מדידה טמפרטורת גוף העכבר באמצעות מד חום אינפרא אדום במהלך אנפילקסיס מערכתית פסיבי והערכה אלרגיה למזון

סיכום

כאן אנו מציגים שיטה חדשה כדי למדוד במדויק את הבדלי טמפרטורה גוף פסיבי אנפילקסיס מערכתית (PSA), מזון אלרגיה העכבר מודלים באמצעות מד חום אינפרא אדום... הליך זה שוכפל במדויק בתוצאות ה-PSA הקודמת.

תקציר

מדידה טמפרטורת גוף העכבר היא בעלת חשיבות עליונה על חקירת אלרגיה וסימפטומים אנפילקטי. פי הטבעת זונדי טמפרטורות משותף, הם הוכחו להיות מדויק ולא יקר ערך בהקשר זה. עם זאת, שיטה זו של מדידת טמפרטורה דורש העכברים עכשיו כדי להכניס את המכשיר ללא פציעה של החיה. זה מגביל את היכולת להתבונן אחרים פנוטיפים של העכבר בו-זמנית. על מנת לחקור פנוטיפים אחרים תוך מדידת טמפרטורה, הגששים רקטלי אינן אידיאלי, שיטה נוספת היא הרצויה. כאן, אנחנו מציגים שיטה לא פולשנית של מדידת טמפרטורה זה בדרישת הדרישה העכבר הרדמה תוך שמירה על אמינות שווה כדי הגששים רקטלי מדידת טמפרטורת הגוף. אנו משתמשים מד חום אינפרא אדום שמזהה טמפרטורות פני הגוף בטווחים בין 2 ל- 150 מ מ. שיטה זו של מדידת טמפרטורת הגוף הוא מצליח בצורה אמינה שכפול מגמות שינוי טמפרטורה במהלך מערכת פסיבית אנפילקסיס ניסויים בעכברים. אנו מראים כי טמפרטורות פני הגוף הינם כ 2.0 ° C נמוך יותר בדיקה רקטלית מדידות, אך מידת ירידת טמפרטורה בעקבות המגמה זהה. יתר על כן, אנו משתמשים באותה השיטה כדי להתבונן עכברים במודל אלרגיה למזון כדי להעריך את רמות טמפרטורה והפעילות בו זמנית.

מבוא

מדידת טמפרטורת הגוף כבר חלק חיוני של פיקוח על ההשפעות של אנפילקטי הסימפטומים אצל בעלי חיים מודלים^1,2. הבדלי טמפרטורה נמדדו באופן מסורתי על ידי בדיקה רקטלית מדחומים עכברים^3,4. עם מדידות אלה, החוקרים באופן אמין מצטייר הבדלי טמפרטורה בין משתנים; עם זאת, שיטה זו היא הליך זמן רב וגורם מצוקה לעכברים, אשר יכול להגביר את טמפרטורת הגוף. בדיקה רקטלית יכולה גם לגרום קורע ולדלקת הרירית³. יתר על כן, צריך עכשיו העכברים כדי בצורה הומאנית את הגשוש רקטלית כדי למדוד את טמפרטורת³. זהו תהליך איטי, והיא אוסרת על המידה של טמפרטורות רצופים בתוך תקופה קצרה של זמן. יתר על כן, עכברים פעילות פנוטיפים לא יכול להיות שנצפו במהלך תקופה זו עד מההרדמה הוא לחלוטין נשחק, וזה תהליך גוזלת זמן אחר. לאחרונה, שיטות אחרות אמין כדי למדוד את חום הגוף השתמשו subcutaneously מושתל משדר אינפרא-אדום פסיבי תגיות או משדרי הרדיו הכוללים^5,63,חיישן טמפרטורה. למרות שהן מתקבלות כפי המנהג אידיאלי על ידי כמה חוקרים, שיטות אלה הם לא בשימוש נרחב בגלל עלויות ראשוניות גבוהות ומצוקה לעכברים, עקב השתלה כירורגית של חיישן טמפרטורה מתחת לעור או חלק אחר של הגוף.

כדי להדגים כי הפרש הטמפרטורות הוא שיקוף מדויק של סימפטומים מחלת מודל^1,2, עכברים חייב להיות ער במהלך מדידת טמפרטורה ולהיות מסוגל לחזור פעילותם פנוטיפי נורמלי מיד לפני ואחרי המדידה. לשם כך, חיפשנו שיטה שבה זה יכול להיעשות.

מטרתנו הייתה למדוד במדויק ובזול העכבר טמפרטורת הגוף, ללא הצורך בהרדמה, ללא הגבלות על פעילות, כדי לאפשר התבוננות פנוטיפים התנהגותיים במהלך ואחרי הזמן של מדידת טמפרטורה. כדי להשיג מטרה זו, היה ברור כי שיטה פחות פולשנית מאשר הטמפרטורה רקטאלית רגילה רגשים היה נדרש. מדחום אינפרא אדום שימשו במשך עשרות שנים ברפואה קלינית, במיוחד ברפואת ילדים כדי להשיג קריאת הטמפרטורות מדויק. זה כבר שיטה חלופית שמותר לה קלינאים להשיג במהירות ובדייקנות מדידות טמפרטורה בתינוקות וילדים בררן כי הם פעיל ניידים. עלינו ליישם את אותה טכניקה בעכברים, פיתחו שיטה מוצלחת כדי להשיג טמפרטורות ללא הרדמה. חשוב לציין, אנו מראים כי בשיטה זו הוא מסוגל משכפל את התוצאות ומבוססת אנפילקסיס מערכתית פסיבי לגבי שינויי טמפרטורה, בעוד גם היכולת לצפות את הפעילות של העכבר במהלך המדידה. יתר על כן, אנו משתמשים באותה השיטה כדי להעריך את חום הגוף של עכברים אלרגיות מזון, כשחקרו בו-זמנית תסמינים אחרים, כדי להדגים כי טמפרטורת הגוף הוא אכן של שיקוף מדויק של רמת פעילות, ותפקיד הכוללת של עכבר.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של מכון הויה לאלרגיה ואימונולוגיה.

1. עכבר מדידה טמפרטורת גוף במהלך ההרדמה

1. הנח את העכבר בתיבת אינדוקציה הרדמה. עזים ומתנגד באמצעות 1 ליטר/דקה זרימת החמצן עם 5% איזופלוריין.
   הערה: ההרדמה היא מאושרת כאשר העכבר מפסיק התנועה הרצונית, היה משותק עבור מעל גיל 30 s. לחלופין, קצב הנשימה הצג, וברגע עכברים נושמים-נשימה 1 לכל כל 2 s או יותר, הוא אישר ההרדמה.
2. להחזיק את העכבר על ידי העורף של הצוואר עם האצבע והאגודל והחזק את הזנב עם אצבע הזרת על מנת לחשוף את הבטן התחתונה.
3. מקם את חיישן מד חום אינפרא אדום מתחת בבטן התחתונה תוך החזקת את העכבר עם הגוף שלו במקביל לקרקע.
   הערה: שטוח המשטח החיצוני של המדחום (לא השטח של החיישן) צריך להיות כ 2-5 מ מ מהמשטח של הבטן. התוצאה שכפל של טמפרטורות נמדד בזמן עכברים הם לא מרדימים (המתוארת בסעיף 2). חשוב לקבוע אתר היעד של הבטן. מכוון בין שתי פטמות העליון מאפשר תוצאות עקביות.
4. החזק על ההדק כדי למדוד את הטמפרטורה. להבטיח את קיום יציבה העכבר על מד חום.

2. העכבר מדידה טמפרטורת גוף ללא הרדמה

1. הרם את העכבר עד אמצע הזנב.
2. לחשוף את הבטן של העכבר.
   1. לאפשר את העכבר כדי לשמור על משטח ישר-קצה, כגון השפה של הכלוב פתוח או כלוב-העליון עם לרדווד.
      הערה: פעולה זו מאפשרת את העכבר כדי למתוח את הגוף העליון ולחשוף את הבטן.
   2. לחילופין, לאפשר את העכבר כדי להחזיק ישר-הקצה העליון של המדחום, הפוך את העכבר לשבת על משטח שטוח החיצוני של המדחום עם הבטן שלה רק על חיישן אינפרה אדום.
      הערה: בכל עת שכפות רגליו האחוריות מונחות על פני השטח של המדחום, ודא כי כפות הרגליים הם לא הפרעה החיישן מהמשטח בטן. מדי חום עם הרגל חסימה למדוד לך חום נמוך מזה של הבטן.
3. החזק על ההדק כדי למדוד את הטמפרטורה.
   הערה: עכברים נוטים לנוע; תשמרי על מדידת באותו המיקום של הגוף באופן עקבי על ידי לקיחת מידות הטמפרטורה כאשר עכברים הם יחסית פחות נייד

3. פסיבי אנפילקסיס מערכתית⁷

1. יום 0: לרגש עם אימונוגלובולין E (IgE).
   1. להכין µL 200 (לכל עכבר) של אנטי-dinitrophenyl (DNP) IgE-ריכוז של µg/mL 100 ב- PBS.
   2. Intraperitoneally להזריק µL 200 של IgE אנטי-dinitrophenyl (DNP) המבושלות שלב 3.1.1 או PBS בלבד (PBS בלבד היא הפקד שלילי). שימוש במחט 26 גרם להזרקה. לבצע זריקות לרוחב רק האמצע, בערך בין שתי הפטמות נחות ביותר.
2. יום 1: לגרום אנפילקסיס עם DNP-HSA.
   1. להכין µL 100 (לכל עכבר) של DNP-HSA-ריכוז של 10 מ"ג/מ"ל ב- 0.9% NaCl.
   2. עזים ומתנגד העכברים כפי שמתואר בשלב 1.1.
   3. למדוד את טמפרטורת הגוף משתמש בטכניקה המתוארת בשלב 1.
   4. מזריקים לווריד µL 100 של DNP-HSA מוכן בשלב 3.2.1. שימוש במחט 30 G להזרקה. לבצע הזריקות על הסינוס ורידים retroorbital. הכנס את המחט בצד המדיאלי של העין בזווית של רדוד, מכוון מאחורי העין.
   5. לאחר ההזרקה, הצב והעכברים בכלובים בודדים. ודא כי העכברים לשחזר מן ההרדמה. שים לב כי הם מתעוררים ולהיות ניידים בהתנדבות.
   6. למדוד את חום הגוף באמצעות מד חום אינפרא אדום ולבחון את פעילותם בכל 10 דקות במשך 70 דקות.

4. העכבר מודל של מזון אלרגיה^8,9

הערה: התרשים מוצג באיור2.

1. יום 0: לרגש העכברים עם ביצית/אלום.
   1. להכין µL 100 (לכל עכבר) של ביצית (0.5 mg/mL), אלום (10 mg/mL) ביחד ב- PBS. מערבולת על ההגדרה נמוכה במשך 30 דקות.
   2. עזים ומתנגד העכברים כפי שמתואר בשלב 1.1.
   3. באמצעות מחט 26 גרם, מזריקים intraperitoneally העכבר כל 100 µL של ביצית/אלום תערובת מוכנה בשלב 4.1.1.
      הערה: מערבולת התערובת ביצית/אלום שוב, בקצרה לפני כל זריקה, הכי טוב לוודא תערובת homogenized. ראה שלב 3.1.3 לפרטים באתר הזרקת.
   4. לאחר ההזרקה, עכברים המקום בחזרה בכלובים המקורי שלהם. ודא כי העכברים לשחזר מן ההרדמה. שים לב כי הם מתעוררים ולהיות ניידים בהתנדבות.
2. יום 14: מבצע רגישות עולה השני עם ביצית/אלום.
   1. חזור על שלבים 4.1.1 4.1.2, 4.1.3.
3. בימים 28-46: אתגר העכברים עם ביצית בכל יום אחר.
   1. להכין µL 100 (לכל עכבר) של ביצית-ריכוז של 250 מ"ג/מ"ל ב- PBS.
      הערה: התערובת צריכה להיעשות על ידי בעדינות להתנדנד הלוך ושוב ביד מאשר עם מערבולת כדי למזער את היווצרות בועה.
      1. אם בעזרת מעכבי אלרגיה למזון, להכין את מעכבי⁹. להכין µL 100 (לכל עכבר) של מעכב-ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל ב- PBS. דבר זה מאפשר משלוח של 100 µg של מעכב עבור כל עכבר.
         הערה: לא יעלה על 100 µL של מעכב לכל העכבר, כפי העכברים מסוגלים רק לטפל µL 200 נפח gavage סה כ במהלך יום אתגר אחד. ככל 100 µL נחוצים גם האתגר ביצית, 100 µL הוא המספר המירבי מומלץ נפח לשימוש מעכב.
   2. עזים ומתנגד העכברים כפי שמתואר בשלב 1.1.
   3. אורלי gavage כל עכבר עם 100 µL של הפתרון ביצית (25 מ"ג של ביצית ב 100 µL ל- PBS gavaged לכל עכבר) הוכנה בשלב 4.3.1.
      1. אם משתמש מעכבי, לנצל אותן טכניקות שמתואר השלבים הבאים gavage מעכב (או שליטה PBS) מוכן בשלב 4.3.1.1 30 דקות לפני האתגר ביצית. לאחר 30 דקות, להמשיך הלאה לשלב הבא.
      2. שימוש במחט gavage עם מזרק 1 מ"ל. לקחת את µL 100 של ביצית לתוך המזרק.
      3. את המחט לתוך הפה; לאחר מכן, לכוון את המחט לכיוון שמאל או צד ימין של הגרון, החלק בעדינות את המחט דרך הוושט. מזריקים µL 100 של ביצית.
         הערה: כדי להבטיח כי המחט אינה לקנה, להתבונן פעיל נושם לפני הזרקת ביצית. גם התנגדו החדרת המחט מוקדם אם היא נכנסה קנה הנשימה ולא הוושט.
   4. למקם את העכברים שלהם בכלובים בודדים. לשימוש התבוננות קלה באיכות צואה, כלובים ללא מצעים.
   5. ודא ההתאוששות מן ההרדמה. שים לב כי העכברים להתעורר ולהיות ניידים בהתנדבות.
   6. למדוד את חום הגוף של העכברים-timepoints 10, 20, 40 ו- 60 דקות בטכניקה המתוארת בסעיף 2.

תוצאות

אנפילקסיס מערכתית פסיבית: להזרקה הרביעי, שבוע 10 עכברים BALB/c הנשי הישן היו מרדימים. לפני הזריקה, מדדנו את חום הגוף שלהם (Video 1) כפי שמתואר בשלב 1. איור 1 מציג את המגמה טמפרטורה של שתי האוכלוסיות לאחר ההזרקה הרביעי. העכבר רגיש-IgE הראה ירידה טמפרטורה מקסימלית של 3.0 מעלות צלזיוס ב 20 דקות, בעוד העכבר שליטה PBS היה טיפה המרבי של 1.1 ° C-20 דקות⁷. יתר על כן, במהלך תהליך זה, פעילות הציונים הוערכו בהתבסס על הניידות של ה...

דיון

הפרוטוקול המתואר הוקמה במטרה מדידת טמפרטורת הגוף ללא השימוש בהרדמה. למרות שלו בקלות יחסית עם איזו טמפרטורה ניתן להשיג קריאת, ישנם מספר אזהרות להכיל טכניקה זו, בנוסף ההשפעות ברורה יותר כגון: טיפול שונות בטמפרטורות הסביבה והמתח.

ראשית, על מנת לשמור על טמפרטורות עקבי לאורך כל הניסוי, המיקום שבו הטמפרטורה נמדדים חייב להיות מראש באמצעות ציוני דרך אנטומיים, ועל החוקרים להיות אפשרות לשכפל את המדידה של הגוף אמר מיקום. על-ידי אבטחת forepaws של העכבר על משטח ישר-קצה, כגון שפתו של כלוב או על הקצה של המדח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדחום אינפרא אדום ללא מגע	SinoPie	DT-8861
אנטי דיניטרופניל (DNP) IgE	Sigma Aldrich	D8406-.2MG
PrecisionGlide 30 G מחט	BD	305128
מחט PrecisionGlide 26 G	מזרק BD	305111
1 מ"ל	BD	309659
Dinitrophenyl - אלבומין סרום אנושי	Biosearch Technologies	D-5059-10
Ovalbumin מחלבון ביצת עוף	Sigma Aldrich	A5503-50G
Imject Alum	ThermoFisher Scientific	77161
מחטי האכלה לבעלי חיים, חד פעמי	Fisher Scientific	01-208-87