversities, Institute of Genetics and Animal Breeding, Polish Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העכבר P19 מתחלקים קרצינומה של קו התא (קו התא P19) משמש רבות לחקר המנגנון המולקולרי של נוירוגנזה עם פישוט גדול בהשוואה לניתוח vivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוירוגנזה הנגרמת חומצה המושרה P19 קו התא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קו התא P19 נגזר העובר העכבר הנגזר teratocarcinoma יש את היכולת להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט. בנוכחות חומצה retinoic (RA), ההשעיה תרבותי P19 קו התא הוא המושרה להבדיל לנוירונים. תופעה זו נחקר בהרחבה כמודל נוירוגנזה בתוך מבחנה. לכן, קו התא P19 הוא מאוד שימושי עבור המחקרים המולקולריים והסלולריים הקשורים נוירוגנזה. עם זאת, פרוטוקולים עבור הבחנה עצבית של קו התא P19 המתואר בספרות הם מורכבים מאוד. השיטה המפותחת במחקר זה פשוטה והיא תשחק תפקיד בהסבר למנגנון המולקולרי בחריגות נוירונטיות ומחלות ניווניות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך embryonal פיתוח, שכבת תא אחת הופכת לשלוש שכבות הנבט הנפרדות1,2,3. כדי להגביר את אפשרויות המחקר של תופעות המתרחשות בvivo, התפתחו הדור של אגרגטים תלת-ממדיים (גופים עובריים) כמודל נוח. אגרגטים סלולריים שנוצרו בדרך זו ניתן לחשוף לתנאים שונים גרימת בידול התא, אשר משקפים את ההתפתחות של העובר4,5. קו קרצינומה עובריים P19 murine (קו תא P19) משמש בדרך כלל כמודל הסלולר ללימודי נוירוגנזה ב מבחנה6,7,8. קו התא P19 מציג תכונות מסוימות של תא גזע בעוצמה pluripotent והוא יכול להבדיל לנוירונים בנוכחות של חומצה retinoic (RA) במהלך צבירת תאים ואחריו neurite מוצלח תחת תנאים חסיד. יתר על כן, קו תא P19 מובחן הוא גם מסוגל להרכיב תאים שרירים וקרדיולציט בדומה תחת השפעת diמתיל סולפוקסיד (dmso)9,10,11,12.

שיטות רבות שונות13,14,15,16 דווחו על בידול עצבי, אבל המתודולוגיה היא לפעמים מסובכת ולא קל לתפוס רק על ידי קריאת התיאורים. לדוגמה, פרוטוקולים דורשים לפעמים שילוב של מדיום הנשר המתוקן של Dulbecco (DMEM) בינוני עם תערובת של סרום עגל (CS) וסרום של שור עוברי (FBS)13. יתרה מזאת, מדיה המשמשת להתפתחות עצבית מורכבת לעתים קרובות מנוירוסיס ותוספי B2713,14,15,16. ככאלה, שיטות קיימות מכילות את המורכבות שבהכנות והמטרה שלנו כאן היא לפשט את הפרוטוקולים. במחקר זה, הדגמנו כי DMEM עם FBS יכול להיות מנוצל עבור שמירה על קו התא P19 (Dמאמ + 10% FBS), כמו גם עבור פיתוח עצבי (DMEM גברת + 5% FBS + RA). זו שיטה פשוטה עבור נוירוגנזה באמצעות קו התא P19 מאפשר לנו ללמוד את המנגנון המולקולרי של איך הנוירונים מפותחים. יתר על כן, מחקר על מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר מתנהל גם באמצעות P19 cell קו17,18, ואנו מאמינים כי השיטה שפותחה במחקר זה ישחק חלק בהסבר לצאת ה מנגנונים מולקולריים בחריגות נוירו-התפתחותיות ומחלות ניווניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תחזוקת התרבות

  1. תרבות קו התא P19 בינונית תחזוקה (מדיום הנשר שונה של מאוד עם 4,500 mg/L של גלוקוז שיושלם עם 10% FBS, 100 יחידות/מ"ל פניצילין ו 100 יחידות/mL סטרפטומיצין). מודטה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.

2. תאים תת-משניים

  1. כאשר התאים מגיעים כ 80% המפגש, להסיר את המדיום המושקע מבחנות תרבות התא (שטח המשטח 25 ס מ2).
  2. לשטוף את התאים עם 2 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) ללא סידן ומגנזיום.
  3. להוסיף 1 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA (חומצה אטיליאדיאמאאת) אל התא מונאולייר.
  4. שים את הבקבוקון בחממה CO2 (37 ° צ' ו 5% CO2) עבור 2-3 דקות.
  5. העריכו את התא המצורף למשטח הבקבוקון. ודא שכל התאים מנותקים וצפים במדיום.
  6. הוסף 9 מ ל של מדיום תחזוקה כדי להפסיק את הפעילות האנזימטית של טריפסין.
  7. השהה מחדש את התאים במדיום תחזוקה.
  8. העבר תאים לצינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g וטמפרטורת החדר (RT).
  9. השמט את הסופרנטאנט והוסף 10 מ ל של מדיום תחזוקה רעננה לתוך השפופרת של 15 מ ל.
  10. השתמש בהשעיה של התא כדי לקבוע את מספר התא באמצעות מונה תאים בהתאם להוראות היצרן.
  11. תאי הזרע ב 2 x 104 תאים/cm2 בבקבוקון 25 ס מ חדש2 .
  12. הוסיפו את מדיום התחזוקה עד 10 מ ל.
  13. לשים את הבקבוקון עם תאים בחממה CO2 (37 ° צ' ו 5% CO2) עבור 2-3 ימים.

3. טריפסין העיכול

  1. . מתוך הבקבוקון של התא לשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ ל של סידן ומגנזיום חינם PBS.
  2. הוסף 1 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA.
  3. לשים את הבקבוקון עם תאים לתוך החממה CO2 ב 37 ° c עבור 2-3 דקות.
  4. השתמש בפיפטה משנת 1 mL כדי לנתק את התאים על ידי מלטף תאים עשר פעמים.
  5. לנטרל טריפסין על ידי הוספת 9 מ ל של בידול בינונית (מדיום הנשר שונה של בינוני עם 4500 mg/L של גלוקוז שיושלם עם 5% FBS, 100 יחידות/מחלת הפניצילין ו 100 יחידות/mL סטרפטומיצין) ללא RA לתאים.
  6. העבר תאים לצינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g ו RT.
  7. להיפטר supernatant ולהוסיף 1 מ ל של בידול בינונית ללא חומצה retinoic (RA). . השהה מחדש את הגלולה הסלולרית
  8. השתמש בהשעיה של התא כדי לקבוע את מספר התא באמצעות מונה תאים בהתאם להוראת היצרן.

4. הדור המצטבר

  1. הוסף 5 μL של RA (במלאי 1 מ"מ הומס 99.8% אתנול, מאוחסן ב-20 ° c) ל 10 מ ל של הבדלה בינונית ומערבבים היטב (הריכוז הסופי של 0.5 μM RA).
    הערה: . רה א רגיש באור ריכוז נמוך של אטוה אינו משפיע על בידול תא19,20,21.
  2. הוסף 10 מ ל של בידול בינוני (עם RA) אל מאכל התרבות 100 מ"מ (מוקדש תרבות ההשעיה).
  3. הזרע את 1 x 106 תאים במנה 100 מ"מ (שטח המשטח 56.5 ס"מ2).
  4. לשים את הבקבוקון עם תאים לתוך החממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 2 ימים כדי לקדם את היווצרות אגרגטים.
  5. לאחר יומיים, החלף את המדיום בידול. משוכי מדיום המכיל אגרגטים באמצעות מנקז 10 מ ל ולהעביר לצינור 15 מ ל ב-RT.
  6. לאפשר לאגרגטים להתיישב על ידי כוח הכבידה עבור 1.5 דקות ב RT.
  7. . מחק את הסופרנטאנט
  8. הוסף חדש 10 מ ל של בידול בינוני עם 0.5 μm RA באמצעות הצינורות 10 mL סרולוגית.
    זהירות: אין לנקות את מצרפים את התאים למעלה ולמטה.
  9. הזרע האגרגטים לתוך המנה החדשה 100 mm לא מטופלים התרבות (מוקדש תרבות ההשעיה).
  10. מניחים את הצלחת בחממה (ב 37 ° צ' ו 5% CO2) במשך יומיים.

5. אגרגטים דיסוציאציה

  1. מתיף את האגרגטים בתאים. באמצעות פיפטה של 10 מ ל
  2. העבירו את האגרגטים. לשפופרת של 15 מ ל לאפשר לאגרגטים תאים להתיישב על ידי כוח הכבידה עבור 1.5 דקות.
  3. . הסר את הסופרנטאנט
  4. רוחצים את האגרגטים בלבד (סרום-וללא אנטיביוטיקה).
  5. לאפשר לאגרגטים תאים להתפשר על ידי משקעי כוח הכבידה עבור 1.5 דקות ב RT.
  6. הוסיפו את הסופרנטנט ומוסיפים 2 מ ל טריפסין-אדטה (0.25%).
  7. מניחים את אגרגטים התא לתוך אמבט מים (37 ° c) במשך 10 דקות. מתפרעים את האגרגטים בעדינות כל 2 דקות על ידי הקשה עם יד.
  8. להפסיק את תהליך הטריסינוניזציה על ידי הוספת 4 מ ל של מדיום תחזוקה.
  9. פיפטה מגיע למעלה ולמטה 20 פעמים. באמצעות פיפטה 1 מ ל
  10. תאים צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g ו RT.
  11. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-5 מ ל של אמצעי תחזוקה.
  12. קבע את מספר הטלפון באמצעות מונה תאים.

6. ציפוי תאים

  1. הוסף 3 מ ל לכל טוב של תחזוקה בינונית לצלחת 6.
  2. תאי הזרע בצלחת התרבות 6-היטב בצפיפות של 0.5 x 106/well.
  3. מודטה ב 37 ° c עם 5% CO2 ריכוז.
  4. זרע את התאים על זכוכית לכסות ב 6 היטב לוחית התרבות ולבצע הכתמים עם נוגדן anti-MAP2 (20% המפגש). השימוש בצלחת 6-הבאר כדי לבודד RNA ולבצע RT-PCR עבור Map2, neun, Oct4, ננוg, ו-הגנד (20% המפגש).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכה פשוטה של פרוטוקול אינדוקציה נוירוגנזה ב P19 קו התא מוצג באיור 1. על מנת להגדיר את האופי של קו התא P19 במצב מובחן ובמהלך נוירוגנזה, RT-PCR (הפוכה שרשרת של תגובת השרשרת) שימוש. קו התאים P19 מובחן הביע את גנים הפלדה כגון קטיון אורגני/carnitine transporter4 (Oct4) ו nanog הומבוקס (nanog). נוירוגנזה הנגרמת על ידי צבירת תאים בתרבות ההשעיה בנוכחות RA הוביל ירידה מהירה של Oct4 ו nanog ביטוי. בניגוד, הביטוי של תא העצב סמנים: ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור נוירוגנזה באמצעות קו התא P19. למרות דיווחים רבים פורסמו בהקשר זה, מתודולוגיה מפורטת עבור אינדוקציה נוירוגנזה באמצעות קו P19 line נשאר ברור. יתר על כן, אנו מנוצלים גלוקוז גבוה פשוט (4,500 mg/L) DMEM בינוני עם 10% FBS עבור הניסוי כולו. הדבר איפשר לנו לבצע את הניסוי הנוירוגניים באופן ידידותי למשתמש ולהרחיב את השימוש בשיטה זו לעתיד.

הנקודות הקריטיות ביותר בפרוטוקול זה הן ריכוז RA, כמו גם הדור של אגרגטים תאים בתרבות ההשעיה. גירוי של נוירוגנזה בתוך קו התא P19 יכול ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר היה נתמך כספית על ידי מרכז המדע הלאומי, פולין (מענק לא. מו-2017/25/N/NZ3/01886) ויודע (מרכז המחקר הלאומי המוביל) קונסורציום מדעי "בעלי חיים בריאים-מזון בטוח", החלטה של משרד המדע והשכלה גבוהה מס ' 05-1/KNOW2/2015

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
6x צבע טעינת DNAEURxE0260-01
AgaroseSigma- AldrichA9539
cDNA ערכת סינתזהEURxE0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride)Sigma- Aldrich10236276001ריכוז עבודה: 1 μ גרם/מ"ל
DMEM גלוקוז גבוה (4.5 גרם/ליטר) עם L-גלוטמיןLonzaBE12-604Q
אתנול 99.8%ChempurCHEM*613964202
סרום בקר עוברי (FBS)EURxE5050-03
MAP2 נוגדןThermo Fisher ScientificPA517646 דילול 1:100
PCR ערכת תגובהEURxE0411-03
פניצילין/סטרפטומיצין 10K/10KLonzaDE17-602E
תמיסת מלח פוספט בופר (PBS), מרוכז 1x ללא Ca2+, Mg2+LonzaBE17- 517Q
חומצה רטינואיתסיגמא- אולדריץ'R2625-50MG  מומס ב-99.8% אתנול; יש לאחסן ב-20 מעלות; C עד 6 חודשים
נוגדן משני (Alexa Fluor 488)Thermo Fisher ScientificA11034דילול 1:500
חלב רזהSigma- Aldrich1153630500
TBE BufferThermo FisherScientific B52
Triton-X 100Sigma- AldrichT8787-100ML
טריפסין 0.25% - EDTA ב-HBSS, ללא  Ca2+, Mg2+, עם פנול אדוםbioseraLM-T1720/500
תרבית תאים פלסטיק
פרופילאב515.01
10 מ"ל פיפטות סרולוגיותפרופילאב515.10
צלחת 100 מ"מ המוקדשת לתרבית תרחיףקורנינגC351029
צינורות צנטריפוגה 15 מ"לסיגמא- אולדריץ'CLS430791-500EA
5 מ"ל פיפטות סרולוגיותפרופילאב515.05
צלחת 6 בארותצלחת קורנינגCLS3516
צלוחיות תרבית תאים, שטח פנים 25 ס"מ2Sigma- AldrichCLS430639-200EA
1 מ"ל פיפטות סרולוגיות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488(2011).
  2. Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
  3. Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 233-262 (2004).
  4. Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).
  5. ten Berge, D., et al. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
  6. Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway. Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).
  7. Lin, Y. T., et al. YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway. Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).
  8. Neo, W. H., et al. MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression. Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).
  9. Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
  10. McBurney, M. W., Rogers, B. J. Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).
  11. Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).
  12. Jasmin,, Spray, D. C., Campos de Carvalho, A. C., Mendez-Otero, R. Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells. Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).
  13. Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity. Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).
  14. Babuska, V., et al. Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation. Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).
  15. Monzo, H. J., et al. A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).
  16. Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity. BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42(2017).
  17. Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells. Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).
  18. Tsukane, M., Yamauchi, T. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).
  19. Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation. Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).
  20. Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
  21. Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).
  22. Hamada-Kanazawa, M., et al. Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid. FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).
  23. Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons. Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051(2013).
  24. Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters. Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).
  25. MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).
  26. Hong, S., et al. Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).
  27. Wenzel, M., et al. Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells. FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).
  28. Harada, Y., et al. Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).
  29. Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum. Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).
  30. Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line. Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

P19RT PCRMAP2NeuN

מאמרים קשורים