מאמר שיטה

אינדוקציה של הפלאק טרשת עורקים באמצעות הפעלה של מינרלוקורטיקואידים הקולטנים בעכברים אפוליפופרוטאין E לקויה

DOI:

10.3791/58303

⸱

26 בספטמבר 2018

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cardiovascular Endocrinology, IRCCS San Raffaele Pisana, Rome, Italy, 2Department of Human Sciences and Promotion of the Quality of Life, San Raffaele Roma Open University, Rome, Italy

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול לזירוז טרשת עורקים אצל שורש אבי העורקים ספקיות- / - עכברים שקיבלו עם דיאטה atherogenic, באמצעות שחרור רצוף של אלדוסטרון. שיטות לאפיון הרכב הפלאק מתוארים גם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרשת עורקים היא עקב תגובה דלקתית כרונית המשפיעים על אנדותל כלי הדם, הוא קידום על ידי מספר גורמים כגון יתר לחץ דם, dyslipidemia וסוכרת. נכון להיום, אין ראיות כדי לתמוך תפקיד עבור מחזור אלדוסטרון כגורם סיכון להתפתחות של מחלות לב וכלי דם. מודלים מהונדס העכבר נוצרו ללמוד תהליכים תאית ומולקולרית שמוביל טרשת עורקים. כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול מנצל תקינות של אלדוסטרון בעכברים- / - ספקיות ומייצר הפלאק טרשת עורקים בספריית הבסיס של אבי העורקים לאחר 4 שבועות של טיפול. אנו, לכן, ממחישים שיטה כימות ואפיון של נגעים טרשת עורקים ברמת הבסיס של אבי העורקים. הערך המוסף של אלדוסטרון אינפוזיה מיוצג על ידי הדור של עתיר השומנים ותאים דלקתיים התרדמה לאחר 4 שבועות של טיפול. נתאר בפירוט ההליכים מכתימים לכמת השומנים ותוכן מקרופאג בתוך הפלאק. ראוי לציין, ב פרוטוקול זה, אנו מבצעים לב רקמות-הטבעה ב- OCT כדי לשמר את antigenicity של רקמת הלב וכדי להקל על detectability של אנטיגנים של עניין. ניתוח של פנוטיפ הפלקיו מייצג גישה חוקית ללמוד הפתופיזיולוגיה של התפתחות טרשת עורקים, וכן לזיהוי מטרות תרופתי חדשניים לפיתוח תרופות אנטי-atherogenic.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרשת עורקים הוא אחד הגורמים העיקריים לתמותה ותחלואה ברחבי העולם1. הוא מאופיין על-ידי מצב דלקתי כרוני שבו כלי הדם הם הסתננו ליפידים, לויקוציטים הקובעות את היווצרות הפלאק טרשת עורקים. הרוב המכריע של אירועי לב חריפה משויכות אירועים קדחת עקב קרע פלאק. שלטי נוטה להיקרע מוגדרים "פגיע", מאופיינים על ידי חדירה מוגברת של לויקוציטים הפרו דלקתיים, גרעין נמק כיפה סיבית דק2. בעשרות השנים האחרונות, מחקרים קליניים וניסויים הבהירו הפתופיזיולוגיה המורכבת של המחלה. מספר מודלים בעלי חיים משמשים כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים אינדוקציה של טרשת עורקים3. כיום, העכבר הוא המין הנפוצות ביותר לחקר טרשת עורקים למרות כמה הבדלים תלויי מין הקיים שלה פתופסיולוגיה לעומת בני אדם. בפרט, במחזור הכולסטרול מורכבת בעיקר על ידי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (עם מאפיינים antiatherogenic) במודלים של העכבר, ואילו אצל בני אדם במחזור כולסטרול בעיקר מועבר כמו ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL), כנראה ייצוג הסיבה העיקרית למה עכברים פראי-סוג לא לפתח טרשת עורקים ספונטני4. יתר על כן, פראי סוג עכברים הם בדרך כלל עמידים בפני ספיגת כולסטרול מן הדיאטה, ואילו בני אדם לספוג בסביבות 50% כולסטרול תזונתיים4. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נוצרו מספר מודלים מהונדס גנטית עכבר. עכבר אפוליפופרוטאין E – לקויה (ספקיות−/−) ועכבר לקויה – קולטן LDL (−/LDLr−) נמצאים בשימוש נרחב. דיאטה עתירת שומן כולסטרול גבוה, עכברים− −/ספקיות להתפתח פלאק יותר במהירות בהשוואה לעכברים−−/LDLr, וכי מסיבה זו, הוא השימוש של ספקיות עכברים− −/ נפוצה יותר מזו של LDLr−/−עכברים5,6. העכברים− −/ספקיות לפתח נגעים בכל שלב של טרשת עורקים, דומות לאלה שנמדדו בבני אדם, למרות הפלאק העכבר אינם מראים על פנוטיפ לא יציב7. באופן כללי, ספקיות עכברים− −/באופן ספונטני לפתח טרשת עורקים, תהליך זה מואץ עם הדיאטה המערבית3. ניתן להעריך את חומרת טרשת עורקים ברמה של בעורק, ריאות, הירך עורק brachiocephalic ואת שורש אבי העורקים6. בפרט, בסיס אב העורקים מייצג אתר אנטומי נוטה לפתח התרדמה בעכברים. מסיבה זו, זה מנהג נפוץ כדי להעריך את היווצרות הפלאק טרשת עורקים באזור זה.

מספר מחקרים הראו שכי אלדוסטרון הוא מעורב בפיתוח של טרשת עורקים8,9,10. אלדוסטרון אינפוזיה אצל ספקיות−/− עכברים שקיבלו תזונה atherogenic מאיצה את התפתחות שורש אבי העורקים התרדמה גרימת היווצרות הפלאק מודלק ועשיר השומנים10.

לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול כולל אלדוסטרון אינפוזיה, דיאטה atherogenic האכלה, ההטמעה של רקמות הלב, כימות ואפיון של טרשת עורקים בעכברים- / - ספקיות. הליך זה מקדם מערך יעיל של הפלאק טרשת עורקים מודלק, השומנים-עשיר והוא מייצג את מודל ערך עבור המחקר של atherogenesis.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר היה אושרה על ידי האיטלקי מוסדות של הבריאות לשימוש ועדות, אישור מספר 493/2016-PR. כל ההליכים נערכו לפי ההנחיות של הקהילה האירופית לשימוש של חיות ניסוי (הדירקטיבה האירופית, 2010/63/מורה).

הערה: השתלה תת עורית של osmotic minipump המכיל הרכב (אתנול בתמיסת) או אלדוסטרון (240 µg · ק ג-1 · ד-1) בשבוע 8-10-בן זכר עכברים לקוי עבור הגן ספקיות . גנרל, שבוע 8-10-בן זכר ספקיות−/− עכברים שוקל בסביבות 25-26 g.

1. המסת אלדוסטרון

  1. להמיס 5 מ"ג של אבקת אלדוסטרון ב 1 מ"ל אתנול מוחלטת.
  2. להוסיף µL 56.7 של אלדוסטרון (מומס באתנול) µL 68.3 תמיסת מלח על מנת לקבל ריכוז של 2.27 µg / µL. למלא את minipumps osmotic שלם לחלוטין עם µL 125 של פתרון זה (קיבולת מקסימלית של כל minipump הוא 125 µL).
  3. השתמש בקצב זרימת minipump של 0.11 µL/h; לכן µL 2.64 של הפתרון הוא שוחרר בכל ה 24 לתת כל עכבר בסביבות 6 µg · ד-1 של אלדוסטרון במשך 28 ימים.

2. osmotic משאבת דלק, השרשה

הערה: משאבות מסופקים בשני חלקים נפרדים: הגוף העיקרי של המשאבה ואת הרגולטורים זרימה.

  1. מילוי וטפל את minipumps באמצעות כפפות כירורגי.
    הערה: שמנים העור עלולים להפריע הביצועים של minipumps. השלבים הבאים יש לבצעו בשכונה זרימה שכבתית סטרילי.
  2. לצרף את הצינור מילוי (מסופק עם minipumps) מזרק 1 מ"ל וצייר את הפתרון אלדוסטרון או רכב.
    הערה: חשוב להימנע לתת אוויר בתוך המזרק תוך כ רפה בעברית פתרונות מהצינור כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר לתוך למשאבה.
  3. הכנס את הצינור מילוי דרך החור בראש minipump עד שזה יכול ללכת יותר (איור 1A-1B). לאט לאט למלא את המשאבה אלדוסטרון או רכב. שים לב צל כהה בתוך המשאבה המציין את רמת הנוזלים. Watch שהזריחה רמת ביחד עם המשאבה מילוי.
    1. תפסיק למלא את המשאבה כאשר חרוז של נוזל עולה אל מחוץ לגוף המשאבה.
  4. בזהירות להסיר את הצינור מילוי והכנס את ווסת הזרימה לתוך גופו של minipump (איור 1C). ודא כי הרגולטורים מוכנס בחוזקה נגד הגוף משאבת. השאירו את המשאבות osmotic מלא גביע המכיל תמיסת סטרילית ב 37 ° C עבור עד 24 שעות לפני ההשתלה העכבר (הליך לקרקע).
  5. לערוך ניתוח באזור חיטוי עם אתנול 70% המקדם asepsis.
  6. החל 1-3 טיפות באתר החתך של 0.25% נמשך, עזים ומתנגד החיה עם 3% איזופלוריין. להפעיל את אספקת הגז מוגדר זרימה 500-1000 מ ל לדקה במקום החיה בבית הבליעה אינדוקציה, חותם העליון. הפעל את מכשיר אידוי לאיזופלוריין 5% ולאחר לפקח על העכבר עד שכיבה.
    1. להחליף את המערכת מזרימה nosecone. הסר את החיה החדר והמיקום ב nosecone. ב- 2-3 דקות, העכבר מתחיל להתעורר. הפעל מחדש את זרימת הגז של זרימה ב- 100-200 מ ל/דקה, מאדה ב- 3% איזופלוריין.
    2. להבטיח עומק נאותה של הרדמה לפני ביצוע הליכים על ידי בדיקות נסיגה פדלים ורפלקסים palpebral. לפקח על הנשימה והתגובה גירוי במהלך ההליך ולהתאים מאדה כנדרש.
    3. להגן על הקרנית ממנו להתייבש על-ידי החלת משחה אופטלמולוגיות.
  7. הכן את החיה על ידי הסרת שיער באתר כירורגית בעזרת סכין גילוח (איור 1D). האתר הרגיל עבור השתלה תת עורית של משאבות נמצאת מאחור.
  8. הכנת האתר כירורגית עם חומר משטח לא ארוגים רווי אלכוהול איזופרופיל 70%.
  9. השתמש ברווח נקי ומסור (חיטוי עם 70% אתנול) ומכוסה תלוי סטרילי. מקם הקצה של כלי הנגינה מעקר חרוז זכוכית. להתחיל את הניתוח בכלים סטיריליים וטפל מכשירי גילוח ורחיצה כירורגית.
  10. השתמש מספריים כירורגיים כדי להפוך 0.8-1 ס מ החתך (בערך 2 ס מ בקרבת הזנב), כפי שמוצג דמויות 1E-1F. לשמור על עקרות מאת לא לגעת בשום דבר מחוץ החלל ייעודי כירורגית עם כפפות סטריליות או טיפים של מכשירים.
  11. לטפל כדי לחתוך רק את העור אבל לא את רקמות הבסיסית. להשתמש ביד אחת כדי להחזיק מלקחיים כדי לפתוח את החתך. תשתמש ביד השנייה כדי להחזיק את הנקז להפיץ את העור על מנת ליצור כיס עבור המשאבה מהחלק האחורי כלפי מעלה אל עצם השכם (בצד ימין או שמאל של העכבר).
  12. הכנס את המשאבה לתוך החתך. דחף בעדינות את המשאבה לחלוטין לתוך הכיס (איור 1 H). צריך להיות מספיק עור בחינם לסגור את הפצע עם אין מתח או מתיחה של העור זקוק. ברגע המשאבה הוכנס, תפר את החיתוך בחוט ניתוח (polyglactin 910 עם תפר גודל 6-0...)
    הערה: בראש של הרגולטורים חייב להיות שכיוונו כלפי החזית של העכבר (איור 1 ג'י).
  13. החלת משחה povidone/יוד 10% אקטואלי עם מקלון נקי (איור 1I) ולשמור את החיה על הבמה התחממות כדור הארץ. לא להשאיר את עכברים בבית ללא השגחה עד שהם להתאושש recumbency בחזה ובצלעות. להעריך את מצב הידרציה ולפקח 0.5 מ ל תמיסת 0.9% subcutaneously במידת הצורך. להחזיר את החיה לדיור שגרתית שלה.
  14. עקוב אחר ההנחיות מוסדיים לתיעוד (למשל, למלא טופס ניתוח מידע פעיל ואחרי הניתוח, עדכון כרטיס כלוב עם הליך ותאריך) לספק משככי כאבים (הבופרנורפין, 0.05 מ"ג/ק"ג) כדי להפחית כאב לאחר ניתוח, אנטיביוטיקה (enrofloxacin 85 מ"ג/ק"ג) כדי למנוע זיהום לאחר ניתוח.
    1. נמשיך לעקוב מדי יום ולבחון סימנים של כאב. שים לב כי הפצע סגור לחלוטין, minipump נשמרת לתוך הכיס תת עורית. לפתוח הפצע, העכבר עלול לאבד את minipump.

3. ניתוח הלב

  1. בזמנו של הקרבה, עכברים anestethize עם 80-100 מ"ג/ק"ג של Zoletil מנוהל intramuscularly. Zoletil גורם הרדמה עמוקה. הערה: לבדוק כי עכברים הם בעומק נאותה של הרדמה לפני ביצוע הליכים על-ידי בדיקת את הדוושה ורפלקסים palpebral; להיות perfused עכברים בזמן עמוקות מורדם. פתח את חלל בית החזה, בעזרת מספריים, מלקחיים, על ידי חיתוך רוחבית הצלעות לעצם החזה, עם עצם החזה להיות מההצעה לכיוון הראש.
  2. Perfuse העכבר דרך החדר השמאלי על ידי מערכת זלוף המשיכה עם 10-15 מ ל תמיסת מלח של Dulbecco קר כקרח פוספט buffered (PBS) ולאחר מכן עם 40-50 מ"ל של 10% נייטרלי פורמלין במאגר כדי לתקן את להערכת. קיבוע מסומן כאשר העכברים התערוכה התכווצות שרירים נמרצת להיות נוקשה.
    הערה: תהליך תיקון מתקיים בעוד 10-20 דקות. זה אפשרי לשימוש קבוע איברים ורקמות כדי לבצע immunofluorescence או אימונוהיסטוכימיה ניתוחים. חשוב, רקמות קבועים אלה אינם יכולים לשמש עבור ביטוי גנים וניתוחים סופג המערבי.
  3. להפריד בין הלב לבין אבי העורקים על ידי החזקת את הלב עם המלקחיים וחיתוך עם מספריים או סכין אזמל, בניצב לציר של אבי העורקים, קרוב ככל האפשר ללב ללא גרימת נזק (איור 2 א). להשתמש בלהב סכין לחתוך באופן רוחבי לאורך קו ישר המחבר את הנקודות התחתון של הפרוזדור מימין ומשמאל (איור 2B).
  4. למלא את החלק העליון של הלב המחולקת למקטעים (דרך החלל של הלב) עם תרכובת חיתוך אופטימלית (אוקטובר) (איור דו-ממדי-2E). לשים את הרקמה בתוך תבנית פלסטיק cryosection עם הציר של אבי העורקים מניחים בניצב לבסיס של עובש מלבני, לכסות עם OCT (2F איור). צריך להיות אין בועת אוויר לכוד. אם כל בועה, לנסות לתפוס אותו לקצה.
  5. מניחים צלחת מתכת על קרח יבש, אז בזהירות עם העובש (איור 2G). OCT הופך לבן, לעטוף את התבנית בנייר כסף ולאחר מכן אחסן ב –80 ° c

4. חיתוך חלקים של שורש אבי העורקים

  1. הגדר את המכונה cryostat –20 מעלות צלזיוס. לפני חיתוך, למקם את הרקמה מוטבע, להשאיר אותו שם למשך כ 15 דקות להתאמת טמפרטורה זו. הגדר את הטמפרטורה מחזיק הדגימה-17 מעלות צלזיוס (איור 3 א).
  2. מניחים את גוש הלב הקפוא בתוך המכונה cryostat equilibrate הטמפרטורה של גוש לזה של cryostat (איור 3B) ולהוציא מהבניין הלב הקפוא העובש (איור 3C). חותכים את ה-OCT. עודף מהגוש קפואים כדאי להתאים את מידות בלוק עם בעלי הדגימה (דמות תלת-ממד).
  3. הר הרחוב הלב הקפוא את המחזיק הדגימה מונחה עם פונה חדרית החוצה (איור 3E-3עכשיו) ולהוסיפה בעל הדגימה הדגימה המכוונת את הראש (איור 3J). התאם את הכיוון של בעל הדגימה כדי לאפשר חיתוך של הרחוב על מנת להפוך את בסיס אב העורקים בניצב הלהב (איור 3 K).
  4. חותכים את גוש ולמחוק את הפרוסות עד שורש אבי העורקים (איור 3 L-3N). איסוף מקטעים טורי ומניחים בשקופיות זכוכית (איור 3O). לפקח את הפרופיל האנטומי של בסיס אב העורקים מתחת למיקרוסקופ עד יופיעו כל השסתומים אבי העורקים 3 (איור 3 P-3Q).
  5. לאסוף את סעיפים 10 מיקרומטר בסעיף עבור שמן אדום O ו- Picro סיריוס אדום מכתים, ו-6 מיקרומטר/מקטע עבור MAC3 מכתים (איור 3R). לאסוף סביב 6-8 שקופיות (עבור כל לב) עד שאחד השסתומים שלושה נעלמת או אינה שלמה יותר.

5. אימונוהיסטוכימיה

הערה: כל השלבים מכתימים דיווחו הפרוטוקולים הבאים מבוצעות בצנצנות זכוכית Coplin מוכתמים.

  1. שמן כתם אדום O עבור שומנים נייטרלי
    1. לתקן מקטעים 70 מ של 37% פורמלדהיד עבור 5 דק לשטוף היטב במי ברז, למחוק את עודף המים.
    2. לדלל 48 מ של שמן אדום O (0.5% אלכוהול איזופרופיל) ב- 32 מ"ל של מים מזוקקים כדי להשיג שמן אדום O 0.3%.
    3. כתם ובסעיף 70 מ של שמן אדום O 0.3% עבור 10 דקות לשטוף ובסעיף הקש מים למשך 10 דקות.
    4. כתם על 1 דקות ב- 70 מ של Hematoxylin של מאייר. רחץ מקטעים בתוך מים פושרים במשך 1 דקה.
    5. לטבול ובסעיף 70 מ של 0.5% ליתיום קרבונט. לשטוף במי ברז עבור 1 דקות.
    6. הר מקטעים עם הרכבה מימית בינונית, לכידת תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב על מיקרוסקופ אור.
  2. סיריוס Picro אדום כתם על קולגן
    1. לחתוך 10 מיקרומטר קפוא מקטעים והר בתחתית של השקופית.
    2. לתקן מקטעים 70 מ של אצטון עבור 5 דקות, אוויר יבש, שטיפה קצרה במים מזוקקים.
    3. מקום סעיפים 70 מ של 0.2% חומצה phosphomolybdic עבור 5 דק שטיפה קצרה במים מזוקקים.
    4. מקום סעיפים 70 מ של 0.1% Picro סיריוס לפתרון 90 דקות יש לשטוף פעם אחת עם 70 מ של פתרון למחוק HCl. N 0.01.
    5. במקום 70 מ של HCl N 0.01 עבור 2 דק שטיפה קצרה בתוך מים מזוקקים. אוויר יבש.
    6. המקום בקצרה 70 מ של 70% אתנול.
    7. כאשר יבש לחלוטין, מקום 70 מ של ניקוי סוכן ממוצא terpene והר האיזורים השונים בחשבון בעזרת פולי (בוטיל methacrylate -co-חומצתי) המבוסס על הרכבה בינונית, לכידת תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב על מיקרוסקופ אור.
      הערה: אחד היתרונות של ההכתמה Picro סיריוס אדום הוא שניתן להבחין בסוג אני (סיבי עבה, שבירה כפולה צהוב כתום), רשתות סיבי קולגן סוג III (סיבי דק, שבירה כפולה ירוק) על ידי מיקרוסקופ אור מקוטב11 .
  3. Mac3 הכתם עבור מקרופאג מכתים
    1. לחתוך 6 מקטעים מיקרומטר קפוא והר בתחתית של השקופית.
    2. לתקן מקטעים 70 מ של אצטון קר במשך 5 דק Immerse ב 70 מ של PBS למשך 2 דקות.
    3. באמצעות פיפטה של, לכסות חלקים עם 1% של נתרן dodecyl חומצה גופרתית (מרחביות) פתרון, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) לאחזור אנטיגן. לטבול 70 מ של PBS במשך 5 דקות.
    4. באמצעות פיפטה של, לכסות את הפרוסות עם 0.3% חמצן עבור 20 דק. שטיפת ב 70 מ של PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
    5. השתמש מתחמי אבידין-ביוטין (ABC)-HRP קיט על השלבים הבאים.
    6. באמצעות פיפטה של, לחסום מקטעים בנסיוב ארנב רגיל בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. אין לשטוף.
    7. כתם עם MAC3 (1:300) במשך 90 דקות בשטיפת RT. ב 70 מ של PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
    8. כתם עם תת-biotinylated אנטי חולדה אג (1:200) עבור 45 min-שטיפה RT. 70 מ של PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
    9. מכסים את הסעיפים עם הארנב אג ABC למשך 30 דקות ב- RT. שטיפה עם 30 מ של PBS 3 פעמים במשך 5 דקות.
    10. מכסים את הסעיפים עם 3-אמינו-9-ethylcarbazole (AEC) במשך 10 דקות יש לשטוף עם 70 מ של מים מזוקקים עבור 10 פעמים.
    11. כתם על 1 דקות ב- 70 מ של Hematoxylin של מאייר. רחץ מקטעים בתוך מים פושרים במשך 1 דקה.
    12. לטבול ובסעיף 70 מ של 0.5% ליתיום קרבונט. לשטוף במי ברז עבור 1 דקות.
    13. הר מקטעים עם הרכבה מימית בינונית, לכידת תמונות באמצעות מצלמה דיגיטלית רכוב על מיקרוסקופ אור.

6. תמונות ניתוח של התרדמה בסעיפים בסיס אב העורקים

הערה: בסיס אב העורקים סעיפים מוכתמים בשמן האדום O או MAC3 או נוגדן עניין ניתן לנתח באמצעות תוכנה מתאימה (המצוין בטבלה של חומרים). פיקסלים הכולל צביעת חיובי עבור הרכיב עניין מנורמל לאזור פלאק הכוללת. תמונות שנאספו, נותחו על ידי חוקר עיוור טיפול.

  1. כיול
    1. לפתוח את התוכנה, ולאחר מכן בחר את התמונה (ב- jpg) כדי להיות מנותח.
    2. בחר את דף הבית | צור | כיול מהירה.
    3. להגדיר את הכיול של התמונה על ידי ציור קו לאורך הבר קנה המידה של התמונה.
    4. שמור את הכיוונון של כיול.
  2. ניתוח תמונות
    1. בחר הכיול ההתקנה שנשמרו מתפריט האפשרויות | אפשרות כיול מרחבית.
    2. בחר כיול | להחיל.
    3. בחר בכלי מצולע בתפריט בחר וצייר את האזור לאורך כל התרדמה.
    4. בחר Count/גודל | סוגים. מתפריט ', הוסף אזור ואזור אחוזים.
    5. מהתפריט ספירה/גודל , בחר ידני , חלון חדש יפתח.
    6. מן החלון לחץ על הכלי לבחור צבע על התמונה , בחר מצב HSI במצב.
    7. נקודת סמן העכבר על הפיקסלים חיובית של סמן עניין כדי ליצור מגוון של צבעים.
    8. לחץ על ספירת ומציין הערך Sum, שנצפתה המדידה בטבלה, האחוז של האזור של דה מרקר (גם הביע מיקרומטר2) ביחס שטח טרשת עורקים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד 8-10 שבועות Apo- / - עכברים, minipumps שהיו מושתלים כדי להשרות עם הרכב או אלדוסטרון (איור 1E-1I) והאכילה של דיאטה atherogenic (מנוכי עונתיות קלוריות דיאטה 42% שומן) למשך 4 שבועות. בסוף הטיפול, עכברים היו מורדמים, perfused עם PBS ו 10% פורמלין כמתואר לעיל. בסיס אב העורקים הופרד מן החלק הפסגה של הלב, הוטבע באוקטובר (איור 2). חתכי רוחב של שורש אבי העורקים הוכנו עבור צביעת שונים באמצעות מכונה cryostat...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרשת עורקים היא הפרעה דלקתית כרונית המשויך כלי שיט גדולים ובינוניים, מעורבים האינטראקציות בין סוגי תאים מרובים, כגון מקרופאגים, לימפוציטים, תאי אנדותל, תאי שריר חלק1. למרות המגבלות של מודלים atherogenic מאתר, גוף גדול של ראיות על תהליך טרשת עורקים הינה זמינה. מודלים אלה יש יתרון במהירות לייצר גדודים ניסיוני של גיל מסוים או מגדר. עכברים להראות גם רקע גנטי מוגדר ולא הומוגנית.

ההתפתחות של טרשת עורקים הפלאק, נצפתה במודלים של העכבר נוטה טרשת עורקים, חלקית דומה שתצפית של ניסו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים איטלקי משרד הבריאות (החיפוש אחר Corrente, GR-2009-1594563 ו- PE-2011-02347070 כדי קונליס)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דיאטת קלוריות מותאמת (42% משומן)EnvigoTD.88137דיאטה אטרוגנית
מיני-משאבה אוסמוטית עם צינור מילויAlzetדגם 1004לריאלאז רציף
אלדוסטרוןSIGMAA9477הורמון
אתנולSIGMA34852-Mממס
Alchol Preps רווי ב-70% איזופרופיל אלכוהולקנדל Webcol6818חיטוי
(Vicryl 6.0)ניתוח500004 דמאס
10% משחת פובידון/יודAplicare-Meriden52380-0026-1חיטוי
פורמלין 10%SIGMAHT5012לקיבוע כלי דם
CryomoldBio-Optica07-MP1515להטמעת
תרכובת O.C.T.Sakura Finetek4583להטמעת
מכשיר CryostatLeicaCM1900לחיתוך
תמיסת חיץ פוספט חוצץAurogeneAU-L0615-500
שקופיות הידבקות פוליסיןVWR631-0107משקפי מיקרוסקופ
כיסוי משקפייםביו-אופטיקה72015משקפי כיסוי
פורמלדהיד 37%SIGMA252549ממס
שמן תמיסת Red O (0.5% באיזופרופנול)תמיסת צביעהSIGMAO1391
Mayer' s HematoxylinSIGMAMHS32תמיסת מכתים
ליתיום קרבונטSIGMA62470מאגר כביסה
הרכבה בינוניתרמו מדעיTA-125-AMפתרון הרכבה
אצטוןSIGMA179124
תמיסת חומצה פוספומוליבדיתSIGMAHT153להיסטולוגיה
ישיר אדום 80 (פיקרוזיריוס אדום)תמיסת צביעהSIGMA365548
Bio Clear (חומר ניקוי ממקור טרפן)מוצר Bio-Optica06-1782Dלהכנת דגימות היסטולוגיות
Eukitt מדיום הרכבה מהיר מתקשה (פולי (בוטיל מתאקרילט-קו-מתיל מתקרילט)תמיסת הרכבהSIGMA3989
נתרן דודציל סולפטאבקת
פלוקה 71725תמיסת מי חמצן (30%)תמיסת SIGMAH1009
ערכת Vectorstain ABC כוללת: IgG ABC נגד ארנב, סרום ארנב רגיל, IgG נגד חולדות ביוטיניליות,Vector LaboratoriesPK-6100תמיסת צביעה
3-amino-9-ethylcarbazoleVector LaboratoriesSK-4200תמיסת צביעה
Mac3 נוגדןBD Biosciences553322נוגדן
ImagePro Premier 9Media Cybernetics050910000-2534תוכנה לניתוח תמונות
חוט ניתוח של Dulbecco

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
  2. Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
  3. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  4. Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
  5. Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
  6. Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
  7. Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
  8. de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
  9. Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
  10. McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018(2013).
  11. Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
  12. Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
  13. Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Oil Red OOCT

מאמרים קשורים