הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פפטיד40 MUB לשימוש באיתור האירועים דלקת נויטרופילים בתיווך

5.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58367

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, Institut Pasteur, 2INSERM Unité 1202, Institut Pasteur, 3Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires, Université Bordeaux Segalen, 4Unit of Technology and Service Photonic BioImaging, Institut Pasteur

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות הנוכחות של נויטרופילים בסעיפים היסטולוגיה קבוע/permeabilized ולהעריך את מצב ההפעלה נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. בפרט, פפטיד40 MUB מאגד לקטופרין נוכח בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. חשיפה של התכנים גרגר דרך permeabilization או הפעלה נויטרופילים מאפשר הסימון של נויטרופילים.

תקציר

כאן, אנו מספקים פרוטוקול הכרוכות של MUB40, פפטיד מסונתזת את היכולת לאגד לקטופרין glycosylated המאוחסן בריכוזים גבוהים בגרגרים שלישוני וספציפית של נויטרופילים. זה פרטי פרוטוקול איך MUB40 מצומדת ישירות אל fluorophore יכול לשמש כתם נויטרופילים ברקמות קבוע/permeabilized וכן איך ניתן להשתמש ב- live-תא הדמיה כדי assay הפעלה נויטרופילים, פרור ולהשתחרר. שיטות איתור נויטרופילים מוגבלות תלויי מין נוגדנים חד-שבטיים, אשר אינם תמיד מתאים עבור יישומים מסוימים. MUB40 אינו לחדור את קרום התא, ולכן נכללו לקטופרין המאוחסן בשאינם-מופעל/הלא-permeabilized נויטרופילים. MUB40 יש ערך מוסף של הכרה לקטופרין ממגוון המארחת רחב, שימושי במיוחד עבור השוואת תוצאות מחקרים שכללו מספר מודלים מחקר, צמצום מספר ריאגנטים כפולים, ופישוט פרוטוקולים דרך מכתים צעד אחר צעד.

מבוא

נויטרופילים באחת הזרועות העיקרית של מערכת החיסון המולדת, מגויסים באופן שגרתי לאתרים של דלקת סביב הגוף. המחקר של נויטרופילים נפגע במידה רבה על ידי שלהם אורך קצר במבחנה (פחות מ- 8 שעות) על ידי כלי איתור מוגבלת בתנאים הבזליים או לאחר ההפעלה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נבדק היטב עבור גילוי רחב וספציפי של נויטרופילים בתרבית של דגימות קבוע/permeabilized. אנו מספקים גם פרוטוקול מפורט עבור צביעת נויטרופילים לחיות עם MUB40. באמצעות פרוטוקול מכתימים נויטרופילים בשידור חי, העיתוי והמיקום של הפעלת נויטרופילים יכול ניתן למצוא. פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור חוקרים המבקשים ללמוד שחרור הפעלה או גרגר נויטרופילים. מעבר שלהם פונקציות מיקרוביאלית, נויטרופילים יתקבלו בברכה עכשיו כתאים immunomodulatory מעורב במגוון רחב של מחלות תגובות מערכת החיסון (מולדת ולא אדפטיבית)1,2. הנויטרופילים הם נוכח רקמות דלקתיות ביותר, במספרים גבוהים ברקמות נגוע, גידולים דלקתיות3, במהלך IBS, קרוהן התלקחויות4, ו באזורים של דלקת שאינן זיהומיות כגון synovia של דלקת מפרקים שגרונית ( חולי RA)5. נויטרופילים להכיל ארבע כיתות של גרגרי הקבועים מראש בשם azurophil (α), ספציפי (β1), גרגרי השלישון (β2) והפרשה שלפוחית (γ)6. על ההעברה לאתר דלקתיות, נויטרופילים מגויס להיות מופעל, ברצף להפריש גרגר תוכן (מורכבת אדהזיה, תרכובות מיקרוביאלית ומולקולות immunomodulatory), אשר מקדם נוסף גיוס ותורמת זיהום רזולוציה (אלא גם כדי נזק לרקמות מארח)7. בעוד נויטרופילים נחשבים היבט חשוב של מולדת חסינות, לצאת לשם עם ריאגנטים זיהוי כמה זמין ללמוד אותן, אפילו פחות כי ניתן להשתמש כדי להעריך את מצב ההפעלה של נויטרופילים לחיות.

שיטות הנוכחי של גילוי נויטרופילים להסתמך על נוגדנים חד-שבטיים שנוצר כנגד אנטיגנים חשוף תא-השטח, כגון Ly - 6 G2 או חלבונים ספציפי המאוחסן בגרגרים נויטרופילים בתנאים הבזליים (למשל, myeloperoxidase לקטופרין). היתרונות של נוגדנים חד-שבטיים כוללים שלהם הנחשב חזק, רגישות, רב-תכליתיות בתנאים assay שונים. עם זאת, ישנם מספר חסרונות באמצעות נוגדנים חד-שבטיים ו- anti-Ly - 6G בפרט. חסרונות אלה כוללים יחודיות, כמו Ly - 6G הוא נוכח במרבית התאים מיאלואידית במח העצם ועל כל גרנולוציטים כולל אאוזינופילים; לפיכך, פיענוח נויטרופילים של אאוזינופילים עם סמן זה דורש יותר מתחמי מתקרב8. עוד חליפין תכופים עם נוגדנים חד-שבטיים הוא בהיקף ירידה לפרטים מארח לעיתים קרובות מוגבל, מקשה על מחקרים השוואה עם מיני בעלי חיים אחד או יותר. החיסרון השלישי של שיטות זיהוי נוגדנים, במיוחד כאשר באמצעות תאים חיים או ויוו, הוא הפוטנציאל שלהם כדי לשבש את תפקוד התא או להוביל ההפעלה התא. לדוגמה, הממשל של אנטי-Ly - 6G לעכברים בדרך כלל חלה על דלדול נויטרופילים, נויטרופניה ארעי9. זה בנוסף הוכח כי הזרקת נוגדנים עשוי לעורר פונקציה antitumor נויטרופילים10. לבסוף, זיהוי נוגדנים של נויטרופילים אינו חושף את מצב ההפעלה של התא.

זיהינו פפטיד חומצה אמינו 40 בשם MUB40, אשר יכול לשמש במספר מבחני תווית נויטרופילים בתנאים במבחנה או ויוו , כמו גם assay את מצב ההפעלה של נויטרופילים בשידור חי11. MUB40 נגזרת70MUB12, תחום של לקטובצילוס reuteri פני השטח מחייב ריר החלבון במקור תיאר את יכולתו לקשור ריר13,14. MUB40 אינטראקציה עם לקטופרין glycosylated הקיים בריכוזים גבוהים בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. יכול להיות חשופים MUB40 גרגירים אלה הצעדים permeabilization סטנדרטי, נוכח histopathology או תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) פרוטוקולים עבור צביעת חזקים של נויטרופילים קבוע. כאשר נויטרופילים לחיות נשמרים במצב מוחלש, פפטיד40 MUB הוא נשלל מן התכנים גרגר, התאים אינו מכתים חיובית עם הסמן. בעת ההפעלה, MUB40 ניתן לאגד לקטופרין חשוף, להוביל מכתים חזקים עם פפטיד. לפיכך, MUB40 יכול לשמש כדי לקבוע את מצב ההפעלה של נויטרופילים מטוהרים, שהופך אותו סמן אטרקטיבי כדי לעקוב אחר תהליך זיהומיות. היכולת לאגד לחיות נויטרופילים הופעל גם מאפשר MUB40 לשמש ככלי, לזהות אזורים דלקתיים נויטרופילים במודלים חיים של בעלי חיים (למשל, מודל דלקת פרקים15העכבר). הפרוטוקולים בפירוט כתב היד הזה איך fluorescently הנקרא MUB40 יכול לשמש כדי לחשוף נויטרופילים ב היסטולוגיה רקמות וכיצד assay את ההפעלה של נויטרופילים מטוהרים חיים במבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן נבדקו ואושרו על ידי ארגוני הצרפתי CoRC (Comité de Recherche קליניק) CPP (des Comité דה הגנה Personnes), CNIL (הועדה הלאומית ואח ליברטה).

1. צביעת נויטרופילים ברקמת Histopathology עם Fluorescently מתויג MUB40

  1. כדי להשיג את הרקמה עבור histopathology, לתקן מקטעים ביופסיה רקמות/נפח מתאים של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 30 דקות עד 4 h תלוי בעובי של המדגם. מקם את הדגימות במקרר 4 ° C במהלך קיבעון.
    הערה: שיטות קיבוע חלופי/תזמונים. הרבה בהתבסס על הצרכים הייחודיים של המשתמש.
    1. להסיר את כדורגלן, להוסיף 16% סוכרוז פתרון עם נפח מספיק כדי לכסות לחלוטין את הדגימה, ולמקם את הדגימה ב 4 ° C ל-4 שעות עד לילה.
    2. הסרת 16% סוכרוז פתרון להוסיף 30% סוכרוז פתרון בכל נפח גדול מספיק כדי לכסות לחלוטין את הדגימה, ומקם אותו ב 4 ° C ל-4 שעות עד לילה.
    3. הסר את הפתרון 30% סוכרוז, למחוק את הפתרון עודף מרקמות עם מגבת נייר. במקום סעיף הרקמה בתקשורת טמפרטורה (אוקטובר) חיתוך אופטימאליים, snap-הקפאת ב- 2-methylbutane מקורר באמבט קרח יבש-אתנול (-72 מעלות צלזיוס). ברגע קפואה (לאחר ~ 2 דקות), להסיר בלוקים מ- 2-methylbutane ומניחים אותם על קרח יבש עד אבני כרגע מוכן לאחסון לטווח ארוך. אחסן את רחובות קפוא ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
  2. בלילה לפני אבני רקמה הן לחתוך, להסיר אותם מן המקפיא-80 ° C, למקם אותם ב-20 ° C בלילה כדי equilibrate.
    1. שימוש של cryostat, OCT-מוטבע רקמות לחתוך לפרוסות בעובי μm 10 - 30, לספוח על שקופיות זכוכית באיכות גבוהה.
      הערה: ניתן להשתמש פרוסות עבה או דק יותר בהתאם לדרישות ניסיוני.
    2. עם עט שעווה או שיטה אחרת הידרופוביות, צייר תיבה מסביב הפרוסה רקמות בשקופית זכוכית ותנו יבש.
    3. להכין את הפתרון צביעת על-ידי ביצוע לדילול 1:1,000 MUB40-Cy5 (או גירסה40אחרים MUB פלורסנט, פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל) ב- 0.1% סאפונין-PBS פתרון. ריכוז40 MUB הסופי אופטימלית צריך להיות 1 μg/mL.
      הערה: ריכוז סופי נמוך יותר ניתן להשתמש (0.1-0.01 μg/mL) אבל עלול לגרום להורדת עוצמת האות.
      התראה: אבקת סאפונין יכול לגרום לגירוי של הנשימות. הקפד לשקול סאפונין באזור ארון או מוגן. ניתן להשתמש בשיטות חלופיות permeabilization כגון טריטון. להוסיף סמנים נוספים בריכוזים מומלץ יצרן (למשל., 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), phalloidin, פלורסנט נוגדנים).
    4. בעדינות לטבול את השקופית זכוכית לתוך פתרון של 0.1% סאפונין-PBS שלוש פעמים.
    5. בזהירות כתם נמצא עודף נוזל סביב סעיף הרקמה ומוסיפים מספיק פתרון מכתימים לכסות לגמרי את סעיף הרקמה. מקם את השקופית לתא לחות כדי למנוע אידוי דגירה זה לשעה בטמפרטורת החדר. . לשמור את זה מוגן מפני אור.
    6. בעדינות לטבול את השקופית בתוך תמיסת סאפונין-PBS 0.1% 3 x. ואז, בעדינות לטבול את השקופית לתוך PBS פתרון 3 x. לבסוף, בעדינות לטבול את השקופית לתוך מזוקקים H2O 3 x. בזהירות יבש עודף נוזל מתוך השקופית.
    7. להוסיף כמות קטנה (~ 20 μL) של הרכבה בינונית (20 מ מ טריס pH 8.0, מספר N-propyl 0.5%, 90% גליצרול) ליד הפרוסה רקמות ולהניח בעדינות למטה coverslip זכוכית על גבי השקופית זכוכית. בעדינות ובצורה שווה הקש את coverslip אל סעיף הרקמה, בעזרת מגבת נייר, הסר בזהירות אמצעים כלשהם הרכבה extrudes מסביב לקצוות של coverslip.
    8. למקם את השקופית הנטען בארון חשוך במשך 24 שעות ביממה לאפשר את התקשורת הרכבה לגבש. לחלופין, במקום השקופית הנטען בגיל 37 מעלות לשעה.
  3. תמונה הפרוסות רקמות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפי שיטת הרכישה הרצוי.

2. הדמיה של הפעלת נויטרופילים עם רטרו-Inverso-MUB40-Cy5 פפטיד

  1. להשיג נויטרופילים האנושי באמצעות פרוטוקול הבאים. להכין את הפתרונות הבאים, מקם אותם בתוך ארון ללון אנאוקסיים. חשיפה לחמצן יתחיל להפעיל נויטרופילים, עוד יותר לגרום לתא המוות16,17.
    הערה: נויטרופילים יכול לחילופין להיטהר "על הספסל" MUB40-תיוג ניסויים; עם זאת, להיות מודע כי חשיפה חמצן יתחיל להשפיע על הפעלת נויטרופילים.
    1. הכן את הפתרון הבא:
      פתרון 1 [נתרן כלורי (NaCl) 0.9%]: הוספת 4.5 גר' NaCl עד 500 מ"ל של H2O. מסנן הפתרון.
      פתרון 2 (לתוספי 6%): להוסיף 6 גר' לתוספי בפתרון 0.9% NaCl 100 מ ל.
      פתרון 3 (מאגר כביסה): להמיס חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב- PBS pH 7.2 כדי ריכוז EDTA הסופי של 2 מ מ. מייד לפני שימוש, להתמוסס שור אלבומין (BSA) בפתרון PBS/EDTA כך הריכוז הסופי של BSA הוא 10% w/v.
    2. צנטריפוגה צינורות איסוף דם ב g x 650 במשך 20 דקות בלי הפסקות.
    3. מבלי לשבש את פעולת הדם מופרדים, העברת צינורות איסוף דם שברים אנאוקסיים בארון, לאסוף פלזמה (למעלה) צינור חרוטי 50 מ.
    4. הסר את הצינור המכיל פלזמה מן הארון אנאוקסיים צנטריפוגה ב 2,900 x g כעשרים דקות עם הפסקות כדי הצניפה טסיות הדם.
    5. מבלי לשבש את פעולת טסיות הדם pelleted, בעדינות העברת הצינור פלזמה בחזרה לתוך ארון אנאוקסיים ו pipet טסיות פלזמה המסכן לתוך צינור מ"ל (להלן נקרא"פלזמה").
  2. הפרדת תאי דם אדומים של לויקוציטים
    1. באמצעות הצינורות המכילים כדוריות דם אדומות (RBCs) משלב 2.1.3., לשלב את RBCs לתוך צינור חרוטי 50 מ ל (5 דם אוסף שפופרת תוכן למחזור 50 מ ל).
    2. הוסף את NaCl 0.9% עד לנפח הכללי מגיע 44 מ. להוסיף 6 מ של לתוספי 6% (האחרונה).
    3. מערבבים בעדינות את תערובת דם/לתוספי על-ידי היפוך הצינור 10 - 20 פעמים. תן המשקע צינור במשך לפחות 30 דקות.
    4. בזמן שקיעת מתרחש, להכין מעבר צבע Percoll על-ידי הוספת 4.2 מ של Percoll פתרון 5.8 מ ל פלסמה צינור חרוטי 15 מ"ל ומערבבים היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית.
    5. לאסוף את השבר העליונים של לתוספי אמנם מנסה למנוע pipetting כדוריות דם אדומות.
    6. להדק את הבורג כובע, להסיר את הצינור לתוספי תא אנאוקסיים, centrifuge את הצינור ב- 300 גרם x 10 דקות עם הפסקות.
    7. בזהירות למקם את הצינור בחזרה אל החדר אנאוקסיים מבלי להפריע את התאים pelleted, ולהסיר את הנוזל דרך pipetting.
    8. בעדינות מחדש להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל של פלסמה ולהוסיף לאט מאוד לחלק העליון של הפתרון Percoll. יש להיזהר לא לגרום ערבוב השכבות כאשר pipetting את התאים למעלה.
    9. הסר בזהירות את הצינור פתרון Percoll מן אנאוקסיים קאמרית (הימנעות ערבוב), והוא צנטריפוגה ב 800 x g במשך 20 דקות בלי הפסקות. תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) יישאר על פני הפתרון Percoll, נויטרופילים גלולה עם RBCs.
  3. הסרת מזהמים RBCs
    1. להכין 14 מ"ל לרחוץ את בופר על-ידי הוספת 700 μL PBS + 10% BSA 14 מ"ל לרחוץ את המאגר.
    2. מקם את הצינור פתרון Percoll בחזרה אל החדר אנאוקסיים. להסיר את Percoll ואת PBMCs ויה pipetting והשהה מחדש את התאים pelleted 1 מ"ל לרחוץ את בופר. בגדר להיות מושעה מחדש יהיה צבע אדום בשל RBCs משחיתה.
    3. להוסיף 200 μL של אנטי-CD235a (glycophorin) beads מגנטי על התאים מחדש על תנאי, מערבבים בעדינות, תקופת דגירה של מינימום של 15 דקות. שלב זה טוען את RBCs מזהמים עם חרוזים מגנטי כך שניתן להסירם.
    4. שטיפת העמודה ההפרדה עם 2 מ של כביסה מאגר 3 x.
    5. בעוד אתה מחזיק צינור חרוטי 15 מ"ל תחת העמודה ההפרדה, pipette לאט לאט את התערובת נויטרופילים/RBC לחלק העליון של העמודה. לאסוף את התאים בצינור חרוט 15 מ"ל כפי שהם זרימה דרך. הזרימה דרך צריך להיות מעונן ולאבד את הצבע האדום בשל RBCs שנותרו מאוגד לעמודה.
    6. להוסיף 2 מ"ל לרחוץ את מאגר לחלק העליון של העמודה ולאסוף בצינור חרוט באותה 15 מ"ל. בסוף לשטוף את 2 מ"ל, הזרימה דרך צריך להיות ברור, המסמלת את כל נויטרופילים שנאסף.
    7. מערבבים בעדינות את הצינור כדי להבטיח הפצה אפילו של נויטרופילים ולאסוף μL 10 לספירת תאים. שימו לב הכרך האחרון עבור תא ספירת למטרות. למנות את המספר הכולל של תאים עם תא סטנדרטי כלשהו לספור בשיטה.
    8. הסר את הצינור נויטרופילים תא אנאוקסיים, centrifuge נויטרופילים ב g x 300 כעשרים דקות עם הפסקות.
    9. במקום נויטרופילים sedimented בחזרה אל החדר אנאוקסיים ולהסיר את המאגר כביסה דרך pipetting. מחדש להשעות בגדר נויטרופילים בפלסמה עם צפיפות התאים המרבי של 107 נויטרופיל/mL.
  4. ספירת נויטרופילים מטוהרים והדמיה באמצעות MUB40
    1. להוסיף 1 μL של רי-MUB40-Cy5 (1 מ"ג/מ"ל) 1 מ ל Rosewell פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני ללא פנול אדום. מערבבים על-ידי pipetting טוב.
    2. למטרות של פרוטוקול זה, התוצאה יש כבר המתוארים כאילו נויטרופילים חזק הפעלת ריאגנט, N-formylmethionyl-leucyl-פנילאלנין (FMLP), הוא הוסיף. להוסיף 1 μm של FMLP RPMI/רי-MUB40-Cy5 צינור מיקס ויה pipetting למעלה ולמטה.
      הערה: כל הליך ניסיוני יהיה שונה מנקודה זו ואילך, בהתאם לשאלות נותרים ללא מענה.
    3. העברה של 1 מ ל RPMI/רי-MUB40-Cy5/FMLP תערובת על צלחת זכוכית מיקרוסקופ התחתון. את המאכל הזה, להוסיף נפח של מטוהרים תאים המתאימים 106 סה כ נויטרופילים. מערבבים על ידי בעדינות pipetting.
    4. למקם את המנה במיקרוסקופ פלורסנט הפוכה ולהתחיל ייבוא תמונות. לדוגמה, מומלץ לרכוש תמונות בסיסית לפני התוספת של נויטרופילים-הפעלת ריאגנט כגון FMLP או חיידקים. בדוגמה זו, הפעל את רכישת RPMI/רי-MUB40-Cy5/נויטרופילים, ו- timepoint מאוחר יותר, pipette הכימית נויטרופילים-הפעלת לתוך קערה מזכוכית ולהמשיך ייבוא תמונות.
      הערה: השינויים שביצעת את השלבים הבאים ניתן לבצע בהתבסס על צרכי מדעי.
    5. תהליך רכש תמונות/זמן-lapse סרטים כמו מתייחס המיקרוסקופ ספציפי משמש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות של MUB40-רקמות מוכתם משקופיות histopathology בדרך כלל לחשוף תאים בודדים פזורים ברחבי הרקמה. MUB40 כתמי לקטופרין, שהוא נוכח בגרגרים נויטרופילים ממודר. לכן, בדרך כלל ראיתי להכתים punctate או במספר תחומים נפרדים גדולים של האות מגיעים בודדים נויטרופילים (איור 1). זה עוזר להוספת סמן התא השני כגון דאפי לעזור לשפה משותפת האות40 MUB עם התא מוכתם. המספר הכולל של תאים שזוהו תלוי המספר של נויטרופילים נוכח שדה הראיה ואת יכול להשתנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

. הנה, שני מבחני מתוארים שבו משמש של פפטיד40 MUB ללמוד דלקת נויטרופילים והפעלה. אנו מראים איך MUB40 יכול לחשוף נויטרופילים להציג בסעיפים histopathology או להציג מצב ההפעלה שלהם באמצעות נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. לשלבים הקריטיים עבור שימוש MUB40 ריאגנט מוכתמים הם בדיוק כמו עם כל שיטה לזיהוי פלורסנט אחרת. יש לנקוט כדי להבטיח תאימות של אותות פלואורסצנט כביסה נאותה צעדים ננקטו כדי להסיר רקע מכתים. השיקולים החשובים ביותר כדי להשיג תוצאות טובות מוכתמים הם האיכות של המיקרוסקופ, זכוכית שקופיו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

B.S.M. מופיע בתור ממציא על MUB40 פטנטים:

MUB40: EP11290403.2 הפטנטים האירופית, 09/09/2011.

רי-MUB40: אירופה EP פטנט מס ' 17306746.3, 11/12/17.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי Fugain. לורט (אם-2015-15) (B.S.M.) Fondation ומענקים ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
MUB40-Cy5Benoit Marteynbenoit.marteyn@pasteur.frפפטיד MUB40 פלואורסצנטי (זמין עם פלואורופורים מצומדים אחרים)
RI-MUB40-Cy5Benoit Marteynbenoit.marteyn@pasteur.frפפטיד MUB40 פלואורסצנטי רטרו-אינוורסו. מסונתז עם חומצות אמינו D ועמיד בפני פרוטאזות (זמין עם פלואורופורים מצומדים אחרים)
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'16005מקבע להיסטולוגיה
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S7903תמיסה המשמשת להסרת עודפי PFA
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)Sakura Finetek USA4583משמש להקפאת רקמות לפני חתך
2-מתילבוטןסיגמא-אולדריץ'M32631משמש להקפאת רקמות לפני חתך קריוסטט
אתנולסיגמא-אולדריץ'1.00974משמש לאמבטיית קרח יבש להקפאת רקמות
Leica CryostatLeica BiosystemsCM1520משמש לחיתוך רקמות
שקופיות מיקרוסקופיה מזכוכיתFisher Scientific12-518-101
כיסוי מחליקמעבדות תורCG15CHכיסוי דיוק גבוה
עט דקו Z377821 סיגמא-אולדריץ'משמש למניעת אובדן נוזלים במהלך צביעת רקמות
SaponinSigma-Aldrich47036משמש לחדירת תאים לצביעה IF
DAPISigma-Aldrich10236276001כתמי DNA 
אלקסה פלואור 488 פלואידין פישר סיינטיפיקA12379קושר אקטין
להאריך זהב אנטי-דהייה MountantFisher ScientificP36930מאריך את אות IF ועמידות בפני פוטוהלבנה
מיקרוסקופ פלואורסצנטישוניםשונים המשמשים להדמיית שקופיות IF
ארון אנוקסישוניםשונים המשמשים לטיהור נויטרופילים חיים מומתים
נתרן כלוריד NaCLSigma-AldrichS7653
EDTASigma-AldrichE9884רכיב מאגר כביסה
MACS BSA bufferMiltenyi Biotec130-091-376רכיב מאגר כביסה
PercollSigma-AldrichP4937שיפוע לטיהור נויטרופילים
CD235a גליקופורין מיקרו-חרוזים מגנטייםMiltenyi Biotec130-050-501משמש להסרת RBCs מזהמים
עמודות LSMiltenyi Biotec130-042-401משמש להסרת RBCs מנויטרופילים
RPMI-1640 ללא פנול אדוםסיגמא-אולדריץ'R8755משמש לבדיקות נויטרופילים
קריוסטט

מקורות

  1. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  2. Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer. Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).
  3. Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. Neutrophils in cancer: neutral no more. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).
  4. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
  5. Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease. Free Radical Biology & Medicine. , (2018).
  6. Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
  7. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  8. Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).
  9. Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection. Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).
  10. Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice. Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).
  11. Anderson, M. C., Chaze, T., et al. MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker. Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).
  12. Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).
  13. Roos, S., Jonsson, H. A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components. Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).
  14. Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria. Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).
  15. Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis. Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).
  16. Walmsley, S. R., Print, C., et al. Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity. Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).
  17. Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function. Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Percoll
פפטיד40 MUB לשימוש באיתור האירועים דלקת נויטרופילים בתיווך
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.