בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

סיכום

המטרה של הפרוטוקול היא להציג האורך intravital מעקב בזמן אמת אחר thymocytes על-ידי סריקת מיקרוסקופ ב שתלים הרתי בתא הקדמי של העין עכבר לייזר. את השקיפות של הקרנית, אמוניה השתל מאפשר הקלטה ברציפות קדמון תא גיוס ויציאה T-cell בוגרת.

תקציר

מטרת השיטה שהוצגו היא להראות, בפעם הראשונה, את ההשתלה של היילוד thymi אל החדר העין הקדמי של עכברים בוגרים isogenic לניטור ויוו האורך בזמן אמת של הדינמיקה thymocytes´ בתוך vascularized קטע בלוטת התימוס. בעקבות ההשתלה, סריקת מיקרוסקופ (LSM) דרך הקרנית לייזר מאפשר ויוו לא פולשנית חוזרות הדמיה ברמת רזולוציה הסלולר. חשוב, הגישה מוסיף הקודם ההבשלה T-cell intravital הדמיה מודלים האפשרות עבור גיוס תא קדמון רציפה והקלטות בוגרת T-cell היציאה של אותה חיה. יתרונות נוספים של המערכת השקיפות של האזור המושתל, המתיר ניטור מהיר מאקרוסקופית של הרקמה מושתל, הנגישות השתל המאפשר לשפות אחרות בנוסף טיפולים סיסטמיים. המגבלה העיקרית להיות בנפח של הרקמה זה מתאים במרחב מופחתת של תא העין אשר דורש עבור זמירה האונה. שלמות איבר מוגדל על ידי לנתח אונות בלוטת התימוס בדפוסי בעבר הוכח להיות פונקציונלי לייצור תא T בוגרים. הטכניקה מתאימה באופן פוטנציאלי לחקור וחשש רלוונטי שאלות הקשורות לתפקוד בלוטת התימוס הכוללים מחלת חיסון עצמי, כשל חיסוני וסובלנות המרכזית; תהליכים אשר יישארו מוגדרים mechanistically לקוי. ניתוח מנגנוני המנחה thymocyte ההעברה, בידול ובחירה בסדר אמור להוביל הרומן אסטרטגיות טיפוליות מיקוד מתפתחות בתאי T.

מבוא

Intrathymic T-cell בידול ובחירה subpopulation T-cell מהווים מפתח תהליכים פיתוח ותחזוקה של חסינות תאית חולייתנים¹. תהליך זה דורש רצף אירועים מאורגנים היטב כולל הגיוס של אבות למחזור הדם, התפשטות תאים, הגירה, ביטוי דיפרנציאלי של חלבוני ממברנה ולאחר מות תאים מתוכנת מסיבית קבוצות משנה מורכבים מבחר. התוצאה היא שחרורו של T תאים בוגרים תגובתי ספקטרום נרחב של אנטיגנים זרים תוך הצגת תגובות ממוזער העצמי-פפטידים, אשר מקצה את colonizing איברי הלימפה ההיקפית של הפרט^2,3. Thymocyte סוטה ממבחר הרפרטואר αβTCR מוביל מחלות אוטואימוניות או חוסר איזון מערכת החיסון⁴ הנובעות בעיקר פגמים במהלך תהליכי בחירה קודמן חיובית או שלילית, בהתאמה.

כיווני ההגירה של thymocytes מעבר התימוס הוא מהותי בכל שלבי ההבשלה T-cell וזה וליטוש סדרת בו זמנית, או רציף גירויים מרובים, כולל נוגדנים, דבק, ודה-דבק מטריצה חוץ-תאית (ECM) אינטראקציות חלבון^3,5. המחקר של רקמות קבוע יש מעובד מידע חיוני לגבי דפוסי ביטוי למקלות נודדות thymocyte microenvironments הרתי מוגדר^5,6, בעוד מחקרים לשעבר vivo חשף שתי שכיחה התנהגויות הנדידה של thymocytes בשני תחומים ברורים בהיסטולוגיה איבר: להאט תנועות סטוכסטי בקליפת תנועתיות מהר, סגור לשד^{7,8,9,10 , 11 , 12 , 13}. תעריפי הנדידה הגדילו לתאם עם הבחירה חיובי הרתי¹³ והיא שלילית הבחירה קשורה עם אופן פעולה של סריקה התומכים את ההשערה כי קינטיקה של המסע דרך בלוטת התימוס קובע נכונה ההבשלה של thymocytes. למרות הרלוונטיות שלהם, את הטופולוגיה של אינטראקציות תא thymocyte-סטרומה את הדינמיקה של תנועתיות thymocyte על פני איברים microenvironments במהלך ההבשלה T-cell עדיין מעורפל.

רוב שמחוץ מחקרים שבוצעו עד כה כוללים עוברית או reaggregate איברים הרתי תרבויות^14,15, רקמות פרוסות או שלמים האונה הרתי explants איפה thymocyte תנועות הם דמיינו ידי סריקת לייזר שני הפוטונים מיקרוסקופ (TPLSM)⁸, טכניקת דימות intravital עם מקסימום מוגבלת לעבוד מרחוק והדמיה בעומק של 1 מ"מ בהתאם הרקמה בחן¹⁶. לעומת התרבויות איברים הרתי מפרך התלויות דגירה ממושכת פעמים טופס 3D-מבנים, הן, הטכניקה פרוסה הרתי והן המבוא היתר מבוקר ללא פגע באונה הרתי גישה של קבוצות משנה מסוימת של מראש הנקרא thymocytes לתוך סביבה אדריכלות רקמה מקורית. עם זאת, כיוון זרימת הדם הוא נעדר במודלים אלה, הם מוגבלים בבירור ללמוד בתהליך הגיוס של בלוטת התימוס להתיישב אבות (TSPs) parenchyma התימוס או את הדינמיקה של הרתי egression של תאי-T בוגרים.

In vivo הדגמים לצורך המחקר לפיזיולוגיה ההבשלה T-cell הרתי בעכברים כוללים את השתלים של חלקים או אונות האיבר כולו למקם בתוך הכליה קפסולה¹⁷ או intradermally¹⁸. למרות אפשרויות אלה הראה השירות שלהם לחקור מערכתית engraftment תפקודית של הרקמה, המיקום של שתלי הרתי עמוק בתוך החיה או מכוסה על ידי שכבות של רקמות אטום מגבילה את השימוש בהם ב- vivo בדיקה של שתלים על ידי TPLSM.

התא הקדמי של העין מספק שטח נגיש עבור פיקוח ישיר על כל רקמות המושתל בשל השקיפות של שכבות הקרנית. יתרון, הבסיס של תא הנוצרת על-ידי הקשתית הוא עשיר כלי הדם ואת קצות העצבים האוטונומית, הפעלת revascularization מהירה reinnervation מתוך^19,שתלי²⁰. ד ר Caicedo השתמשה בהצלחה את המרחב האנטומי הזה עבור תחזוקה ומחקר אורך של לנגרהנס העבר²¹. . הנה, אנחנו מראים כי אסטרטגיה זו לא רק מהווה גישה חוקית בחקר הדינמיקה של thymocytes בתוך מבנה איבר מקורי, אך גם באופן ייחודי מאפשר להרחיב ויוו הקלטות האורך במחקר של קדמון גיוס ו שלבים egression של T-cell בוגרת עכבר.

פרוטוקול

טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מיאמי אישר את כל הניסויים בהתאם להנחיות IACUC.

1. בידוד וגיזום של היילוד Thymi

1. להכין כל ריאגנטים שעוצבו על-ידי autoclaving או בשיטות אחרות, הבטחת בתנאים סטריליים.
2. כדי למזער את מציג, לבצע כל הניתוחים תחת תא למינארי.
3. לפני המתות חסד התורם עכברים, למלא צלחת סטרילי 60 מ מ עם עקר prechilled 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4) ומניחים אותו על קרח. זה ישמש שטיפה ואחסון של thymi נכרת של התורם עכברים לפני השתלת.
4. המשך לבצע המתת חסד היילוד לתורם עכברים ע י עריפת ראשו, בהתאם להנחיות אתית.
5. במקום בעכבר על מגבות נייר סופג סטרילי הגבי זקופה, ספריי, לאחר מכן לנגב, הבטן עכבר עם 70% אתנול.
6. לחשוף את חלל בית החזה על ידי ביצוע חתך בצורת V שטחית ברמה של הבטן התחתונה, לחתוך את העור עם זוג של 10 ס מ ישר לנתח מספריים בעקבות של קו האמצע הגחון לעזוב פתיחה של 0.5-1 ס מ בגובה החזה. מקפלים את העור מעל כל צד החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה.
7. יצירת שני עמוק 0.5-1 ס מ חתכים לרוחב דרך הסרעפת בית החזה עם אותו סוג של מספריים כדי לגשת את. החיץ הקרומי סופריור בחלל בית החזה הקדמי. בלוטת התימוס צריך להופיע שתי האונות חיוור מעל הלב.
8. המקום ערכת מלקחיים מעוקל מתחת בלוטת התימוס ולמשוך אנכית כדי לחלץ את האיבר מלאה. למנוע את foldback של קשת הצלעות עם זוג מלקחיים. אם יש צורך, להשתמש מלקחיים בסדר בקפידה יקרע לגזרים ברקמות החיבור שעוטפות את האיבר מבלי לשבש את פעולת הקפסולה לפני מיצוי האיבר.
   הערה: שלב זה הוא הקל על-ידי שימוש טווח ויבתר.
9. להטביע התימוס מבודד אל תוך קר עקר 1 x PBS (pH 7.4) בעבר מוצג לתוך תבשיל סטרילי 60 מ מ, ולחתוך המצר חיבור עם איזמל כדי להפריד בין האונות הרתי. הסר נפולת של המנה מבלי לפגוע הקפסולה. כדי למזער את הזמן thymi חשופים, חתוך קורנית אונות לפני ההשתלה.
   הערה: כל התימוס היילוד מבודד בדרך כלל יעבד שישה מקטעים של בערך 1 מ מ רחב לכל היותר שלושה עכברים המארח בעת קבלת שתלים בשתי העיניים.
10. חזור על הצעדים 1.4-1.9 כל העכבר התורם. כדי למזער את הזמן thymi חשופים, לבודד התימוס אחד בכל פעם.

2. בלוטת התימוס השרשה אל החדר הקדמי של העין

1. לפני ההשתלה, תג, שוקלים כל עכבר הנמען.
2. השתמש מנה בין 1-2% של ואדים isofluorane כדי עזים ומתנגד העכבר הנמען. ודא ההרדמה נכונה בגלל היעדר רפלקס קמצוץ הבוהן הבאים לפני תחילת הליך כירורגי.
3. . המשך עם התימוס מקטעי להשתלות כדלקמן:
   1. למקם את העכבר במיקום הצד הלטראלי שכיבה אז פונה מעלה, כי עין אחת נחשף ישירות לעדשה של הטווח ויבתר.
   2. . נכנסים לאחת האונות הרתי מבודד שוכב בבית של PBS קר 1 x (pH 7.4)-מלא 60 מ מ מאכל לחתיכות עם עד 1 מ מ רוחב עבור השתל. בצע את תבנית זיג-זג כדי להבטיח כי כל מקטע מכיל קורטקס הרתי ואת לשד. השתמש vannas מספריים עבור זמירה על פי ההנחיות באיור 1A.
      הערה: זמירה של בלוטת התימוס צריך להיעשות לפני שתל כדי למטב את הרקמה engraftment.
   3. החל את הבסיס של הקרנית המתאים לאזור כירורגי, מציגים את קצה מחט 40 מ מ G18 לעשות חתך קטן לתוך שכבות הקרנית חיצוניים כך קצה המספריים ויבתר יכול להיות מוצג.
   4. הפוך של 5-10 מ מ לאגף החתך ישירות סביב הבסיס של הקרנית בעזרת מספריים vannas תוך החזקת הפתח קרנית בחוזקה כדי למנוע חתימת. להשתמש מלקחיים עם קצוות שטוחים כדי למנוע נזק לרקמות.
   5. לתפוס את אפיתל הקרנית לחתוך ולחשוף את הפתיחה על-ידי החזקת הקרנית בעזרת זוג מלקחיים שטוח הסתיימה תוך דחיפת קטע הרתי דרך הפתח. רטוב העין עם עקר 1 x PBS (pH 7.4) או דמעות מלאכותיות כנדרש, כדי למנוע רקמות לייבוש עד המניפולציה תושלם.
   6. לחץ בעדינות על פני העין להחליק על קטע רקמה הציג עמדה לרוחב ביחס לתלמיד כדי לשמר את הפונקציה eye´s. ודא כי השתל שוכנת במיקום מול העין פתיחה כדי למנוע הפרעה האחורי עם הדמיה על ידי גירוי עצמי.
   7. בעזרת מלקחיים שטוח, לחץ בחוזקה על 3-5 s, משני צדי הפתח הקרנית אחד נגד השני כדי לקדם את עצמי איטום. הניתוח אינו דורש כל הידוק או תפירה.
4. אם ההשתלות מבוצעות על שתי העיניים, להתהפך לכיוון הנגדי לרוחב כדי לחשוף את העין השנייה על העדשה מיקרוסקופ ויבתר וחזור צעדים 2.3.2-2.3.7 ישירות העכבר.
5. לאחר הניתוח הושלם, חזור העכבר לכלוב ריק prewarmed עם מנורת חימום.
6. ודא כי כל המושתלים העכבר חוזר ניידות מלאה וההכרה לפני הנחת לתוך כלוב משותף עם בעלי חיים אחרים. זה בדרך כלל לוקח מקום בתוך 1 h לאחר הניתוח.
7. לאחר ההשתלה, מתייחסים העכברים עם משככי כאבים לפי הצורך, ולספק העכברים פרצטמול-ריכוז של 1.6 מ"ג/מ"ל במי השתייה.
8. חזור על הצעדים 2.2-2.9 כל עכבר הנמען.
9. לפקח על פעילות בעלי חיים שלאחר הניתוח, כמו גם את המראה של העיניים מושתל לזהות פוטנציאל לסיבוכים בריאותיים.

3. קונאפוקלית הדמיה של מושתל Thymi באמצעות תלת-ממד יחיד פוטון פלורסצנטיות מיקרוסקופיה קונפוקלית

1. עזים ומתנגד העכבר נמען באמצעות מנה בין 1-2% של ואדים isofluorane. להבטיח ההרדמה נכונה בגלל היעדר רפלקס קמצוץ הבוהן הבאים לפני תחילת ההליך הדמיה
2. במקום בעכבר על פלטפורמה מיקרוסקופ הבמה קבוע במצב שכיבה לרוחב הצד כך פונה מעלה, כי עין אחת. כרית החימום מושם על פלטפורמת מיקרוסקופ כדי להבטיח טמפרטורת גוף קבועה של עכברים במהלך הקלטות.
   הערה: ראה איור משלים 1 לפרטים.
3. להכניס את הראש של העכבר headholder stereotaxic ולהתאים את הידית כדי לרסן את הראש העכבר על עמדה בצד הלטראלי המאפשר גישה ישירה של המטרה מיקרוסקופ לעין מחזיק השתל בלוטת התימוס.
4. מקם את החוטם העכבר לתוך מסכת גז כדי לשמור את החיה ומורדמת לאורך כל הליך. פעולה זו מאפשרת התאמת ואדים isofluorane לפי הצורך.
5. כדי להקל על הייצוב של העין במהלך הקלטות תוך הימנעות משיכת העפעפיים, למשוך בחזרה את העפעפיים תוך החזקת העין בקצה תחום הקרנית בעזרת זוג מלקחיים יש טיפים מכוסה על ידי צינור ניילון אשר מחוברים רק-2 מפרק אוניברסלי מוצק. סידור זה מאפשר אובססיה יציב של ראש העין ומספק גמישות ללא הפרעה של זרימת הדם בעיניים, כפי שתואר לעיל²².
   הערה: דמויות משלים 1B, C להציג את מכלול שלם.
6. להוסיף כמה טיפות של דמעות סטרילי מלוחים או מלאכותיים כמו הנוזל טבילה בין הקרנית העדשה, לפני הצבת המטרה מיקרוסקופ על העין העכבר.
   הערה: טיפות נוספים הם ויתרו על הצורך לאורך כל ההליך כדי להשאיר את הנתיב מיקרוסקופ ולמנוע עין ייבוש.
7. תחילה להשתמש עדשת הגדלה נמוכה (5 X) כדי לאתר את בלוטת התימוס בשטח מיקרוסקופ. ואז לעבור טבילה במי רזולוציה (10, 20 ו- 40 X) גבוה יותר, טובלים מטרות עם זמן ומרחק עבודה. למנוע נזקי LSM ולהלבנה של השתל הרתי על-ידי החלת עוצמת הלייזר מינימלי ולהפחית ככל האפשר סריקה זמן. זו מושגת על ידי שימוש בסורק התהודה של המיקרוסקופ.
   הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי שנשתמש הינו מצויד עם מראות סריקת תהודה מסוגל איסוף תמונות ב 25 מסגרות לשנייה. מותגים אחרים יש מיקרוסקופים משלהם עם סורקים תהודה.
8. בחר את מצב רכישה באמצעות מיקרוסקופ התוכנה ולהתחיל את מצב סורק תהודה. ואז לבחור את מצב הדמיה XYZT ולהגדיר את ההגדרות הרכישה כדלקמן:
   1. להפעיל ללייזר ולהתאים את הכוח 30% עבור עירור קרינה פלואורסצנטית.
   2. בחרו קו לייזר עירור וקבעו את הפקד ספליטר (AOBS) קרן אקוסטו אופטי עבור אורכי גל שונים פליטה. בנוסף, כדי לזהות backscatter ניסחו מבנה רקמות, להשתמש זיהוי השתקפות בו-זמנית.
      הערה: בעת בחירת ערכת צבעים עבור עירור (GFP ו- RFP), AOBS באופן אוטומטי מתוכנת ישיר שורות אלה עירור על גבי הדגימה ולשדר הפליטה ביניהם. למשל, עבור ה-GFP ו- RFP, אנו משתמשים להקות השתקפות צר שהנורה עירור בסביבות 488 ננומטר ו-561 nm, בהתאמה. זה משאיר להקות רחבה עבור האוסף של הפוטונים הנפלטים פלורסצנטיות, ובכך להקטין את הצורך כוח לייזר בזמן הרכישה. במצב השתקפות, משמש את AOBS מפצל חצי קרן לשיקוף האור משתקף לכל אורך הגל מהאנשים המשמש לצורך זיהוי פליטת קרינה פלואורסצנטית.
   3. לאסוף את הפליטה-גל שנבחרו, ולאחר מכן בחר רזולוציה של 512 × 512 פיקסלים ולהתחיל חיים הדמיה על ידי לחיצה על לחצן ' חי ', התאמת רמות רווח לפי הצורך (רווח טיפוסי הוא בסביבות 600 V).
   4. להגדיר את ההתחלה ואת הסוף של z-המחסנית על-ידי התמקדות על השתל הרתי, בחר להתחילולאחר מכן מעבר המטוס יכול להיות ממוקד התימוס מושתל ובחר הקצההאחרון. השתמש בגודל z-צעד של 5 מיקרומטר. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את מספר מטוסים קונפוקלי.
   5. בחר את מרווח הזמן עבור רכישת כל z-ערימה (בדרך כלל 1.5 עד 2 שניות) ובחר את האפשרות לרכוש עד הפסיק עבור הדמיה רציפה.
9. לחץ על לחצן התחל כדי לאתחל.
10. תמונה את השתלים שוב ושוב במועדים שונים של אותה חיה מאת וחזור על שלבים 3.1-3.9.
    הערה: אם החיה מחזיק שתלי בשתי העיניים, ניתן לקחת הקלטות מהעין או על-ידי וחזור על שלבים 3.2-3.9 לאחר מעבר לצד זקופה הראש העכבר.

תוצאות

התימוס של היילוד עכברים הם בודדו אותנו מהמתרחש B6. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/ג'ס עכברים כפי שמתואר פרוטוקול זה (שלבים 1.1-1.9). באלה העכברים הטרנסגניים, עוף ביתא אקטין האמרגן מנחה את הביטוי של variant חלבון פלואורסצנטי אדום DsRed. MST תחת השפעת cytomegalovirus (CMV) מיידית מוקדם משפר להקל על המעקב של שתלים.

כדי למנוע דחיית רקמה, אנשים isogenic עם גנוטיפ: C57BL/6-Tg(UBC-GFP) 30Scha/J נבחרו כפונדקאים. באלה העכבר...

דיון

בשל החשיבות של תהליך ההבשלה T-cell עבור הפרט כשירות המערכת החיסונית⁴ ואת ההשפעה המשוער של קודמן תא dynamics על תאי-T בוגרים המיוצר על ידי בלוטת התימוס^2,3, הושקעו מאמצים נרחבים לפתח חלופות הגישה בזק קלאסי רקמות קבוע.

למרות פרוסות רקמות ו explants אחרים יותר ברור מתרבה אדריכלות רקמות מאשר monolayers או צבירה איברים הרתי תרבויות^14,15, העדר קשר להערכת מגבילה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
וופורייזר איזופלואורן עם איזופלואורן	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
היקף חיתוך עם מקור אור	Zeiss	Stemi 305
מלקחיים לדיסקציה עדינה	WPI	500455
מלקחיים לדיסקציה בינונית	WPI	501252
מלקחיים לדיסקציה עדינה בקצה מעוקל	WPI	15917
Vannas מספריים	WPI	503371
ניתוחי מספריים	WPI	503243
אזמל	WPI	500353
40 מ"מ 18 גרם מחטים	BD	304622
פיפטה העברה חד פעמית	Thermofisher	201C
כרית חום ומנורת חום	קנט סיינטיפיק קורפ	Infrarred
אתנול 70%	VWR	83,813,360
צלחת סטרילית 60 מ"מ	SIGMA	CLS430166
סטרילית 1x PBS pH(7,4)	מגבונים	10010023
	Kimberly-Clark	LD004
תרופות לטיפול בכאב	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
תמיסת מלח או Viscotears	Novartis	N/A
סטריאומיקרוסקופ	Leica	MZ FLIII
מתאם מחזיק ראש	Narishige	SG-4N-S
מסכת גז	Narishige	GM-4_S
מיקרוסקופ קונפוקלי	Leica	TCS SP5 II
קולט אדים זרימה למינרית	Telstar	BIO IIA

סטריליים Thermofisher