מאמר שיטה

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

DOI:

10.3791/58626

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Metabolism, Endocrinology and Lipid Research, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in Saint Louis, 3Department of Ophthalmology and Visual Science, Washington University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חזון חדות גבוהה היא תהליך בכבדות הצורכים אנרגיה, הרשתית פיתחה מספר עיבודים ייחודיים לדרישות בדיוק כזה תוך שמירה על שקיפות של הציר חזותי. לפליטת כדי איזון עדין זה לגרום מחלות מסנוור, כגון רטינופתיה סוכרתית. לכן, ההבנה של האנרגיה חילוף החומרים משתנה ברשתית במהלך המחלה הכרחי להתפתחות של טיפולים רציונלי עבור גורמים שונים של אובדן vison. הופעתו האחרונה של מנתחי השטף חוץ-תאית זמין מסחרית הפך המחקר של חילוף החומרים האנרגיה ברשתית נגיש יותר. פרוטוקול זה מתאר את השימוש כזה מנתח כדי למדוד את התרומות לאספקת אנרגיה ברשתית באמצעות זרועותיה עיקרון שני - זרחון חמצוני, גליקוליזה - מאת לכימות שינויים בשערי צריכת חמצן (OCR), חוץ-תאית המחירים acidification (ECAR) כאל שליחים עבור המסלולים הללו. טכניקה זו מבוצעת בקלות ברקמת הרשתית explanted, הקלה על הערכה של התגובות מרובות סוכנים תרופתי בניסוי יחיד. חתימות מטבולית הרשתיות מחיות חסר רוד קולט אור איתות מושווים לפקדים פראי-סוג בשיטה זו. מגבלה משמעותית בטכניקה זו הוא חוסר היכולת להבחין בין ניצול האנרגיה הותאם-אור, dark-adapted, שיקול חשוב הפיזיולוגיות ברקמת הרשתית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרשתית היא בין הרקמות ביותר דורש אנרגיה מערכת העצבים המרכזית1. כמו רוב רקמות, שהיא מייצרת אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך גליקוליזה ב זרחון חמצוני ציטוזול או דרך בתוך המיטוכונדריה. היתרון האנרגטי של זרחון חמצוני על גליקוליזה לייצר ATP ממולקולה אחת של גלוקוז נקי: 36 מולקולות של ATP שנוצר מתוך לשעבר לעומת 2 מולקולות של ATP שנוצר האחרון. בהתאם לכך, הנוירונים ברשתית תלויים בעיקר נשימה מיטוכונדריאלי לאספקת אנרגיה, זה משתקף על ידי שלהם צפיפות גבוהה של המיטוכונדריה2. ובכל זאת, הרשתית גם מסתמכת במידה רבה על מכונות glycolytic גם כאשר חמצן בשפע. תהליך זה של אירובי גליקוליזה תוארה לראשונה על ידי אוטו ורבורג3, מי פעם ציין, כי הרשתית הרקמה רק שלאחר mitotic מסוגל צורה זו של חילוף החומרים4בתאים סרטניים. מאז תצפיות ראשוניות אלה, ברקמות רבות שלאחר mitotic תוארו לעסוק בדרגות שונות של גליקוליזה בנוסף זרחון חמצוני כדי לענות על דרישותיהם ATP.

Phototransduction, פיגמנט חזותי מיחזור, ביוסינטזה של מקטעי החיצוני קולט אור, בפעילות הסינפטית הם כל התהליכים תובעניים אנרגיה photoreceptors, מחלקת המשנה השולט עצביים ברשתית. אך הצורך להעביר באופן פעיל יונים נגד שלהם חשמל ומעברי הריכוז הוא עד כה התהליך לארוך ביותר אנרגטית נוירונים1. Photoreceptors הם נוירונים מוזר במובן שהם אינם depolarized בהיעדר גירוי (קרי, בחושך), ואילו גירוי אור מפעילה ערוץ הסגר, hyperpolarization הבאים. לכן, בחושך, הרשתית צורכת כמויות גדולות של ATP כדי לשמור על דפולריזציה או "זרם אפל" שלה, כפי שהיא מכונה בדרך כלל. מההיבט אדפטיבית, הוא אתגר גדול באספקת אלה כמויות אדירות של ATP עבור אורגניזמים לשמור על בהירות חזותית באמצעות לציר האופטי. הארכיטקטורה ברשתית הפוך אצל יצורים מודרני הוא הפתרון דומיננטי, כמו זה שומרת את הרשת נימי צפופה הספקת photoreceptors לברוח מדרכו של אור. . אבל זה מעורר פליאה bioengineering טבעי מקומות הרשתית צוק במונחים של שמורת מטבולית. עלבונות קטן אפילו לרשתית פוטנציאלי יכול לשבש את האיזון העדין של אספקת אנרגיה לדרוש, תפקוד חזותי או עיוורון פרנק עשוי לנבוע במהירות.

בהתחשב הדרישות האנרגטי הייחודי של הרשתית עצבית, בשילוב עם הגבלה חזק של אספקת הדם, מדידה מדויקת של צריכת ATP הרשתית ואת שלו משתנה במהלך המחלה עשויות להיות השלכות עמוקה תוך הבנה וטיפול מעלף מצבים כגון רטיניטיס פיגמנטוזה רטינופתיה סוכרתית. באופן מסורתי, מדידות אלה דורשים ציוד יקר, אישית מעוצבת עם רוב המחקרים מתוך קומץ של מעבדות שכולו מוקדש מדידות של פעילות חילוף החומרים2,5,6, 7,8. טכניקות כוללים מבחני בודדים של המטבוליטים ספציפיים, מחקרים מעקב באמצעות התווית על-ידי רדיו סימנים מקדימים, צריכת חמצן הקלטה באמצעות אלקטרודות קלארק, ו metabolomic פרופיל9.

עם ההתקדמות בטכנולוגיית תפוקה גבוהה וזמינות מוגברת של התקנים מסחריים, טכניקות כדי הרשומה מטבוליזם ברשתית הם יותר ויותר נגיש וזול. השיטה המתוארת כאן מודד בשני זרחון חמצוני, גליקוליזה רשתית העין באמצעות explanted רקמות ו זמין מסחרית השטף חוץ-תאית מנתח9,10,11,12. זה מנתח מתעדת בנפרד קצב צריכת החמצן (OCR), שער חוץ-תאית acidification (ECAR), הגשה אינדיקטורים עקיף של זרחון חמצוני, גליקוליזה, בהתאמה13. מדידות אלה נעשית על ידי בדיקה submersed במרחק microchamber שנוצרו על הרקמה של ריבית. זה עיבוד של שיטות שפורסמו בעבר משתמש צלחת לכידת תוכנן במקור עבור לנגרהנס בלבלב כדי להקליט את פעילות חילוף החומרים בסעיפים קטנים, עגולים של רשתית העכבר. חשיפות מרובות תרופתי יכול להיות מועברת הרקמה במהלך הקלטה יחיד כי המערכת מכילה 4 יציאות הזרקת עבור כל דגימה. טוב. באמצעות מערכת זו עם פרוטוקולים נפרד אופטימיזציה עבור הקלטות ECAR, OCR, התגובות של פראי-סוג באדמומיות ניתן להשוות הרשתיות חסר transducin (Gnat1- / -), סיבת עיוורון לילה נייח מולדות ב בני14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים עקב האגודה לחקר חזון והצהרת רפואת עיניים עבור שימוש של בעלי החיים ואושרו על-ידי אוניברסיטת וושינגטון.

1. הכנה בעלי חיים

  1. לשמור חיות בדיור סטנדרטי עם 12 שעות כהה מחזור אור 12 שעות. בגין ניסויים ב סטנדרטית פעמים כדי למנוע תופעות היממה, בדרך כלל בבוקר זמן קצר לאחר אורות דולקים.

2. פתרון הכנה

  1. להכין בסיס מדיה על ידי המסת 8.4 מ ג של אבקת מדיה מזוקק פעמיים H2O (ddH2O) להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl או NaOH, לאמצעי אחסון הסופי של 1 ל' מסנן לחטא זה פתרון עם מסנן תרביות רקמה 0.22 מיקרומטר.
    1. מוסיפים גלוקוז 1 מ' ו- 100 מ מ פירובט נתרן בכלי התקשורת כדי להשיג הסופי ריכוזי גלוקוז 5 מ מ 1 מ"מ פירובט.
    2. המקום aliquot 50 מ של אמצעי התקשורת הבסיס באמבט מים 37 º C.
  2. להתכונן פירוק פתרון, רקמות כימות בסוף הניתוח השטף, על-ידי הוספת טריס בסיס 10 מ מ, פוליאתילן גליקול טרט-octylphenyl אתר 0.2% (v/v), EDTA עד 1 מ"מ, כל ddH2O. לערבב עד שכל הרכיבים התפרקה לחלוטין, להתאים ה-pH ל 8.0.
  3. עבור פרוטוקול מתח מיטוכונדריאלי, להכין מלאי של מיקרומטר 11 של oligomycin, מעכב ATP סינתאז, מומס בסיס מדיה למטרה הסופית ריכוז 1 מיקרומטר בבאר. להכין מלאי של מיקרומטר 11 של ציאניד קרבוניל - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), סוכן uncoupling, מומס בסיס מדיה למטרה הסופית ריכוז 1 מיקרומטר בבאר. להכין קוקטייל של מעכבי שרשרת האלקטרונים תחבורה, rotenone antimycin A (ראה) על-ידי הוספת rotenone 11 מיקרומטר, antimycin א 22 מיקרומטר, מומס מדיה בסיס היעד הסופי ריכוז rotenone מיקרומטר 1 ו- 2 מיקרומטר antimycin א ב טוב.
  4. עבור פרוטוקול גליקוליזה, להכין מלאי 220 מ מ של גלוקוז מומס מדיה הבסיס, כדי להתמקד ריכוז סופי של 20 מ מ בתוך הבאר. גם להכין מלאי 1.1 מ' של 2-deoxyglucose (2-DG), מעכב תחרותי של גלוקוז, אנטגוניסט glycolytic, על ידי המסת זה בתקשורת הבסיס. זה יעד ריכוז סופי של 100 מ מ 2-DG בבאר.

3. מכשיר כיול

  1. כדי לכייל את ומכשור וזמינותו השטף חוץ-תאית, להוסיף 1 מ"ל של כיול פתרון כל טוב של המחסנית חיישן (סה כ 24 בארות), דגירה ב 37 ° C ב- CO2-חינם חממה לילה (או לפחות 8 שעות).
  2. לטעון תוספים עבור פרוטוקול מיטוכונדריאלי מתח או בפרוטוקול גליקוליזה ליציאת כל מזרק, A עד D, שעל מחסנית חיישן, התאמת נפח שינויים בתוך הבאר.
    הערה: לדוגמה, יכלול assay טיפוסי 45 µL של תוסף ליציאת ה-מזרק הראשון, µL 49.5 לתוך השני, µL 54.5 לתוך µL השלישי, 60 לתוך האחרון, בהנחה אמצעי טוב הראשונית של 450 µL.
  3. במהלך הניסויים מספר הראשון, לטעון מדיה בסיס ליציאה A לאמוד כמה רקמות תנועה/החפץ מתרחשת לאחר זריקה יציאה.
  4. לאפשר את הצלחת חיישן טעון על דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה-CO2 לפחות 60 דקות.

4. בידוד של רקמת רשתית העכבר טרי

הערה: השלב זה ממאמרו של הטכניקה של ד ר בארי ווינקלר15.

  1. לאחר ניהול הרדמה עמוקה באמצעות קוקטייל קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים סטנדרטי, המתת חסד עכברים מאת נקע בצוואר הרחם.
  2. השתמש זוג מלקחיים מעוקל בגודל בינוני תופסים את העולם האחורי על עצב הראייה, בעדינות קדימה אל תפעילו לחץ על proptose העין (איור 1 א').
    1. עם סכין גילוח נקי, ליצור חתך לימבוס כדי לימבוס על פני הקרנית באמצעות כרטיס יחיד, מכוונת של הלהב.
    2. שימוש בסדר, מלקחיים מקפירסון בסגנון זוויתי, צבוט הגלובוס האחורי כדי לבטא את העדשה וממברנות הקדמי hyaloid מתוך החתך הקרנית. להתעלם רקמות אלו.
    3. חזור על התמרון צובט עם מלקחיים לבטא עצביים ברשתית.
    4. עם המלקחיים כמו כפית כדי להרים את הרשתית, במקום להבין את הרקמה, העברת הרשתית מן החתך הקרנית ומניחים ישירות לתוך המדיה חמה תבשיל 3-ס"מ או צלחת אשכול 6-ובכן תרביות רקמה.
  3. השתמש שני זוגות של מלקחיים מקפירסון בסגנון בסדר, בזווית לנתח בעדינות הזגוגיות שנותרו מן הרשתית. זה נעשית על ידי האוחז את הזגוגיות בפריפריה של הגביע ברשתית ומושך לכיוון המרכז, עם disinsertion הסופית של הגוף בזגוגית מהמרכז בכללותה. עם המלקחיים, הסר כל אפיתל הפיגמנט ברשתית שיורית משטח קולט אור ברשתית.
    1. חותכים טיפ pipet P1000 עם סכין גילוח כדי ליצור פתח ~ 4 מ מ כדי למנוע טראומה מיותרת לרקמת הרשתית עדין במהלך העברת תמרונים.
    2. להעביר את רקמת רשתית מבודד טריים מדיה באמצעות טיפ pipet לחתוך P1000.
    3. חותכים 1 מ"מ האגרופים של הרשתית סביב עצב הראייה עם ביופסיה 1 מ"מ אגרוף מצויד עם פומפה מכך הרקמה, במקרה זה הופך ונתקע לתוך נשא (איור 1B). הגדר את האגרופים ברשתית הצידה בתקשורת נקייה כל הזמן על בלוק 37 ° C או חימום משטח.

5. assay פרוטוקול

  1. העברה אגרופים בודדים microplate לכידת 24-ובכן איון באמצעות טיפ P1000 לחתוך, כ רפה בעברית µL 450 של המדיה יחד עם הרקמה.
  2. השתמש בסדר, ישר מלקחיים בעדינות לתפעל אגרופים למרכז microplate. שמור אגרופים חוקיים באותו כיוון (למשל, תא גנגליון בצד כלפי מעלה).
    1. הנח את הצלחת הלכידה על כרית חימום או חימום בלוק מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס כפי שלבים אלה חוזרים על עצמם על הדגימות הנותרים.
      הערה: עבור ניסוי, להפריש 3-4 בארות ריק עם 450 µL של בסיס מדיה כדי לשמש כפקדי שלילי. הנותרים 20-21 וולס, לבדוק כל שכפול וחיסונים דולר. לכן, כל צלחת 24-ובכן יאפשר עבור הקלטת של 6-7 בעלי חיים שונים או טיפול תנאים.
  3. הימנעות בועות אוויר, מיקום בעדינות איון ללכוד רשת מוסיף לתוך כל טוב באמצעות מלקחיים, לאבטח את הכיסויים עם פומפה מתכת, או עם טיפ pipet P1000 לחתוך (איור 1 C).
    הערה: להימנע התנועה רקמות מופרז במהלך שלב זה כדי לשמור על מיקום הניקוב רשתית בתוך המרכז של microchamber הדגימה. בועות אוויר לעוות קשות OCR קריאות. למרות microchamber יש עומק מספיק כדי להכיל את עכבר אופייני רשתית (איור 1C), לעתים עיבוד שבבי-פגמים הכיסויים רשת עלול לגרום רקמות להיות דחוס מדי במהלך מסך הכניסה. אם זה קורה, פשוט רשום של הרקמה כתוש, אל תכלול הדגימה הניתוח הסופי.
  4. דגירה לצלחת רקמות 37 ° C CO2-חממה חינם לפחות 60 דקות.
  5. תוכנית במנתח השטף חוץ-תאית באמצעות ערבוב, חכה. מידה, וחזור על פקודות. לדוגמה, ניסוי טיפוסי עם רקמת רשתית עשויים לכלול את הפריטים הבאים: מערבבים 2 דקות, להמתין 2 דקות, וכך למדוד 5 דקות. חזור על הניסוי עם שלושת השלבים בין 5 - 8 פעמים (מחזורים) לצורך הקלטה בסיסית, ואחרי הזרקה של כל המתחם נבדק במהלך הריצה.
  6. לחץ על לחצן התחל תוכנית במנתח השטף חוץ-תאית, בצע את ההוראות שעל המסך כדי הכנס את מיכל הדיו חיישן לכיול.
  7. בסוף הכיול, בצע את ההוראות שעל המסך כדי להחליף את הצלחת calibrant עם לוחית המכיל את הדגימות ברשתית.
  8. מאפשר לתוכנית לפעול, כפי מתוכנת. בסיום ההפעלה, בצע את ההוראות שעל המסך כדי להוציא את הצלחת רקמות. הצג את תוצאות המרוץ ולאחסן את קובץ הנתונים.
  9. עם מחט בקוטר 20 כפופות, מלקחיים, הסר מוסיף רשת כל הבארות, ומותיר את האגרוף ברשתית.
  10. בזהירות תשאף המדיה מן הרקמה ולשטוף את הרקמה פעמיים עם 0.5 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS). האחות של PBS לאחר הרחצה.
  11. להוסיף 100 µL מאגר פירוק כל טוב, pipet למעלה ולמטה כדי homogenize רקמות.
  12. Quantitate רמות הקלט בהתבסס על סך כפול גדילי הדנ א (dsDNA) או תכולת החלבון הכולל.
    הערה: להלן מבוססת על וזמינותו dsDNA זמינים מסחרית.
  13. לדלל דגימות lysed 1:1 על-ידי הוספת µL 100 טריס-EDTA (TE) מאגר ולהעביר µL 100 המדגם מדולל צלחת טוב 96.
    1. להוסיף 100 µL מאגר זיהוי כל טוב. לאחר ערבוב 2-5 דקות, quantitate קרינה פלואורסצנטית לאחר עירור-480 ננומטר, פליטה-520 nm, השוואת לעקומה סטנדרטי.
    2. לנרמל את העקיבה raw השטף חוץ-תאי DNA תוכן בתוך הבאר.
      הערה: בתוצאות המובאות כאן, דוגמאות הן מנורמל ל 50 ng dsDNA - כמות אופיינית באגרוף ברשתית 1 מ מ. לכן, הערכים המוחלטים המובאות כאן ניתן להשוות מחקרים בהצגת נתונים "לפי ברשתית פאנץ'". לנרמל לשרטוטים כדי תקן פנימי, כגון הבסיס להפעיל בכל ריכוז הגלוקוז של 5 מ מ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוך שימוש בטכניקות המתואר (מסוכם באיור1), explants ברשתית מ 8 בת שבוע פראי סוג (WT) עכברים היו לעומת גיל - ועל רקע-מתאימים transducin null עכברים (Gnat1- / -). כי Gnat1- / - בעלי חיים חסרי המכונות כדי לסגור מחזורית-נוקלאוטיד מגודרת תעלות יונים בתגובה לגירויים קלים, photoreceptors רוד שלהם להישאר depolarized גם ב קל14. עוקבות צריך לשמור על אשלגן בזרימת תיצור ביקוש גדול ATP, וכתוצאה מכך זן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OCR, ECAR נמדדים ברצון ברקמת הרשתית explanted באמצעות bioanalyzer תוך שימוש בטכניקות המתואר. שיטה זו יוצאת מאלו של קבוצות אחרות במספר שלבים קריטיים. רקמות ברשתית מבודדים דרך חתך גדול הקרנית ללא enucleating העולם, כפי שהם במקור מתוארת על ידי וינקלר15. שיטה זו של בידוד ברשתית מאפשר העברה מהירה מעינו החי המשקולת לכידת רקמות (לרוב בתוך 5 דקות). רקמות נשמרים ב 37 מעלות צלזיוס לאורך כל התהליך, אשר משמר נשימה תאית טוב יותר כאשר הם ממוקמים על קרח. מדיה עם תוספות מינימליות משמשים עבור מדידות ראשוניות, תוך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ד ר אלכסנדר Kolesnikov, ד ר ולדימיר Kefalov על מתן Gnat1- / -עכברים, משוב מועילים ועצות, ולכל לקרוא את כתב היד.

עבודה זו נתמכה על ידי NIH EY025269 (RR), המרכז לחקר הסוכרת באוניברסיטת וושינגטון - NIH DK020579 (JRM ו- RR), פרס פיתוח הקריירה מן המחקר כדי למנוע עיוורון (RR), קרן Horncrest (RR), פרס פיתוח הקריירה של האגודה לסוכרת נעורים ( JRM), DK101392 NIH (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS), DK114233 (JRM).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Seahorse XF24 מנתח שטף חוץ-תאיAgilent, סנטה קלרה, קליפורניה
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (כולל: לכידת איים Microplate, מחסנית חיישן ופתרון קליברנט)Agilent, סנטה קלרה, CA101174-100כולל מיקרו-צלחת לכידת איים, מחסנית חיישן ותמיסת קליברנט
RPMI 1640 מדיה (מדיום אבקתי)Millipore-SigmaR1383RPMI 1640 מדיה עם L-גלוטמין וללא גלוקוז או נתרן ביקרבונט
D-גלוקוזMillipore-SigmaG82701M D-גלוקוז מסונן, להכנת
מדיה נתרן פירובטקורנינג25000CI100 מ"מ נתרן פירובט
אנטימיצין-AMillipore-SigmaA8674רכיב פרוטוקול מתח מיטוכונדריאלי
FCCPMillipore-SigmaC2920רכיב פרוטוקול מתח מיטוכונדריאלי
רוטנוןMillipore-SigmaR8875רכיב פרוטוקול מתח מיטוכונדריאלי
2-דאוקסיגלוקוזMillipore-SigmaD6134רכיב פרוטוקול גליקוליזה
1 מ"מ ביופסיית עור אגרופים עם בוכנהIntegra-Miltex33-31AA-P/25שתילת כלי רקמת רשתית
Dumont Mini-Forceps StraightFine Science Tools11200-10השתלת כלי רקמת רשתית
Dumont Medical #5/45 מלקחיים- בזווית 45 מעלותכלי מדע עדין11253-25השתלת כלי רקמת רשתית
Dumont #7 מלקחיים -כלי מדע עדינים11271-30השתלת כלי רקמת רשתית
Quant-iT Picogreen dsDNA ערכת בדיקתפישר סיינטיפיקP7589טעינת מבחן
נורמליזציהבסיס טריזמה (בסיס טריס)Millipore-SigmaT6066רכיב של מאגר ליזה
טריטון X-100 (פוליאתילן גליקול טרט-אוקטילפניל אתר)Millipore-SigmaX100רכיב של מאגר ליזה
0.5M EDTA pH 8.0אמביוןAM9262רכיב של מאגר ליזה
עכברי C57BL/6J מעבדות ג'קסון  זן 000664Animals
Gnat1-/- ו-Gnat1+/+ ולדימיר קפאלוב, דוקטורט; בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטוןחיים
מעוקלים בעלי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye and brain. 2, 99-116 (2010).
  2. Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).
  3. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
  4. Wubben, T. J., et al. Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration. Scientific reports. 7 (1), 17863(2017).
  5. Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers. Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).
  6. Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging. Scientific reports. 7 (1), 10622(2017).
  7. Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
  8. Winkler, B. S. Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function. The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).
  9. Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).
  10. Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
  11. Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
  12. Pearsall, E. A., et al. PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival. BMC biology. 15 (1), 113(2017).
  13. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of visualized experiments. (46), (2010).
  14. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  15. Winkler, B. S. The electroretinogram of the isolated rat retina. Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).
  16. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  17. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).
  18. Du, J., et al. Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina. The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים