מאמר שיטה

זיהוי מבוסס על טסית דם של תחמוצת החנקן בדם על ידי מדידת זרחון VASP

DOI:

10.3791/58647

⸱

7 בינואר 2019

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Dentistry, Mahidol University, 2Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לטפל להשתמש הפוטנציאל של טסיות דם כמו חיישן רגיש מאוד תחמוצת החנקן בדם. זה מתאר טסיות הראשונית הכנה ושימוש חנקיתי ו רווית תאי דם אדומים גנרטורים תחמוצת החנקן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטסיות הן רכיבי הדם אחראי על קרישת הדם תקין. תפקידם הוא מאוד מווסתות על ידי מסלולים שונים. אחד הסוכנים vasoactive הקטלניים ביותר, תחמוצת החנקן (NO), יכול גם לפעול מעכב חזק של הצטברות של טסיות דם. ישיר אין זיהוי בדם הוא מאוד מאתגר עקב שלה תגובתיות גבוהה עם המוגלובין ללא תא המגביל מחצית אין חיים על הטווח אלפיות השנייה. כיום, אין שינויים לאחר התערבויות מוערכות רק בהתבסס על שינויים מדודה של חנקיתי חנקתי (חברים של מסלול מטבולי חנקת-חנקיתי-לא). עם זאת מדויק, מדידות אלה הם די קשה לפרש מול בפועל ללא שינויים, עקב חנקיתי בסיסית גבוהה באופן טבעי טונות רמות שנמצאים במספר סדרי גודל גבוה יותר מאשר שינויים צפויים לא עצמו. לכן, בפיתוח שיטות ישירה ופשוטה שתאפשר אחד לזהות לא ישירות הוא מזמן. פרוטוקול זה מטפל שימוש פוטנציאלי של טסיות כמו רגישות גבוהה לא חיישן בדם. זה מתאר פלזמה עשיר טסיות הראשונית (PRP) ואת ההכנות טסיות שטף את השימוש חנקיתי רווית תאי דם אדומים גנרטורים אין. זירחון של VASP-סרין 239 (P-VASPSer239) משמש כדי לזהות הנוכחות של מס העובדה כי חלבון VASP מתבטאת מאוד טסיות הדם, כי זה הוא במהירות phosphorylated כאשר לא קיים מוביל הזדמנות ייחודית לשימוש מסלול זה ישירות לאתר בו שום נוכחות בדם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטסיות הן שברי תאים קטנים בצורת דיסק נגזר megakaryocytes כי הם חיוניים קרישת הדם. המפל קרישת דם הוא שיזם מולקולות ביו שונים (כגון קולגן או ADP), שוחרר לאחר פציעתו של קיר כלי הדם. תהליך קרישת הדם יכול להיות שונה, בין effectors השונים על ידי תחמוצת החנקן (NO). . לא, באופן טבעי המיוצר על ידי תאי יונקים, הוא אחד המגוונים ביותר אותות פיזיולוגיים. היא פועלת vasodilator חזק, מוליך עצבי, אפנן המערכת החיסונית, שם כמה הפונקציות הרבות שלה. בכלי הדם, לא גם מסייע לווסת את היקף קרישת הדם על ידי עיכוב הצטברות של טסיות דם. אחד המקורות סביר ביותר לא במחזור הדם הוא חנקיתי, יון אנאורגניים זה הוכח להוות סימן מקדים של מס מגיבה עם כדוריות דם אדומות (RBCs) חנקיתי מופחתת ללא, deoxyHb תחמוצת methemoglobin (metHb)1. לא שוחררו RBCs הוא vasoactive וגורם vasorelaxation2. מסלול זה הפחתת חנקיתי הוא תוכנית חלופית אין מסלול הדור, מתנהג יחד עם ו משלימים קלאסית אין שביל דור על ידי סינתאז תחמוצת החנקן אנדותל-תנאים ובשפתיים.

טסיות הדם עצמם אינם מסוגלים להפחית חנקיתי לתוך לא אבל רגישים מאוד את נוכחותה. בטסיות תקין, לא ב- nanomolar טווח מגדילה cGMP (EC50 = 10 ננומטר), זירחון של VASP (EC50 = 0.5 ננומטר)3. לכן, טסיות עשויים לשמש חיישן מעולה של הפחתת חנקיתי RBCs, אין שחרור לדם. ישנן מספר שיטות שבהן באפשרותך למדוד ישירות את היקף ההפעלה טסיות - כגון aggregometry ו- thromboelastography (TEG)4,5. עם זאת, שיטות אלה דורשים יקר במכשור מיוחד, כמויות די גדולות של חומר. זה גם אפשרי לעקוב אחר אירועים במורד הזרם, לאחר לא הוא שוחרר מן RBCs, באמצעות השינויים בביטוי חלבונים משטח טסיות – כגון בחירת שמלות P6. לא ידוע גם להגדיל את כמות cGMP ב טסיות הדם7. בעבר, היינו cGMP לפקח אין שחרור לתוך הדם לאחר הפחתה חנקיתי מאת RBC רווית8. זה הוכיח להיות שיטה מאוד רגיש; עם זאת, cGMP הוא מולקולה קצרת ימים, זיהוי שלו כרוכה עבודה נרחב. אפשרות נוספת, שמתואר פרוטוקול שהוצגו, משתמשת זירחון של פוספו מגורה מרחיב כלי דם (VASP)-חלבון כדי לזהות הנוכחות של NO בדם. VASP הוא מצע של הפעלת קינאז גרם חלבון, אשר הוא phosphorylated על האינטראקציה עם לא דרך הסטארגייט/cGMP מסלול9. זרחון VASP לזיהוי מתרחשת ללא נמוך מאוד ריכוזי, שעלולה לגרום טסיות גלאי רגיש מאוד אין נוכחות בדם. VASP מתבטאת מאוד טסיות, אך לא בתאים אחרים בדם, מה שמאפשר לעקוב באופן סלקטיבי את האירועים הקשורים טסיות10.

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת בפירוט עבור זיהוי אין שחרור בדם כל שימוש ביחסיו עם טסיות דם על-ידי ניטור VASP זרחון11,12. השיטה המתוארת מאפשרת גילוי מוקדם של נמוך אין ריכוזים - תיאורטית בטווח nanomolar מה שהופך את הפרוטוקול הנוכחי רגיש יותר נחישות cGMP, עקב השימוש של טכניקות תספיג סטנדרטי השגה במעבדה רוב הגדרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: דגימות דם, התקבלו בנק הדם NIH (IRB אושר פרוטוקול: 99-CC-0168).

1. דם לטעום הכנה

הערה: כדי למנוע הפעלת טסיות דם, דם לאט ומערבבים בעדינות עם ציטראט על-ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים.

  1. טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) הכנה
    1. לצייר 30 – 50 מ"ל של דם באמצעות 20 גרם או מחט בקוטר גדול יותר ולהוסיף לתוך צינור המכילים סודיום ציטרט (3.8%) יחס 1:9 או דקסטרוז ציטראט חומצה (ACD) (ציטראט trisodium 85 מ מ, מ מ 66.6 חומצת לימון, גלוקוז 111 מ מ, pH 4.5) על יחס 1:6.
    2. Aliquot 5 מ של דם טרי שנאספו לתוך צינורות חרוט 15-mL ריק. צנטריפוגה דם מלא ב x 120 g 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. בזהירות לאסוף את תגובת שיקוע המכיל טסיות הדם (טסיות דם עשיר פלזמה, PRP) מן החלק העליון על ידי פיפטה העברת פלסטיק.
      הערה: PRP מהשלב 1.1.3 הוא מוכן לשימוש בניסויים או עיבוד נוסף כדי להכין שטף את טסיות הדם. בגדר רך שהושג לאחר צנטריפוגה (שלב 1.1.2) מכיל כדוריות דם אדומות, כדוריות לבנות, ניתן לטהר כדי לקבל שטף תאי דם אדומים (RBC) — ראה שלב 1.3. הניסוי צריך להסתיים בתוך שעתיים לאחר עד זוב דם. בעת איסוף PRP (supernatant), למנוע את האוסף של לויקוציטים באפי המכילות את המעיל, שנצבר על הממשק PRP/RBC.
  2. טסית דם שטף הכנה (אופציונלי)
    1. צנטריפוגה אסף PRP ב x 400 g 10 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע ולשמור את כדורי טסיות.
    2. יש לשטוף בעדינות את כדורי על-ידי הוספת 5 מ של מאגר הרמטכ ל (120 מ"מ NaCl, גלוקוז ציטראט ו- 30 מ מ trisodium 12.9 מ"מ, pH 6.5), צנטריפוגה ב x 400 g 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. Resuspend כדורי טסיות 3 מ ל Tyrode שונה מאגר (134 מ מ NaCl, 0.34 ממ NaH2PO4, 2.9 מ"מ אשלגן כלורי, 12 מ מ NaHCO3, 20 מ מ. HEPES, מ מ 1 MgCl2, מ מ 2 CaCl2, 10 מ מ גלוקוז pH 7.4).
    4. לדלל טסיות הדם (בטחונות — לדוגמה, 10 µL של טסיות ב 990 µL של ריס-Ecker פתרון) עם פתרון Ecker ריס, מונה על-ידי hemocytometer.
    5. להתאים את הצפיפות של טסיות כדי 3 x 108 תאים למ"ל על-ידי הוספת Tyrode מאגר.
    6. דגירה ההשעיה טסיות ב 37 ° C עבור 1 h לפני תחילת הניסוי.
      הערה: טסיות דם שטף יציבים עבור 5-8 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
  3. הכנה של תאי דם אדומים (RBC) שטף
    1. אחרי האוסף, centrifuge בגדר רך שהושג בשלב 1.1.3 ב x 2,500 g 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר RBC 5 מ ל- PBS, על ידי צנטריפוגה ב x 2,500 g 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה עבור 3 פעמים.
    3. למחוק את PBS ולהשתמש RBCs שטף לניסויים נוספים.

2. deoxygenation

  1. להוסיף 1 מ"ל של התערובת של PRP (מוכן בשלב 1.1.4. או 1.2.4.) ואת RBCs (מוכן ב- 1.3 צעד.)-המטוקריט הרצוי לתוך בקבוק פוליפרופילן סגור עם פקק גומי. לדוגמה, ב- 20% המטוקריט, להוסיף 200 µL של RBCs µL 800 של PRP.
    הערה: הציע hematocrits הם בין 0% עד 40%. אל תשתמש בקבוק זכוכית או הבקבוק כפי טסיות לדבוק משטח זכוכית.
  2. את המחט מחוברת מיכל גז הליום לתוך הבקבוק סגור ולעשות ששקע גז על ידי החדרת מחט 26 G (איור 1).
  3. אט-אט מערבולת מהבקבוק בטמפרטורת החדר.
    הערה: אל תאפשר גז הוא בועה דרך הדם הכנה. זרימת הגז איטי עדיפה עבור הליך זה, ומוביל זרימת הגז הוא מהיר בצורה מוגזמת המוליזה מוגברת. זרימת הגז היעילה ביותר צריך להיקבע על ידי משפט, כמו זה מאוד תלוי הגיאומטריה של ההתקנה ניסיוני.
  4. מעת לעת מבצעים תהליך deoxygenation על ידי מדידת הלחץ חמצן חלקית (pO2) באמצעות oximeter שיתוף.
    הערה: בידיים שלנו, 10 דקות של deoxygenation ירידות פו2 ל- 25 מ מ כספית אשר נדרש עבור הפחתת חנקיתי מאת RBCs. המשך deoxygenation לצמצם עוד יותר את פו2 עד 10 מ מ כספית; עם זאת, זה הוביל המוליזה מוגברת ומגדיל ללא תא המוגלובין (איור 2).

3. תאי הדם האדומים חנקיתי הפחתת

  1. להוסיף 1 מ"ל ל- PBS (pH 7.4) לתוך g 0.0345 של ננו2 להכין תמיסת חנקיתי מניות 500 מ מ. לדלל 500 מ מ NaNO2 250 מיקרומטר NaNO2 (25 x) על ידי דילול סדרתי ב- PBS (pH 7.4).
  2. שימוש של microsyringe, להזריק חנקיתי (40 µL) דרך מחצה לתוך דגימת דם לא מחומצן PRP ו RBCs להשגת ריכוז סופי של 10 מיקרומטר ב סה כ 1 מ של דגימה.
    הערה: בניסוי זה, ריכוזי חנקיתי המשמש הסופי הוא 10 מיקרומטר.
  3. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או יותר.
    הערה: התאמת משך הדגירה RBC המדויק עם חנקיתי לצורך הפחתת חנקיתי מקסימלי עבור סוגים שונים של ניסויים.
  4. הסר את בסימפטומים ולא במחלה עצמה ואת פיפטה 1 מ"ל של המדגם לתוך צינור microcentrifuge.
  5. צנטריפוגה ב x 200 g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. פיפטה µL 300 של ההשעיה טסית דם מן החלק העליון של תגובת שיקוע, מערבבים עם ACD (pH 6.5) יחס של 1:9. להתעלם בגדר RBC.
  7. Centrifuge התליה טסיות ב x 500 g למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. להוסיף µL 80 המאגר הקר פירוק (150 מ מ NaCl, 50 מ מ. טריס, 0.5% NP-40, pH 7.4) המכיל מעכבי פרוטאז גללים קוקטייל השלישי (שבערך) טסיות.

4. סופג המערבי של VASP

  1. לטעון µg 15 של החלבון מן כל מדגם 2 ג'לים מרחביות-דף נפרד של 10%.
    הערה: מאגר הפשטת קשים, אשר מכיל b-mercaptoethanol, לא יכול להסיר נוגדנים P-VASPSer239 ו VASP הקרום; לכן, P-VASP Ser239 ו VASP אמורה לפעול בנפרד.
  2. הפעל את ג'לים-120 V עבור 1.30 h והעברת למוח ניטרוצלולוזה.
  3. בלוק כריכת שאינם ספציפיים עם 5% שומן חלב יבש.
  4. דגירה הקרום עם P-VASPSer239 (שבערך), VASP (1:1, 000), GAPDH (1:1, 000) נלון ב 4 º C.
  5. דגירה חזרת peroxidase (HRP) נוגדנים משניים עם קרום למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לחשוף את הקרום עם מכונת imager ולכמת את צפיפות הלהקה באמצעות ImageJ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות דם ורידי יש פו2 ערכים בין 50-80 מ מ כספית. Deoxygenation על ידי הליום יורדת במהירות פו2 ל- 25 מ מ כספית בתוך 10 דקות הגדילו deoxygenation-זמן פו ובירידות מעט יותר2. עם זאת, זמן מוגברת של deoxygenation גם מוביל רמות גבוהות באופן משמעותי של המוגלובין ללא תא (שנקבע על ידי Oximeter שיתוף, מבחינה ויזואלית לראות על איור 2 מוספים יותר ויותר אדומה פלזמה) (איור 2 א-ב). המוליזה מוגבר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז טסיות מופעלים בקלות, עדין טיפול של טסית דם המכילים דוגמאות נדרש. יש להימנע pipetting מהר, ומנענע נמרצת. מעכבי טסיות כגון prostacyclin (PGI2) יכול לשמש כדי למנוע הפעלה טסית דם; עם זאת, זה עלול להשפיע על איזה איתות המסלולים בתוך טסיות הדם. עבור הכנת כדורי טסיות, אנו להוסיף ACD המתלים טסיות ולהשתמש נמוך מהירות צנטריפוגה.

טסיות הדם הטרי ב PRP יש חיים מוגבל להתפרס, עד 2 שעות. כדי להשיג הפארמצבטית גבוהה, כל הניסויים צריך להיעשות רק עם טסיות דם טרי ובתוך שעתיים לאחר איסוף דם. הנתונים ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד ר אלן שכטר מופיע בתור ממציא שיתוף על מספר הפטנטים להנפיק את מכוני הבריאות הלאומיים לשימוש של מלחי חנקיתי לטיפול במחלות לב וכלי דם. הוא מקבל תמלוגים על סמך NIH רישוי פטנטים אלו עבור הפיתוח הקליני אבל אין פיצויים אחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומן על ידי מענק מגזר NIH ד ר אלן ש שכטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תלת-נתרן ציטראטעל ידי בנק
חומצת לימוןעל ידי בנק
גלוקוזסיגמאG7528-250G
NaCl; נתרן כלוריסיגמאS-7653 1 ק"ג
NaH2PO4; נתרן פוספט מונו-בסיסי, מונוהידראטMallinckrodt Chemical7892-04
KCl; אשלגן כלוריMallinckrodt Chemical6858
NaHCO3; נתרן ביקרבונטMallinckrodt Chemical7412-12
HEPES; N-[2-הידרוקסיאתיל]פיפרזין-N'-[-חומצה אתנסולפונית]סיגמאH3375-500 גרם
MgCl2 (1 M); מגנזיום כלורידאיכות ביולוגיה351-033-721
CaCl2; סידן כלוריSigmaC5080-500G
Nalgene בקבוקי HDPE חסכוניים צרי פהNalgene2089-0001
מחיצה אדומה פקק מס' 29פישרברנדFB57877
NaNO2-; נתרן ניטריטSigmaS2252-500G
בסיס TRIZMA; Tris[hydroxymethyl]aminomethaneSigmaT8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycolSigma74385-1L
מעכב פרוטאז סט קוקטייל IIICalbiochem539134
Phospho-VASP (Ser239) נוגדןאיתות תאים3114
נוגדן VASPטכנולוגיית איתות תאים3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAbCell Signaling Technology2118
2-mercaptoethanolSigmaM-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Laboratories111-035-003
Clarity Western ECL SubstrateBIO-RAD1705060-200 מ"ל
קו-אוקסימטר (ABL 90 flex)רדיומטר
אספקת הדם של NIHאספקתהדם של NIH טכנולוגיית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435(2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380(2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747(2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western Blot

מאמרים קשורים