. הנה, עבור בידוד ואפיון של CD4 פרוטוקול+ T-cell קבוצות משנה של דם היקפיים אדם מתואר. לטהר CD4+ תאי-T הם נותחו על ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של T-הזקיקים תא מסייע קבוצות משנה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של CD4+ תאי-T וניתוח של מחזורי Helper T-הזקיקים (cTfh) קבוצות משנה תא מ באמצעות דם היקפיים של Cytometry זרימה 6-צבע
במאמר זה
סיכום
תקציר
חריגה הזקיקים-T helper (Tfh) תא לזיהוי של מחלות אוטואימוניות ולא נוכחותם קשורה עם התוצאות הקליניות כאשר הצומת לימפה microenvironment ב B-cell לימפומה שאינה הודג'קין של ניתוח. קבוצות משנה של מחזורי T-helper תאי (cTfh), תא זיכרון מחזורי Tfh תאים בדם, הם גם מוטרד במחלה, לפיכך מייצגות פוטנציאל סמנים ביולוגיים חזוי הרומן. בדיקות מבוססות-דם היקפיים היא יתרון כי היא יחסית לא פולשנית, מאפשר ניטור טורי פשוטה. מאמר זה מתאר שיטה אנליטית CD4+ תאי T-דם אנושי, ולאחר ניתוח נוסף מאת cytometry זרימה לספור תאים cTfh, את הפרופורציות של קבוצות משנה שונים שלהם (cTfhPD-1-/ + / שלום, cTfh1, 2, 17 ו- cTfh1/17). הרמה של קבוצות משנה אלה השוו בין נושאים נורמליים, חולים עם לימפומה. מצאנו כי שיטת הפעולה היתה יציבה מספיק כדי להשיג תוצאות אמינות של החומר המטופל שנאספו באופן שגרתי. הטכניקה שנתאר לניתוח ניתן להתאים בקלות מיון תא ויישומים במורד הזרם כגון RT-PCR.
מבוא
T-helper תאי (Tfh) הם CD4+ משנה T-cell שאפיינו היה בתחילה רקמות הלימפה1. תאים אלה מביעים PD-1 קולטנים משטח CXCR5, מפרישים IL-21 ו- IL-4 ולהראות ביטוי הגרעין של הגורם שעתוק, BCL-62,3. כפי שמרמז שמם, הם נמצאים במרכזים נבטי, הם חיוניים עבור ייצור נוגדנים זיקה גבוהה1.
תגובות Dysregulated Tfh היו מעורבים בפתוגנזה מחלה, מחלות אוטואימוניות שהבולט, איפה הם מקדמים את התרחבות autoreactive B תאים4. הם גם לשחק תפקיד microenvironment הגידול של סרטן הלימפה7והן מוצק5
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימות דם, התקבלו נושאים נורמליים (NS) (n = 12) כמו גם בחולים עם לימפומה אזור שוליים (MZL) (n = 7) ובסוגים אחרים של B-cell לימפומה שאינה הודג'קין של (BNHL) (פל 6 חולים, חולי לימפומה lymphoplasmacytic 2 ו 1 בדרגה נמוכה B-cell לימפומה הודג'קין לא צוין אחרת החולה). חולים גויסו מן המרפאות המטולוגיה-במרפאה המלכותית לסטר לאחר בנתינתו הודיעו, הסכמה בכתב, באישור אתית במקום עבור כל מחקרים. אישור מוסרי היה מתקבל על ידי לאיססטרשיר, נורת'האמפטונשייר ראטלנד מחקר אתיקה הוועדה 1, התייחסות 06/Q2501/122 רשות המחקר תקינות (HRA) NRES ועדת מזרח המידלנדס-הדרבי ודוגמאות החולה, הפניה 14/EM/1176 עבור נושאים נורמליים.
1. בידוד של CD4+ T-תאים מדם היקפי לגמר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
CD4 גבוהה+ טוהר הושג באמצעות CD4 את+ בידוד פרוטוקול, אשר היה אמין בכל הדוגמאות הדם נבדק על ידינו (כלומר: 96.6%, SD: 2.38, n = 31) (איור 3).
זיהוי של cTfh (CD4+ CXCR5+ תאים) בנושא נורמלי נציג מוצג (איור 4א). חלקם של cTfh הכולל תאים בתוך CD4+ תאים היה ערך החציוני של 29.4% (הבין-הרביעון טווח (IQR) = 10.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מייצג דרך פשוטה ויעילה כדי לנתח את היקפי cTfh כדוריות הדם, המאפשר הזיהוי של כל קבוצות משנה רלוונטיים שזוהו עד כה בספרות. דגימות דם ניתן בקלות וביעילות להשיג כפי ניתן לאסוף חלק סטנדרטי-חולה מרפאות ודוגמאות טורי במקביל נתונים קליניים. בתורו, פעולה זו מאפשרת מחקרים להערכת ערכות משנה cTfh כמו סמנים ביולוגיים עבור התקדמות המחלה או התגובה לטיפול. מחקרים אלו להיות מוצדקת במיוחד מחלת איפה Tfh dysregulation מעורבים בפתוגנזה כגון מחלת חיסון עצמי וסוגים מסוימים של סרטן haematological ומוצקה. בנוסף, השינויים בתפקוד cTfh .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
העבודה נתמך על ידי מענק של לוקמיה בבריטניה ETB ו MJA.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment קוקטייל | STEMCELL TECHNOLOGIES | 15062 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17144003 | |
| BUV395 עכבר אנטי אנושי CD183 שיבוט 1C6 / CXCR3 | BD אופק | 565223 | |
| BV711 עכבר אנטי אנושי CD196 (CCR6) שיבוט 11A9 | BD Horizon | 563923 | |
| BV421 חולדה אנטי אנושית CXCR5 (CD185) שיבוט RF8B2 | BD אופק | 562747 | |
| BB515 עכבר אנטי אנושי CD4 שיבוט RPA-T4 | BD Horizon | 564419 | |
| PE עכבר אנטי אנושי CD279 שיבוט MIH4 | BD Pharmingen | 557946 | |
| APC-H7 עכבר אנטי אנושי CD45RA שיבוט HI100 | BD Pharmingen | 560674 | |
| LIVE / DEAD ניתן לתיקון ערכת כתמי תאים מתים אדומים רחוקים, עבור עירור 633 או 635 ננומטר | ThermoFisher Scientific | L34973 | |
| מאגר כתמים מבריק | BD אופק | 563794 | |
| אנטי עכבר Ig, κ/חלקיקי פיצוי בקרה שלילית סט BD | CompBead | 552843 | |
| FACS Aria II זרימה ציטומטר | BD Biosciences | 644832 | |
| FACSDiva 6.1.3 | BD Biosciences | 643629 | תוכנה לרכישת ציטומטר זרימה |
| FlowJo 10.2 | Treestar Inc. | תוכנת ניתוח נתונים ציטומטריית זרימה | |
| נוגדן נגד CXCR3 BD | Horizon | ||
| נוגדן נגד CCR6 | BD Horizon | ||
| נוגדן נגד CXCR5 | BD Horizon | ||
| נוגדן נגד CD4 | BD Horizon | ||
| נוגדן נגד PD-1 | BD Pharmingen | ||
| נוגדן נגד CD45RA | BD Pharmingen | ||
| סמן כדאיות | ThermoFisher Scientific | L34973 |
מקורות
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009). <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
