הפוך לנתיחה ונתונים DiceCT לחשוף אחרת מוסתרים באבולוציה של הפנים הפרימטים

סיכום

הבעות פנים הם מצב של תקשורת חזותית המיוצר על ידי השרירים מימטי. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים עבור טכניקות הרומן של דיסקציה הפוכה ו- DiceCT כדי להמחיש באופן מלא להעריך מימטי השרירים. טכניקות משולבות אלה ניתן לבחון היבטים מורפולוגיים פיזיולוגיים של מערכת השרירים מימטי כדי לקבוע היבטים פונקציונליים.

תקציר

הבעות פנים, או מציג פנים, כוונות חברתיות ורגשיות מופקים על ידי רבים taxa יונקים כאמצעי תקשורת חזותית עם בני מינו מטווח קרוב. אלה מציג מושגות על ידי התכווצות של השרירים מימטי, אשר הם שרירי השלד מחובר הדרמיס של הפנים. הפוך לנתיחה, מתקרב השרירים מימטי בין הסרת המסכה מלא פנים הגולגולת לאחור, הוא יעיל אך הרסני דרך. לגלות המורפולוגיה של השרירים מימטי אבל זה הוא הרסני. DiceCT הוא מנגנון להמחיש שרירי השלד, לרבות שרירי מימטי של בידוד שרירים בודדים fascicles למדידה כמותית. בנוסף, DiceCT מספק מנגנון הרסניות להמחשת השרירים. טכניקות משולבות של דיסקציה הפוכה, DiceCT יכול לשמש להערכת המורפולוגיה אבולוציונית של מערכת השרירים מימטי וכן פוטנציאליים עוצמת ההתכווצות של מהירות השרירים האלה. מחקר זה בהמשך מדגים כי DiceCT יכול לשמש כדי בדייקנות ובאמינות להמחיש השרירים מימטי וכן הפוך לנתיחה, מספקות שיטה גמישה דגימה מימטי השרירים.

מבוא

מערכת השרירים מימטי, או הבעת פנים לשריר, שרירי השלד ואת נמצא בכל היונקים¹. בעוד ביותר בתרבית של שרירי השלד מייחסת דיסקרטית ציוני הגרמי, מערכת השרירים מימטי הוא ייחודי מצורפים בעיקר לתוך העור של הפנים, הקרקפת, ההיבט הגחון של הצוואר^{1,2,3, 4}. התכווצות השרירים מימטי מתעוות "מסיכת פנים" לתוך ביטויים או טיפול פנים מציג כוונות חברתיים ורגשיים, משנה את הגודל והצורה של הפעלת הספינקטרים של העין, חלל האף, חלל הפה בשימוש בהאכלה, נשימה, וב -vocalizations, והוא חלק ממנגנון תקשורת חזותית בסך הכל סגור-הקרבה בקרב רוב היונקים^2,3,4,5. בין היונקים, מציג פנים שנוצר על ידי השרירים מימטי לסייע וויסות ושמירה על גבולות טריטוריאליים, קשרים חברתיים, לבין קבוצה חברתית מאת cuing בני מינו על כוונות השולח את^{2, רגשיות והתנהגותיות 5}.

בקרב יונקים, פרימטים מאופיינים חלק כמו העסקת רמה גבוהה של התנהגות חברתית לאורך כל מחזור החיים של כל המינים החיים^2,קבוצה חברתית⁵. בעוד כמה taxa, כגון galagos ליליים של lorises, יחיו בקבוצות המורכב רק של אמא, הצאצאים, taxa אחרים, כגון קופי מקוק ההשתנות היומית, בבונים, עשוי לחיות בקבוצות של מעל 100 אנשים⁶. לא משנה גודל הקבוצה החברתית, פרימטים מרבים להשתמש הסטראוטיפי התנהגויות חברתיות הקשורות דרגה ולא הטריטוריאליות והתנהגויות אלו כוללות בדרך כלל רכיב התצוגה פנים. צגים פנים הם חלק מהתהליך של שמירה על קשרים בין חבר של קבוצות חברתיות, הדומיננטיות הירארכיות, רבייה, התקשורת היא חלק מחיי היומיום, במיוחד אצל מינים ההשתנות היומית^2,5,7 . בעוד היה ברור כבר כמה זמן את מערכת השרירים פנים משמש ליצירת הצגת הפנים האלה, זה רק לאחרונה הפך גלוי פנים מערכת השרירים טופס ופיזיולוגיה קשורים עם דרישות פונקציונלי של משתנים חברתיים^{2, 8}. מחקרים קודמים על טווחים phylogenetically, בהתנהגותו מגוונות של יונקים הראו כי ההשתנות היומית מינים חיים גדולים, קבוצות חברתיות מורכבות נוטים להיות בעלי מספר גבוה של מציג פנים דיסקרטית פוקוס על חופש התנועה של השפתיים, גבות, העפעפיים עם מספר גבוה של שרירי הפנים התקבצו סביב השפתיים מסלולית באזור⁹. לעומת זאת, היו כמה מחקרים על לילית מינים חיים בקבוצות קטנות, אך מינים אלה יש מספר גבוה של שרירי הפנים דיסקרטית עם קבצים מצורפים סביב האוזן החיצונית השפתיים, אשר עשוי להיות קשור עם תנועות של האוזן ואת השפתיים (אשר תועדו מספר מינים הלילית היתה ללא-חת מפגשים עם בני מינו ואיתור צלילים)^2,9,10,11. בנוסף, בני האדם יש אחוז גבוה יחסית של סיבים צולבות הקישור חוטים שרירן איטי עווית השרירים מימטי מאשר קופי מקוק רזוס או השימפנזים, אשר עשויה להיות קשורה את "מאט" התכווצות של האדם מימטי השרירים סביב השפתיים בשימוש בתהליך הייצור של קולות דיבור או עייפות כללית-התנגדות היכולת של השרירים⁸.

בני אדם הן, ללא ספק, הכי חברותי של כל יצירי, פיתחו שפה כמו מרכיב אחד של תקשורת חברתית. עדיין, למרות זאת, בני אדם להשתמש הבעת פנים, כאמצעי תקשורת חזותית ויש הרפרטואר להציג פנים מוכרות הגדול ביותר בקרב פרימטים. במאמץ יותר לגמרי מבין המשתנים המקיפים את האבולוציה של התנהגות חברתית אנושית וכללית הפרימטים, הבנה מוגברת של המורפולוגיה ופיזיולוגיה של מערכת השרירים מימטי הפרימטים הוא רצוי מאוד. כי מערכת השרירים מימטי מצורפת על העור עצמו וייתכן, במינים מסוימים, דקה במיוחד שקשה לדמיין, פיתחנו שיטה ייחודית של להמחיש את מערכת השרירים עבור שני התהליכים של הקלטה ברוטו נוכחות/היעדרות ו קבצים מצורפים, כמו גם דגימה לצורך עיבוד microanatomical.

"הפוך לנתיחה" היא שיטה לשמר את מערכת השרירים מימטי על ידי הסרת את כל מסכת הראש והגדלת הנראות של השרירים אפילו קטן. בגלל הקרע הפוכה הוא תהליך הרסני, דגימות נדיר ורב ערך אולי לא תמיד תהיה זמינה עבור מתודולוגיה זו. DiceCT היא שיטה יעילה שיכולים להמחיש רבים של השרירים מימטי מינים קטנה^12,13,14. ניתן להשתמש בשיטה זו ביחד עם ניתוח הפוך או במקרים לא עשוי להיות גזור ואיפה יכול לספק מידע רב בלי להסיר את מסכת "הפוך לנתיחה"^{12,13, דגימות נדיר, יקר 14}. בפרוטוקול הנוכחי מתאר קבוצה של שיטות לשילוב לנתיחה הפוכה עם DiceCT כדי לבחון את מערכת השרירים מימטי הפרימטים.

פרוטוקול

כי הליכים אלה להשתמש בבעלי חיים מת מוות טבעי בגני או הוקרבו במעבדות מחקר שבו הם היו חלק שלא קשור ללימודים, פרוטוקולים אלה אינם מחייבים אישורי IACUC.

1. הפוך לנתיחה

הערה: הפרוטוקול עבור ניתוח הפוך יעיל עבור יונקים קטנים מאוד, כמו עכברי מעבדה, כל הדרך עד יונקים גדולים בארץ, כגון הסוס המקומי. השרירים מימטי לעיתים קרובות השמורה, דמיינו בצורה הטובה ביותר כאשר עזב עם הדרמיס שמעליה במקום להשאיר אותם על הגולגולת. ראה איור 1-3.

1. Disarticulate ראש צוואר הרחם חלקי בעמודה השדרה לפני הליכים לנתיחה. אם הגופה מוקפא, לאפשר להפשיר לחלוטין לפני שממשיכים שלב זה.
   1. ללא תלות במצב השתמרות, ימשש הוא מעולף הגולגולת ולאורך של חוליית הצוואר השנייה (C2). שימו לב כי צוואר הרחם החוליה הראשונה (C1) חסר תהליך קוצניים, אז palpating C2, הוא מעולף הגולגולת ייתן המיקום המשוער של C1.
   2. באמצעות אזמל, לבצע חתכים אופקיים בין הוא מעולף הגולגולת C2 כדי להתחיל להפריד את הגולגולת בין בעמודה השדרה-C1. המשך לבצע חתכים עד הגולגולת כרותה מ עמוד השדרה.
   3. אם הדגימה מבולבל ורענן, צעדים 1.1.2-1.2 צריך להתבצע במסגרת זמן קצרה יחסית. בנוסף, אם המוח נשאר שלם בתוך חלל הגולגולת, נמק של רקמה עצבית יכול להמשיך במהירות, לכן מומלץ כי המוח ניתן להסיר מן הגופה אם הדגימה הוא להישאר מבולבל
      הערה: בתור שלב אופציונלי, הדגימה יכול להיות שקוע בתוך 10% buffered פורמלין למשך 24 שעות על מנת לתקן את הדגימה. זה יאפשר הליך איסוף נתונים ומדודים.
   4. אם הדגימה כבר קבוע עם אתיל אלכוהול או 10% buffered פורמלין, לשטוף במשך כמה שעות עם מים מתוקים.
2. לעשות חתכים לשחרר את מסכת פנים מהגולגולת. אם את המוח ואת המכסים calvaria הוסרו במהלך necropsy, לבצע חתך אחד ליד האזור glabellar של הגולגולת, נוספת לאורך האספקט סימטרית של הגולגולת שבו עצם הגולגולת לא נפגע.
   1. לאחר מספר שעות כבר שטפה את הדגימה, ומייבשים עם מגבות נייר והעברת לעבודה התחנה.
   2. ימשש עבור בליטה חיצונית בקצה סימטרית (או אחורי) של הגולגולת. זה מסמן את האזור שבו הגולגולת פוגש את עמוד השדרה. באמצעות אזמל #4 דגימות גדולות או איזמל #3 עבור דגימות קטנות, עושים חתך קו אמצע שמתחילים בבליטה חיצונית, מגיע rostrally (או קדימה) השתלטה על האזור הקודקוד הקדמי של הגולגולת, השתלטה על האזור מסלולית ו בין העיניים, למטה באזור האף, כל הדרך דרך אזור האף חיצוני בין נארס.
   3. לעשות חתך על הלסת התחתונה בין החותכות התחתון, מרכזי וזוז. הקליפה (או הפוך) לכיוון עצם הבריח.
   4. לבחור צד אחד של מסיכת הפנים כדי להסיר ולהשאיר בצד השני במקום.
3. שחרור צד אחד של מסיכת פנים מהגולגולת.
   1. החל הוא מעולף, השימוש את האזמל לחתוך את מסכת פנים, כולל מימטי לשריר, מן העצם העורפית של הגולגולת, מושך את המסכה rostrally (או קדימה) ו רוחבית (על הצד). חותכים את השריר occipitalis מן הגולגולת, להשאיר כמות קטנה של השריר מאחורי הגולגולת כך הקשר שלה עדיין להיות visualized ברגע הוסרה המסכה לפנים. על ידי השארת חלק כלשהו של השריר מאחורי על הגולגולת גרמית/הסחוס, ניתן לשמר קבצים מצורפים עבור הקלטה במועד מאוחר יותר.
   2. ברגע האוזן נפגע, אתר את השרירים אוריקולארית. לחתוך אותם כך חלק קטן של כל אחד נשאר עם הגולגולת. לחתוך דרך הסחוס האלסטי לצרף את האוזן החיצונית הגולגולת.
   3. ממשיכות למשוך את המסכה rostrally ולשחרר כל שריר מימטי של הגולגולת על ידי השארת חלק קטן של כל שריר מאחורי על הגולגולת.
   4. ברגע שיש מסכת פנים שלם מצד אחד של הגולגולת, לאפשר לו לשבת בחוץ, נחשפים לאוויר, במשך שעה (עבור דגימות קטנות כמו עכבר מעבדה) עד שלוש שעות (עבור דגימה גדולה כמו סוס מקומי), עם הצד מערכת השרירים פונה כלפי מעלה. שלב זה desiccates של רקמת החיבור על מסכת פנים ומגביר ניגודיות הצבעים בין משרירים ורקמות.
4. הסרת רקמת מספיק לדמיין מערכת השרירים.
   1. באמצעות #3 אזמל, מלקחיים, microscissors, לשלוף משם רקמת חיבור שמפריד את מערכת השרירים מימטי בין אחד לשני.
   2. כדי לגשת השכבה השטחית של מערכת השרירים מימטי ב הזה "לנתיחה הפוכה", בעדינות להרים, להפריד בין השכבה העמוקה של השרירים לבין השכבה השטחית ולהסיר ברקמות החיבור שעוטפות את מערכת השרירים השטחית. מסיכת הפנים וכתוצאה מכך שאפשר יהיה להחזיר את פורמלין, ניתן להשהות את ההליך פה לפני שהוא עובר ניתוח נוסף או צביעת (שלב 2). בכל שלב להתערב ב נוספות לנתיחה, לאפשר את מסכת פנים יבש מספיק כך רקמת חיבור מבחינים בקלות של רקמת שריר.

2. להכתים את תהליך עבור DiceCT

הערה: דגימות חייב להיפתר בפורמלין 10% buffered אם DiceCT היא לשמש על מנת לשמר את הרקמה במהלך ההליך מכתימים ממושך. אם הדגימה עדיין לא תוקנה, למקם אותו במיכל עם פורמלין 10% buffered מספיק כדי להטביע את כל רקמת ולהשאיר את זה למשך 48 שעות.

1. להפוך את פתרון יוד של 1.75% (m/v) Lugol (אני₂קי) עבור צביעת מסכת פנים.
   הערה: ודא מספיק₂קי פתרון מלא ומטביעים את מסיכת הפנים בתוך המיכל שבחרת. לעשות פחות או יותר הפתרון בעזרת שינוי ערכי של מומסים בגבול וגם הממס באותה מידה בשלבים 2.1.1 ו 2.1.2.
   1. ברדס fume, להוסיף גרם 3.50 אשלגן יודיד (KI) 200 מ ל מזוקקים מים בתוך זכוכית גדול. מערבבים בעזרת זכוכית זע רוד עד התפרקה לחלוטין.
      התראה: אשלגן יודיד (KI) יכול לגרום לעין, העור, ואת גירוי בדרכי הנשימה או נזק. ללבוש מגן eyewear, להתמודד עם ברדס fume.
   2. לאט לאט להוסיף 1.75 גרם של גבישי יוד (אני₂), תוך ערבוב עד התפרקה לחלוטין. זה ייקח מספר דקות.
      התראה: גבישי יוד (אני₂) יכול לגרום לעין, העור, ואת גירוי בדרכי הנשימה או נזק. לענוד הגנה העין ועור ולעבוד תחת ברדס fume בזמן הטיפול הכימי.
   3. פתרון סינון לתוך בקבוק זכוכית ענבר באמצעות נייר סינון עם גודל הנקבוביות 11 מיקרון כדי להסיר את כל הגבישים undissolved עלול להצמיח מכתימה לא עקבי.
      התראה: פתרון זה הוא רעיל מאוד לחיים הימית. אל תשליך של פתרון תקוע. במקרה של נוזלים, לנטרל טרילודייט מימית (אני₃^–) לתוך יודיד (I^–) עם 5% (m/v) נתרן תיוסולפט (נה₂S₂O₃). בדוק מדיניות מוסדית לסילוק פסולת של יודיד והשלך את הבזבוז הזה בהתאם.
2. מכתים את מסיכת הפנים.
   1. מקם את מסיכת הפנים לקצץ בצד בכוס אמבר או ההכרה מיכל (לשמור את האור) גדול מספיק כדי לאפשר את מסיכת הפנים לנוח במצב טבעי וכדי לחלוטין מתחת לפני המים.
   2. שופכים יוד פתרון של Lugol מסיכת הפנים עד זה לגמרי שקוע. משקל עשוי להיות נחוץ כדי לשמור את מסיכת הפנים לגמרי שקוע ולמנוע ממנו צפה לחלק העליון של הפתרון. חותם את המיכל כדי למנוע אידוי ולשמור את האור.
   3. להתסיס את המיכל ללא הרף על נדנדה חשמלית או באופן קבוע ביד כדי להקל אפילו מכתים ולמנוע קריסטלים להתפשר לפחות שבועיים. אם זמן רב יותר יש צורך שלמאחה מכתים את fascicles שרירים, להחליף הפתרון של Lugol עם פתרון טריים.
   4. אחרי שבועיים, להסיר את מסיכת הפנים מן הפתרון. שופכים כמות קטנה של מים מזוקקים הרוחבי מסיכת הפנים ולשטוף. לעטוף את מסיכת הפנים במגבות נייר ומניחים בתוך שקית ניילון אטום לפחות 24 שעות לאפשר ייבוש קלה לפני שהוא עובר לשלב הבא.
      הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות במשך שבוע. להבטיח מסיכת הפנים יישאר לח מעט בתקופה זו.

3. DiceCT סריקה

1. להכין מסכת פנים סריקות CT.
   1. הר מסכות פנים על גבי חומר בצפיפות נמוכה, כגון קצף פרחוני, לחסל את כל הקמטים במסכה וכדי להגביל את התנועה של המסכה כפי המסכה מייבשת מעט במהלך סריקה. אבטח את מסיכת הפנים את קצף עם קיסמי שיניים מעץ.
2. הגדרת הפרמטרים בדיקת ct וסריקה.
   1. השתמש ברזולוציה גבוהה עבור סריקות אלה, fascicles קטן יהיו מוסתרים ברזולוציה נמוכה יותר. השתמש של המרווח הבין-פרוסה, אינטר מרחק בפיקסלים בסביבות 0.05 מ"מ.
   2. סרוק את מסכת פנים רכוב על להדפסה ברזולוציה גבוהה רנטגן שחושב טומוגרפיה סורק.
   3. אם fascicles לא מסוגלים להיות מלא דמיינו, עקב יתר מכתים, מקם מסכת פנים לתוך פתרון פורמלין 10% או 5% נתרן תיוסולפט כדי להסיר חלק הכתם. אם fascicles לא מוכתמים מספיק, להחזיר לפתרון יוד של Lugol. לאחר התאמת ההכתמה, לסרוק את מסיכת הפנים שוב. להמשיך לעשות את ההתאמות הנחוצות ולסרוק עד fascicles מסוגלים ניתן לאבחן באופן מלא.

4. הכן את מסיכת הפנים לשימור לטווח ארוך.

1. מבחינה כימית לנטרל את הכתם יוד במסכת פנים, הסרת צבע תהליך צביעת.
   1. המקום צבעונית מסכת פנים בתוך תמיסת נתרן תיוסולפט 5% (m/v) לנטרל כימית הדגימה. פעולה זו עשויה להימשך מספר שעות או מספר ימים. להתסיס באופן קבוע במהלך destaining.
   2. לחזור מסכת פנים destained 10% הפתרון פורמלין לשימור. אם הכתם ממשיכה ליץ מחוץ הדגימה בתוך תמיסת, החלף פורמלין דהוי פורמלין טריים עד נותר ברור לשימור לטווח ארוך.

תוצאות

סעיף זה מציג דוגמאות של תוצאות טופס פנים מערכת השרירים ניתן להשיג באמצעות "הפוך לנתיחה" בהופעה עם DiceCT סריקה. באמצעות "הפוך לנתיחה" ליצירת מסיכת הפנים, ייצוג פולר של השריר (פנים) מימטי לפעמים ניתן לראות מאשר מתודולוגיה ניתוח מסורתי. שיטה זו פועלת על מגוון של הגוף גדלים מ לקופים זעירים, גוף קטן, לדוגמה נפוצות מרמוסט ההצטרפות נקראו Callithrix (איור 4), כדי שאזיקת יונקים כמו השימפנזה פאן שוכני מערות (איור 5), ו ה...

דיון

בעקבות צעדים "רוברט הפוכה" פרוטוקול בדרך כלל מייצר מסיכת הפנים זה יכול להיות באיטיות ובשיטתיות גזור כדי לחשוף מימטי לשריר, ללא קשר לגודל של הראש. זה חשוב במיוחד לאט לאט, להעריך באופן רציף אם השרירים לחלוטין שנחתכו באמצעות בשוגג, במיוחד קטנות בטעמי מינים.

על מנת לקבוע היכן ממוקם מערכת השרירים, זה קריטי במיוחד את המסכה המתפתח להתייבש בשלבים כדי להעריך באופן שוטף רקמת חיבור לעומת רקמת השריר. אם רקמת נשאר במקום על המסכה, מערכת השרירים לא יהיה גלוי, לכן חשוב להסיר את רקמת חיבור רב ככל האפשר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Nikon XTH 225 ST	Nikon		ללא מספרים קטלוגיים
10% פורמלין חוצץ Fisher	Scientific	SF98-4
יוד, ACS Grade	Lab Chem, Inc.
נתרן תיוסולפט	Acros Organics	AC450620010
אשלגן יודיד	אלפא Aesar	A1270430

LC155901