מאמר שיטה

רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

DOI:

10.3791/58709

⸱

10 בינואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary, 4Department of Clinical Neurosciences, Cumming School of Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללי, בקרת איכות בודק הדרושים להכנת בריאים למבוגרים תאים בודדים בתרבית של תפוקה גבוהה, מבוסס-droplet תא בודד RNA-Seq ההכנות. קביעת רצף פרמטרים, יישור קריאה וניתוח bioinformatic תא בודד במורד הזרם הינם גם מסופקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניתוח של ביטוי גנים תא בודד לאורך אלפי תאים בודדים בתוך רקמות או microenvironment הוא כלי רב ערך עבור מזהה תא הלחנה, אפליה של הברית פונקציונלי, מסלולים מולקולריים שבבסיס נצפתה רקמה פונקציות ואופני בבעלי חיים. עם זאת, בידודו של תאים בודדים שלם, בריא רקמות יונקים בוגרים לבדיקה מולקולרית עוקבות במורד הזרם תא בודד יכול להיות מאתגר. פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללית ובדיקה בקרת איכות הדרושים כדי להשיג תכשירים איכותיים למבוגרים ותא ממערכת העצבים או עור זה זמין הבאים לתא בודד לא משוחד RNA רצף וניתוח. הנחיות ניתוח bioinformatic במורד הזרם הינם גם מסופקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם התפתחות תפוקה גבוהה תא בודד הטכנולוגיה1,2 והתפתחויות ושפור ידידותי למשתמש על פני העשור האחרון3, התפתחה שדה חדש של הביטוי מפענוח ברזולוציה גבוהה – רצפי RNA בתא יחיד (scRNA-Seq). המחקר של ביטוי גנים תא בודד פותחה לראשונה כדי לזהות הטרוגניות בתוך אוכלוסיות תאים מוגדרים, כגון תאי גזע או תאים סרטניים, או כדי לזהות אוכלוסיות נדיר של תאים4,5, אשר היו בלתי ניתנת להשגה באמצעות בתפזורת מסורתי RNA רצף טכניקות. כלים Bioinformatic הפעלת הזיהוי של הרומן תת אוכלוסיות (סרה)2, ויזואליזציה מסדר תאים לאורך psuedotime שטח (המשקף)6, ההגדרה של רשתות איתות פעיל בתוך או בין אוכלוסיות ( נופי)7, חיזוי של ההרכבה של תאי-יחיד בחלל תלת-ממד מלאכותי (סרה ועוד)8. עם אלה חדש ומרגש ניתוחים לרשות הקהילה המדעית, scRNA-Seq הוא מהיר להפוך הגישה החדשה סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים.

למרות הפוטנציאל העצום של scRNA-Seq, טכני מיומנויות הנדרשות כדי לייצר dataset נקי וכדי במדויק לפרש תוצאות יכול להיות מאתגר לחדשים. כאן, פרוטוקול בסיסי, אך מקיף, החל בידודו של תאים בודדים רקמות כל ראשי כדי ויזואליזציה והצגת נתונים לפרסום מוצג (איור 1). ראשית, בידודו של תאים בודדים בריא יכול להיחשב מאתגר, כמו ברקמות שונות להשתנות ב מידת הרגישות עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכני עוקבות. פרוטוקול זה מספק הדרכה בשלבים אלה בידוד ומזהה בקרת איכות חשוב מחסומים לכל אורך התהליך. שנית, הבנת את תאימות ודרישות בין הדור הבא רצפי וטכנולוגיה של תא בודד יכול להיות מבלבל. פרוטוקול זה מספק קווים מנחים כדי ליישם פלטפורמה ידידותי למשתמש, מבוסס-droplet barcoding תא בודד ולבצע רצף. לבסוף, תכנות מחשבים היא תנאי מוקדם חשוב לניתוח נתונים (datasets) transcriptomic תא בודד. פרוטוקול זה מספק מקורות תחילת העבודה עם שפת התיכנות R ומספק הדרכה על יישום שתי חבילות R הפופולרי של scRNA-Seq-ספציפיות. יחד, פרוטוקול זה יכול מדריך במורשתם ביצוע ניתוח scRNA-Seq להשגת תוצאות ברורות, interpretable. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לרקמות רוב העכבר, חשוב יכול להיות שונה לשימוש עם אורגניזמים אחרים, כולל רקמה אנושית. התאמות בהתאם רקמת המשתמש יידרש.

קיימים מספר שיקולים שיש לזכור בעת בעקבות פרוטוקול זה; כולל, 1) בעקבות הנחיות בקרת איכות כל שלבים 1 ו- 2 של פרוטוקול זה מומלץ להבטיח השעיה קיימא תא בודד של כל התאים בתוך המדגם עניין תוך הקפדה על ספירת מספר בתא סכום מדויק (מסוכם ב איור 2 ). פעם זו מושגת, אם כל התנאים ממוטבת עוקבים, אפשר לרדת במדרגות בקרת איכות (כדי לחסוך זמן - שמירה על איכות ה-RNA והפחתת התא הפסד). המאשרת לבידוד מוצלח של תאים בודדים הכדאיות גבוהה מן הרקמה עניין מאוד להמליץ לפני כל במורד הזרם מעבד. 2) מאז כמה סוגי תאים רגישים יותר מאחרים להדגיש, טכניקות דיסוציאציה מופרז יכול בטעות הטיה האוכלוסייה, ולכן משתנה מתערב ניתוח במורד הזרם. דיסוציאציה עדין ללא הטיה הסלולר מיותרים ועיכול חיוני להשגת תפוקה גבוהה הסלולר, ייצוג מדויק של רקמת חיבור. כוחות גזירה להתרחש במהלך השלבים trituration, FACS, resuspension. 3) כמו עם כל עבודה RNA, רצוי להציג בתור RNase נוספים קטן לתוך הדגימה ככל האפשר במהלך ההכנה. זה יעזור לשמור על ה-RNA באיכות גבוהה. להשתמש בפתרונות מעכב ribonuclease עם שטיפה כלים נקיים, כל ציוד שאינו נטול RNase אך להימנע המוצרים שטופלו DEPC. 4) לבצע את ההכנות מהר ככל האפשר. זה יעזור לשמור על ה-RNA באיכות גבוהה ולהפחית את מות תאים. בהתאם אורך חיתוך רקמה חיה מספר, שקול החל והניתוחים/הכנות מרובות בו-זמנית. 5) להכין את התאים על הקרח כאשר אפשרי כדי לשמור על איכות גבוהה RNA, להפחית את מות תאים איטי התא איתות ופעילות גנים ברמת השעתוק. אף על פי, עיבוד קר כקרח הינו אידיאלי עבור רוב סוגי תאים, כמה סוגי תאים (למשל, נויטרופילים) לבצע טוב יותר כאשר מעובד בטמפרטורת החדר. 6) להימנע במהלך ההכנה תא סידן, מגנזיום, EDTA ומוצרים שטופלו DEPC.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים המתוארים כאן הם לפי ואושרו על-ידי ועדת אכפת לי חיה של מאוניברסיטת קלגרי.

1. בריא רקמות (יום 1)

  1. המתת חסד עכברים עם מנת יתר של סודיום פנטוברביטל (i.p., 50 מ"ג/ק"ג) או לפי הצורך על פי פרוטוקול אתיקה בעלי חיים. ואז להסיר שיער לא רצוי בגב וברגליים של העכבר, אתנול-לחטא את האזור של ניתוח.
  2. לנתח את רקמות או microenvironment של עניין. עבור פרוטוקול זה, אנו משתמשים רקמות העור, עצב להפגין את generalizability של רביב מבוססת barcoding תא בודד transcriptomics בעקבות דיסוציאציה רקמות למבוגרים.
    1. עבור בעצב, להשתמש בפרוטוקול מפורט ב סטרטון. et al. 9. בקצרה, לחתוך את העור מאזור האחוריות של הגב/הרגליים של העכבר. לעשות חתך לאורכו של הירך עם להב האזמל סטרילי. השתמש בסדר. מלקחיים ומספריים כדי לחשוף, להסיר בעצב.
    2. לעור בגב, להשתמש בפרוטוקול מפורט ב. Biernaskie et al. 10. בקצרה, לנתח הגבי העור בחזרה על ידי ביצוע חתכים כתף אל כתף, לרוחב וטפיחה ולמטה מאחור בעזרת מלקחיים בסדר ומספריים. לחתוך את העור פרוסות דק (עובי 0.5 ס מ) בעזרת סכין האזמל סטרילי.
  3. לשטוף את רקמת פי 2 עם HBSS קר כקרח, להסיר את רקמת חיבור לא רצויים, השומן או פסולת תחת מיקרוסקופ ויבתר.
    1. עבור העור הדרמיס בלבד, לצוף הפרוסות, dispase (5 מ"ג/מ"ל, 5 U/mL) ב- HBSS עבור 30-40 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. בניתוח להפריד האפידרמיס הדרמיס. למחוק את האפידרמיס או נוסף מביצועם באמצעות טריפסין אם עניין.
  4. מינצ מדגם לחלקים 1-2 מ מ בעזרת להבים ומהדקים סטרילי והכניסו לתוך אנזים collagenase קר-IV הקרת טרי 2 מ"ג/מ"ל (2 מ"ג/מ"ל, 125 CDU/mg, בתקשורת F12).
    1. העצב, להשתמש µL ~ 500 לכל העצבים ממוגלה x 2. לשימוש העור, ~ 8 מ"ל לכל 1 x העכבר בחזרה בעור.
      הערה: הרקמות צריך להיות לגמרי שקועים הפתרון collagenase-IV. זה חיוני כי אנזימי עיכול כל מטופל, המאוחסנים הינם מוכן כראוי. אם אנזימי נותרו בטמפרטורת החדר במשך פרקי זמן ארוכים, בידוד תא בודד דורשים trituration יתר מכנית ולהפחית תא הכדאיות. Collagenase-IV יכול גם להיות מורכב בתקשורת תרבות תא איפה תא הכדאיות האופטימלי ביותר. אולם, זה יכול לשנות פעילות אנזים או תעתיק חתימה אז צריך להיות מותאם על ידי המשתמש.
  5. דגירה הדגימה אנזים באמבט 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ייבוש עדין כל 10 דקות. מטרף שהוצב 37 ° C הוא גם חלופה מתאימה.
  6. Triturate עם pipettor P1000 20 - 30 פעמים ב תוספת אנזימים שאחרי 30 דקות.
  7. חזור על trituration כל 30 דקות עד פתרון מופיע מעונן ברובו חלופה מועדפת נתחים של רקמות.
    הערה: ודא שחרור מלא של תאים (איור 2b, ג 2). כדי לאשר שחרור מלא, צלחת תאים עם Nuc כחול (2 טיפות לכל 1 מ"ל) לאחר 20 דקות, לבדוק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כל הגרעינים משויכים תאים בודדים ולא פסולת. זה חיוני כדי לבדוק את מידת תא שחרור תוך ניסוי נתון עבור כל סוג הרקמה או תנאי. שהותירה ברקמה (כלומר, פגיעה כרונית) או רקמות למבוגרים שציווית, שחרורו של תאים ישתנה באופן דרמטי מפציעה חמורה או מתחלקים. זה חשוב במיוחד כי סוגי תאים מסוימים נוטים פחות שחרור מן הרקמה יותר מאחרים, לכן מעדיפים למעט תאים אלה מניתוח במורד הזרם.
    1. כוונו למרכז העצבים, מביצועם רקמות על 0.5-1.5 שעות סה כ. לעור, מביצועם רקמות סה כ 2 שעות (בשעה האחרונה של דגירה, להוסיף DNase (1 מ"ג/מ"ל) דוגמית העור).
  8. לסנן פעמיים עם מסנן 40 מיקרומטר. לשטוף את המסנן עם קרח 1% BSA/HBSS.
  9. צנטריפוגה ב g x 260 במשך 8 דקות. ואז להסיר את תגובת שיקוע.
    1. Resuspend בגדר תא ב HBSS המכיל 1% BSA באמצעות טיפ נשא רחב, ומניחים על קרח. אמצעי האחסון resuspension מבוסס על נפח רקמת (800 מ ג משקל רטוב לעור = 800 µL נפח; 10 מ ג רטוב משקל לעצבים = 100 µL נפח).
    2. באופן אופציונלי, להתחיל עם נפח נמוך resuspension ולאחר מכן התאם לפי הצורך בהתבסס על קצב הזרימה (אירועי לשניה) ב FACS סדרן. צפיפות המיון היעילה ביותר (הגדלת מספר התאים שנאספו בזמן minimalizing זמן) עבור אוספי הוא 3,000 – 7,000 אירועים/שנייה.
  10. אם משתמש הכדאיות לצבוע, להוציא subaliquot עבור פקד וללא רבב. לאחר מכן להוסיף צבע הכדאיות 1:15,000 (מניות: 20,000 nM/µL) מדגם (1.3 ריכוז סופי nM/µL) באמצעות טיפ נשא רחב כדי לצמצם הטיה.
    הערה: זה חיוני כדי לבדוק מידת מוות של תאים בתוך ניסוי נתון עבור כל סוג הרקמה או תנאי. כמה סוגי תאים בתוך מדגם נוטים יותר למות מאשר אחרים, ולכן מעדיפים מורחק מן ניתוח במורד הזרם.
    1. דגירה מדגם עם צבע הכדאיות למשך 5-10 דקות על קרח בחושך. לאחר מכן להוסיף 4 מ של 1% קר כקרח BSA/HBSS מדגם. צנטריפוגה ב g x 260 במשך 8 דקות להסיר את הכדאיות עודף צבע. פינוק subaliquot עם הכדאיות לא לצבוע שליטה מוכתם באופן זהה.

2. בידוד התאים קיימא ובריא (יום 1)

  1. ודא כי המתקן FACS בעקבות התא המתאים פלורסצנטיות מופעל מיון פרמטרים (FACS).
    1. הכן את המכונה FACS מראש כדי להבטיח כי היא מוכנה לאחר סיום לצנטריפוגה הסופי בשלב 1-התקנה, ולוודא כי תא אוסף נשמרת קר באמצעות קוביות קרח.
    2. השתמש בפרמטרים הבאים: קצב הזרימה: 1.0 (מקביל בערך 10 µL/min); מסנן: 1.5 ND; גודל החרירים: 100 מיקרומטר; פיזור קדימה: 80-180 V (שינוי במידת הצורך על מנת להבחין בין גודל של אירועים); לצד פיזור: 150-220 V (שינוי במידת הצורך על מנת להבחין בין צפיפות רשת/צורה של אירועים); לייזר: 100-400 V (שינוי במידת הצורך על מנת להבחין בין אירועים שליליים של חיובי לעומת צבען של הכדאיות & לבדוק את זה מול שליטה לצבוע הכדאיות); גייטס: שינוי בעת הצורך כדי להבטיח שכל התאים נאספים. ראה איור דו-ממדי-2 גרם.
      הערה: FACS הפרמטרים הם תלויים במידה רבה סוגי תאים, סדרן המועסקים, לכן צריך להיות מותאם על ידי המשתמש.
  2. להכין 15 מ"ל צינורות צר למטה עם 8 מ של 1% קר כקרח BSA/HBSS עבור אוספי הדגימה. סטטי בתוך שפופרת ואת מתח יכול להשפיע על יעילות איסוף. היפוך הצינורות לפני אוספים בכדי להבטיח ממשק בין פני השטח של הנוזל, החלק הפנימי של צינור לח.
    הערה: אם עובד עם מספרי הטלפון הנייד נמוך מאוד, להתאים אוסף קטן לכלי לפי הצורך.
  3. לאחר שכל התאים נאספים, צנטריפוגה מדגם ב g x 260 במשך 8 דקות.
    הערה: לפני צנטריפוגה, להוסיף 1% BSA/HBSS שטיפה/לדחוף תאים מפני השטח בצד ולאחר ' היפוך ' / מיקס של הצינור מיד לאחר FACS.
  4. Resuspend תא גלולה ב 1% BSA/HBSS ולשמור על קרח. אמצעי האחסון המרבי לדגימה תואם עיבוד שלב 3 33.8 µL, אז להבטיח כי נפח דילול/resuspension תא הסופי הוא המתאים לקבל מספר תאים אידיאלי ב- 33.8 µL. אפשרויות מדיה אחרות דילול בשלב זה (ואת כל הקודם דילולים 1% BSA/HBSS) כוללים DMEM, ועד 40% סרום, אך להימנע סידן, מגנזיום או EDTA המכיל נוגדנים.
    1. יוצאים תאים על הקרח כמות מזערית של זמן. אידיאלי לעבודה להכין כל הציוד וחומרי ריאגנטים עבור השלב הבא (שלב 3) במהלך הצעד האחרון של שלב 2.
  5. תא הכנה בדיקות קריטי
    1. לאשר הערכות של מספרי הטלפון הנייד המתקבל FACS. בהתאם לסוג הרקמה דיסוציאציה אורכים, פסולת, תאים יכול להיות דומה מאוד בגודל ובצורה. לפיכך, אלא אם כן כתב פלורסנט משמש, FACS לא יכול לפסול כל פסולת. מומלץ כי ספירת תאים הסופי לאחר אוסף FACS מתבצע כדי להבין איזה אחוז של אירועים (לפי FACS) הם למעשה תאים עבור הכנה נתונה (איור 2 g). לבצע ספירת התאים באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטיות (חוזר פעמיים) ולחשב את אחוז התאים קיימא אשר מיוצג על ידי אירועים הכולל שנאסף על פי מכונת FACS.
    2. אמת תא הכנה. לאמת את לא חלקיקים גדולים (> 100 מיקרומטר) נמצאים גם הם עשויים לסתום ציוד צעדים במורד הזרם. הסרת לקוי של פסולת עלולה סתימת השבב microfluidic תא בודד. צלחת בתאי שנותרה עם כחול Nuc (כאמור לעיל) כדי להבטיח שברי הריסות גדולים לא נוכחים. זה יאפשר גם לאישור כי תאים הם יחיד (כלומר, לא נשארים ביחד) נותן אמון זה ניתוח גנטי של תא בודד במורד הזרם מייצג תאים בודדים ולא בתאים מרובים.
    3. להחליט על מספרי הטלפון הנייד לרצף: יש מגוון גדול של התא רקמות-derived מבוגרים מספרים עבור דגימה ניתן לטעון לתוך המערכת עם עד 8 דגימות שניתן להפעיל בעת ובעונה אחת. מחברים יש לטעון בכל מקום מכל 500 – 50,000 תאים עבור דגימה וקיבלתי datasets scRNA-Seq באיכות טובה. דיון נוסף לגבי מספרי הטלפון הנייד המתאים ביותר כדי לטעון יכול להימצא במקטע דיון. הפלט הסופי של התא ברצף מספרים תלוי בכבדות על איכות חד-תאים מבודדים. טעינת 10,000 תאים רקמות-derived מבוגרים יכול לחזור לשום מקום של 1,000 4,000 תאים ברצף (10-40% חזרה). אם מעוניינת רצף מספרי הטלפון הנייד גבוהה (~ 10,000 תאים, המספר המרבי המומלץ עבור מערכת זו), ואז טעינת 25,000-100,000 תאים יידרש.

3. פנינה (חרוז ג'ל בתחליב) דור ו Barcoding (יום 1)

הערה: השלבים 3-6 של פרוטוקול זה נועדו לשמש בשילוב עם הנפוצה ביותר מבוססת-microdroplet תא בודד פלטפורמה, מיוצר על ידי 10 X Genomics. הנחיות מפורט על שלבים 3 ו- 4 יוקפו בקו של היצרן פרוטוקול (עיין תא בודד כרום 3' לפרוטוקול)11,12 , חייב להיות במעקב יחד עם פרוטוקול זה. לקבלת תוצאות מיטביות, יש להשלים שלב 3 מיד לאחר דיסוציאציה (שלב 1), תא בידוד (שלב 2) צעדים ביום 1 של פרוטוקול זה.

  1. להכין צ'יפס על פי פרוטוקול של היצרן 11,12. הפלטפורמה מבוססת-microdroplet תא בודד משתמשת בטכנולוגיה הזו ברקודים דגימות ~ 750,000 למדד transcriptome של כל תא בנפרד. זו מושגת על ידי חלוקת תאים לתוך חרוז ג'ל באמולסיות (אבני חן) שבו cDNA שנוצר לחלוק ברקוד נפוצות. בעת יצירת פנינה, תאים מועברים כך הרוב (90-99%) של אבני חן שנוצר מכיל אין תאים, בעוד השארית, ברוב המקרים, מכילים תא בודד.
    1. מקם את השבב בעל שבב.
    2. להכין תערובת אב התא על קרח.
    3. להוסיף 50% גליצרול בארות שאינם בשימוש ולהוסיף µL 90 של המיקס אב התא 1 טוב, µL 90 של חרוזי ג'ל כדי µL 2. ובכן, ו 270 של חלוקה למחיצות שמן טוב 3.
    4. מכסים את השבב עם gasket.
  2. לטעון את השבב ולהפעיל בקונטרולר תא בודד.
    1. להוציא את המגש, מקם את השבב במגש, תמשוך את המגש, והקש לשחק. תא בודד 3' ג'ל חרוז בפנינה כולל תחל המכיל רצף אילומינה R1 חלקית (לקריאה פריימר רצף 1), נוקלאוטידים 16 (nt) 10 x Barcode, 10 nt המזהה מולקולרי ייחודי (UMI), רצף פריימר פולי-dT. במהלך הריצה, חרוזי ג'ל הבקר שוחרר, מעורבב עם תא lysate ועל בסיס תמהיל.
    2. לאסוף 100 µL של המדגם, המקום צינור ה-PCR.
    3. המקום המבחנות ב- PCR שנקבע מראש מכונה והפעל את ה-PCR על פי הערכה. בעקבות דגירה, יכלול אבני חן cDNA לבר-קוד באורך מלא, מן ה-mRNA פולי-adenylated.
  3. בעקבות לברוח, המקום ב-20 ° C בלילה עד שבוע לפני שקדמו לשלב הבא.

4. לנקות, הגברה, ובניה ספריה הספרייה כמת (יום 2 ואילך)

הערה: הנחיות מפורט עבור 4 שלבים יוקפו בקו של היצרן פרוטוקול 11,12, ולא חייב להיות במעקב יחד עם פרוטוקול זה.

  1. השתמש silane beads מגנטי כדי להסיר שאריות הביוכימי ריאגנטים/תחל תערובת התגובה פנינה.
  2. להגביר cDNA באורך מלא, לבר-קוד ליצירת מסה מספיקה לבניית ספריה.
  3. להעריך את ה-DNA התשואה. לפני בניית ספרייה, להעריך DNA תשואה של המדגם. זה יקבע כמה מחזורים לשימוש בשלב ה-PCR במורד הזרם (PCR מדד מדגם במהלך הבנייה ספריה). תלויה בתוכן הרנ א מדגם נתון, אשר יכול להשתנות בהתאם הברית ההפעלה (למשל, לעומת שליטה, פצוע, וכו '.), סוג התא, ועם תשואה תא, המספר המומלץ מחזור עשויים להשתנות.
    1. עבור רצף ~ 3000 נגזר רקמת תאים (לא רלוונטי למצבי הפעלה), החוקרים מצאו כי 14 מחזורים (דוגמאות: ~ 10-100 ng DNA) הוא רגיל.
    2. השתמש Bioanalyzer של ניתוח הדנ א. עיין למשתמש מדריך13.
  4. קטע לדוגמה, בחר את גודל ה-DNA. לפני בניית ספריה, השתמש פיצול אנזימטי ופרוטוקולים בחירת גודל להשגת גודל אמפליקון cDNA המתאים.
  5. להכין דוגמאות לבנייה ספריה. בעוד R1 (לקרוא רצף פריימר 1) מתווסף המולקולות במהלך הדגירה פנינה; P5, P7 (אינדקס לדוגמה), R2 (לקרוא רצף פריימר 2) נוספים במהלך הבנייה הספרייה.
  6. להעריך את ה-DNA התשואה. רוב מתקני רצף לדרוש הגשת הסופי ספריות הכוללות מידע פריון הדנ א. לכן, להפעיל את bioanalyzer בגמר של פרוטוקול כולו ולפני הובלת למתקן רצף.
  7. חנות דגימות ב- 80 ° C עד 2 חודשים.
  8. לפני רצף, לכמת דגימות באמצעות ערכת כימות הדנ א. ניתן לבצע זאת במתקן של רצף.

5. ספריית רצף (יום 3 ואילך)

הערה: פלטפורמת barcoding תא בודד transcriptome בשימוש פרוטוקול זה יוצר ספריות לזווג-end אילומינה תואמי ההתחלה ואת הסוף עם רצפי P5 ו- P7. למרות העומק המזערי הדרוש כדי לפתור זהות סוג התא יכול להיות גם 10,000 – 50,000 reads/תא15,16בהיקף, ~ 100,000 reads/תא מומלצת של עסקאות חליפין עלות-כיסוי אופטימלי עבור תאים ויוו למבוגרים (שמירה בראש תא קצת סוגים או תא מינימלית מופעל הברית תגיע הרוויה ב 30,000-50,000 reads/תא).

  1. תחבורה cDNA ספריות על קרח יבש למתקן רצף מצויד ברצף אילומינה המתאים.
  2. ספק את המידע הבא למתקן רצף:
    1. לספק פרטים מדגם: לטעום מזהי אינדקס התואמים לכל ספריה; המינים; מסד הנתונים גנומית להרכבה הראשי (קרי, GRCm38 על העכבר); electropherogram מציג בגדלים שבר bioanalyzer (בין 200 ל 9,000 bp); ריכוז cDNA (ng/µL) וריכוז הכולל ספריה (טווח התשואות הכולל מ- 1400-200 ng); נפח (µL) של הדגימה.
    2. לספק רצף הבקשות: לכמת דגימות באמצעות ערכת כימות DNA; סוג מתאם/אינדקס (TruSeq DNA); סוג צלחת (גלאים twin.tec, חצאית מלאה - מומלצת דנ א); קביעת רצף טכנולוגיה/ספריית סוג (10 x, רצף מלא הנחיות והמלצות מחזור)17.
  3. הפעלת רצף רדוד (אופציונלי): לימודי ניתוח דגימות ביולוגיות מרובים יהנה באגירת דגימות (צבירת) ליצירת מטריצה גן יחיד-ברקוד הכולל נתונים כל הדגימות. כדי למזער תופעות אצווה בין דגימות כאשר איגוד, העומק קריאה בין ספריות שונות צריך להיות מוגדר. כדי לעשות זאת, יש הערכה מדויקת של תא בודד מספרים. הרצפים MiSeq יאפשר רצף רדוד, דרך חסכונית, מעשיים להשגת אומדנים מדויקים התא.
    הערה: ריצה אחת שימוש ברצף MiSeq SR50 מעניק כיסוי מספיק כדי לאמוד במדויק כ 20,000 תאים. הפעל הזה משוער המספר של UMI לשחזר כל ברקוד ייחודי. איור 3a, מוצגת הכותרת של פלט לדוגמה (לדוגמה 1.6) (. csv), רישום ברקודים, UMI המקביל שלו נחשב כפי שנקבע על ידי קריאות בביטחון ממופה.
    1. התייעץ עם bioinformatician להכיר את ה-R שפת תכנות. עיין DataCamp הדרכות עבור מידע נוסף18.
    2. להעריך נתונים גולמיים המתקבל הרצפים (sequencer) באמצעות ה-script R שסופק כמו תבנית19. הנתונים הגולמיים מתייחס מספר UMIs למפות כל ברקוד סלולרי ייחודי. קובץ ה-script קורא את קובץ. csv כאשר העמודה הראשונה הוא רשימה של ברקודים ו העמודה השניה הם UMI המקביל שלו נחשב. קובץ script זה יספק מגרש (איור 3b) כמו גם מספר התאים לבר-קוד בכל מדגם המשוער. להתאים את ה-script כדי להבטיח כי המספר וקבלתו של UMI ספירות דגימה נתון בנקודת שליש הירידה תלולה הראשון. ב- 3b איור, מרפק הזה נופל UMIs בסביבות 225 התואם לבר-קוד 3,480 תאים.
    3. להשוות רצף מלא-עומק באמצעות HiSeq (איפה היו תאים 3,516 בהצלחה וסודרו, איור 3 c), הערכות רצף רדוד חזה 3,480 תאים.
  4. שימוש תא התאוששות קירובים בלבד (מתוך שלב 5.3) או שימוש בתרשים שחזור נמצאו ב פרוטוקול של היצרן20 לתכנן ליין הפצה עבור רצף עמוק יותר. כל מדגם אמור לקבל כיסוי דומות, אז אם רצף רדוד מגלה כי יש מספר שונה של תאים בכל מדגם (שצבעו בדרך כלל המקרה) ואז ליין הפצה יש לחשב בהתאם. תא זרימת HiSeq אחד (אשר כוללת נתיבים 8) יכול רצף עד 2.4 מיליארד סוף לזווג מותאם אישית קריאות. דוגמה זרימה תא הגדרת מוצגת דמותתלת-ממד.

6. עיבוד לקרוא קבצים

הערה: רצף תא בודד 3' הספרייה באמצעות פרוטוקול זה מפיק נתונים גולמיים בתבנית קריאה בבסיס בינארי (BCL). הפקחים תא חבילה משמש כדי ליצור את קבצי FASTQ מבוססי טקסט מקבצי BCL, לבצע גנומית היישורים transcriptomic, ג'ין ספירות, demultiplexing ו צבירה של דגימות. בסעיף זה, מוצג השלבים המפתח אשר מאפשרות למשתמשים להוריד נתונים גולמיים BCL מתקן רצף וליצור ג'ין מסונן-ברקוד מטריצות מוכן ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

  1. השתמש בשרת מרכזי עבור הפעלת התוכנית. BCL קבצים, קבצים FASTQ ואת רוב ביואינפורמטיקה במורד הזרם עיבוד דורש כוח עיבוד משמעותי.
  2. להוריד את כל קבצי raw קריאה על גבי שרת (או קבצים FASTQ אם הן זמינות).
    1. התייעץ עם מנהל השרת כדי להגדיר חשבון על שרת מרכזי או אשכול, עירכו היכרות עם Unix21.
    2. להשתמש בפקודת fetch המתאימה עבור מערכת ההפעלה של השרת כדי להוריד את כל הקבצים מהשרת של המתקן רצף.
      1. רוב רצפי במתקנים פקודה כדי להוריד קבצים מנתיב והמאובטח ניתן להפעיל משורת הפקודה (ראה דוגמה בהמשך).
      2. להחליף את "< שם משתמש >" ו "< סיסמה >" מצייני מיקום בשורת הפקודה עם האישורים שסופקו.
        wget - O - "https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/ - לא-עוגיות-לא-סימון-אישור - נתונים שלאחר ' j_username = שם המשתמש & j_password = הסיסמה ' | wget - לא-עוגיות-לא-סימון-אישור - נתונים שלאחר ' j_username = שם המשתמש & j_password = הסיסמה ' - ci -
    3. אם רק נתיב מוחלט לקבצים מסופק (קרי https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/), הכנס נתיב זה פקודה fetch.
  3. ביטול דחיסה של קבצים: אם הורדת סוף קבצים עם הסיומת ".gz", זה דחוסה באמצעות הפקודה "gzip". כדי לפתוח, לפתוח הפעלה הפקודה בשורת הפקודה (ראה דוגמה בהמשך).
    gunzip raw_read_files.gz
  4. הורד את הגירסה העדכנית ביותר של הפקחים תא לשרת בתור עצמאי .tar22.
    1. קריטי: לפני ההורדה, להבטיח שמערכת לינוקס עונה על דרישות המינימום23. להבטיח מינימום של 8 ליבות מעבד Intel עם 64 GB זיכרון RAM ו 1 טרה-בתים של שטח דיסק פנוי.
      הערה: תא הפקחים מספק התייחסות אנושית, מכרסם שנבנו מראש transcriptomes. אלה ניתן לשנות באמצעות הפקודה cellranger mkref כדי לזהות גנים כמו GFP24.
  5. ליצור קבצי FASTQ מקבצים של הרצפים (sequencer) בסיס השיחה (BCLs) באמצעות הפקודה mkfastq cellranger.
    הערה: התוכנית ליישר קריאות raw (מקבצים FASTQ) כדי הגנום הפניה וצור ג'ין-תא מטריצות לניתוח במורד הזרם. היא משתמשת aligner כוכב מבצע יישור שחבור-aware הקריאות כדי הגנום הפניה. רק בביטחון ממופה קריאות (כלומר, קריאות תואם לביאור גנטית יחיד) משמשים לספירת UMI.
    1. לדוגמה, השתמש בפקודה mkfastq cellranger:
      cellranger mkfastq - id = sample_name \
      --תריץ = / נתיב/ל/דגימת \
      --csv=csv_file_containing_lane_sample_index.csv
  6. הרץ הרוזן cellranger FASTQ קבצים שנוצרו באמצעות mkfastq כדי להפיק מתא בודד הגן ספירות.
    1. לדוגמה, השתמש בפקודה הרוזן cellranger:
      הרוזן cellranger - id = sample_name \
      --transcriptome = refdata-cellranger-mm10-1.2.0 \
      fastqs... = / המוחלט/נתיב/אל/fastq/קבצים \
      --הדגימה = same_sample_name_supplied_to_cellranger_mkfastq \
      --localcores = 30
  7. ספריית מרובה צבירה (אופציונלי): כדי לשלב דוגמאות, בריכה cellranger ספירת פלטי שימוש באותיות גדולות cellranger א. התוצאה היא מטריצה גן יחיד-הברקוד המכיל נתונים איחדו בין ספריות מרובות. דוגמה cellranger באותיות גדולות א הפקודה:
    . באותיות גדולות - cellranger א-id = sample_name \
    --csv = csv_with_libraryID_ & _path_to_molecule_h5.csv \
    --לנרמל = ממופה
    הערה: ספריות יכול תסוכם באמצעות שלושה מצבי נורמליזציה (ממופה, raw, אף אחד). ממופה, מומלץ כמו זה subsamples גבוה יותר עומק ספריות עד כל ספריות יש רצף שווה עומק25.
  8. לצורך בדיקה באופן מיידי ויזואליזציה/נתונים, לייבא קובץ הפלט .cloupe (נוצר באמצעות ספירת cellranger או באותיות גדולות cellranger א) 10 x דפדפן תא זכוכית מגדלת26.

7. ניתוח מתקדם של scRNA-Seq Datasets

הערה: ניתן למצוא כלים scRNA מלאה-Seq מסד נתונים בגיל3,scRNA-כלים27. להלן מסגרת התא ללא השגחה באמצעות סרה2 וסוגי pseudotemporal מזמין באמצעות מונוקל6. אמנם רוב העבודה יכול להיעשות במחשב מקומי, השלבים הבאים להניח כי חישוב יושלם באמצעות שרת מוסדיים.

  1. הורד את הגירסה העדכנית ביותר של Miniconda על חשבון שרת באמצעות פלטפורמת לינוקס28.
  2. התקן את הגירסה העדכנית ביותר של R באמצעות conda29.
  3. להתוות נתונים באמצעות ה-script סרה R שסופק בתור תבנית30.
    הערה: סרה הוא toolkit מבוסס-R מאפשר בדיקות בקרת איכות האשכולות, דיפרנציאלי ניתוח ביטוי גנטי, סמן גנטי זיהוי, הפחתת dimensionality, ויזואליזציה של נתונים scRNA-Seq. ניתן למצוא תיאור מקיף של סרה קידוד ומדריכים על אתר המעבדה Satija31.
  4. להתוות נתונים באמצעות הסקריפט מונוקל R שסופק כמו בגודל תבנית32.
    הערה: משקף הוא אחר מבוסס-R toolkit מאפשר הדמיה של שינויים בביטוי מעל pseudotime ומזהה גנים שבבסיס החלטות גורל התא. ניתן למצוא תיאור מקיף של קידוד מונוקל ומדריכים על אתר המשקף33.
  5. יכול להיות מועסק מו-חבילות כגון kBET כדי לבדוק ולתקן אצווה אפקטים כתוצאה איגוד נתונים (datasets)34.

8. NCBI גיאו ואת ההזמנות הגשות

הערה: מאז גישה נוחה לקבצים רצף raw להבטיח הפארמצבטית בצמחייה, הבקשות של מאגרים מהעדכונים הזמינים באינטרנט accessioned המומלץ או הנדרש לפני שליחת כתב יד. המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה של (NCBI) Omnibus ביטוי גנים (GEO) ארכיון קריאה ברצף (ההזמנות) נמצאים במאגרי נתונים נגיש לציבור עבור תפוקה גבוהה רצף נתונים35,36.

  1. להירשם לקבלת חשבון השולח גיאוגרפי של NCBI37.
  2. הגשת גיאו מלאה אשר כוללת שלושה מרכיבים הידור לתוך תיקיה/מדריך (שכותרתו כמו username של השולח גיאו): 1) הרשומה מטה-נתונים (גיליון אלקטרוני אחד לכל פרויקט ההגשה); קבצי נתונים גולמיים 2); 3) עיבוד קבצי נתונים.
    1. הורד והשלם את הגיליון האלקטרוני של מטה-נתונים38. הגשת גיאו הציבוריים הבאים יכול לשמש מדריך (GSE100320)39. מקם את הגיליון האלקטרוני בספריה.
    2. המקום Raw קבצי הנתונים המופקים cellranger ספירת script עבור כל ספריות לספרייה.
    3. המקום לעבד קבצי נתונים (מסונן barcodes.tsv, genes.tsv ו- matrix.mtx קבצים) שנוצר מקובץ script ספירת cellranger עבור כל ספריות לספרייה.
  3. השתמש באישורים של שרת ה-FTP של גיאו השולח כדי להעביר את התיקיה המכילה את כל שלושת הרכיבים. למשתמשי לינוקס/יוניקס: ncftp, lftp, ftp, sftp, ncftpput יכול לשמש.
  4. הודע גיאו עבור העברות כל38.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרפרטואר של קוד פתוח חבילות נועד לנתח את scRNA-Seq datasets גדל באופן דרמטי40 עם רוב השימוש האלה חבילות שפות מבוססות-R3. כאן, נציג תוצאות באמצעות שתי חבילות אלה מוצגים: הערכת קיבוץ ללא השגחה של יחיד המבוססת על ביטוי גנים בתאים ואת הזמנת תאים בודדים לאורך מסלול כדי לפתור תא הטרוגניות לפרק ביולוגית תהליכים.

איור 4 מדגימה את השימוש סרה לעיבוד מראש בדיקות איכות וניתוח ביואינפורמטיקה במורד הזרם. ראשית, סינון והסרה של תאים סוטה מן ניתוח הכרחי לבדיקת איכות. הדבר נעשה באמצעות כינור (איור 4a) ופיזור מגרשים (איור 4b) כדי להמחיש את האחוז של גנים מיטוכונדריאלי, מספר גנים (nGene) ומספר אומי (nUMI) כדי לזהות תא doublets ליניאריים. תא כלשהו עם מספר חריג חשוד טעות ברורה של גנים, UMI או אחוזים של גנים מיטוכונדריאלי הוסר בעזרת פונקציה FilterCells של סרה. מאז סרה משתמשת גורמים ראשיים (PC) ניתוח תוצאות לתאים אשכולות, קביעת מחשבים סטטיסטית כדי לכלול הוא שלב קריטי. מגרשים המרפק (איור 4 c) שימשו לבחירה PC, ב אשר מחשבים מעבר הרמה של 'סטיית התקן של PC' ציר שוחררנו. הרזולוציה של קיבוץ באשכולות תומרנה גם הוכחת כי מספר אשכולות יכול להשתנות, החל 0.4 (ברזולוציה נמוכה שמוביל פחות תא אשכולות, איור 4 d) 4 (ברזולוציה גבוהה שמוביל גבוה תא אשכולות, דמות 4e ). ברזולוציה נמוכה, סביר כי כל אשכול מייצגת את סוג התא מוגדר, ואילו ברזולוציה גבוהה זה עשוי גם לייצג יחוברו או מדינות המעבר של אוכלוסיה התא. במקרה זה, הגדרות אשכול ברזולוציה נמוכה שימשו לניתוח נוסף ביטוי heatmaps (באמצעות הפונקציה DoHeatmap של סרה) כדי לזהות את הגנים ביותר ביטוי באשכול נתון (איור 4f). במקרה זה, הגנים ביותר ביטוי אותרו על-ידי הערכת ביטוי דיפרנציאלי באשכול נתון לעומת כל שאר האשכולות משולב, הוכחת כל אשכול ייצגו באופן ייחודי גנים מוגדרים. בנוסף, ניתן לאבחן מועמד בודדים גנים על חלקות tSNE באמצעות פונקציית FeaturePlot של סרה (איור 4 g). פעולה זו מותרת עבור פענוח אם היו קבוצות שייצג מקרופאגים. שימוש FeaturePlot, מצאנו כי שניהם שכונה 2 ו- 4. הבעת Cd68 - פאן-מקרופאג סמן.

החבילה מונוקל שימש בעדות אשכולות תא שזוהתה סרה ועל בניית מסלולים התא, או הזמנת pseudotemporal, כדי לסכם תהליכים ביולוגיים (איור 5). הזמנת pseudotemporal יכול לשמש עבור דגימות איפה פרופילי ביטוי תא בודד צפויים לבצע קורס לזמן הביולוגי. התאים ניתן להזמין לאורך רצף pseudotemporal לפתרון ביניים הברית, נגע הסתעפות נקודות של שני תא חלופי הגורלות, ולזהות חתימות ג'ין שבבסיס רכישת כל הגורל. ראשית, דומה הסינון של סרה, תאים באיכות ירודה הוסרו כזה כי ההתפלגות של mRNA על פני כל התאים היה יומן רגילה ונפל בין חסם שתוארו בעלון איור 5a. לאחר מכן, באמצעות הפונקציה newCellTypeHierarchy של המשקף, תאים בודדים סווגו וספרתי באמצעות גנים סמן היוחסין הידועה (איור 5b, ג 5). לדוגמה, תאים המבטאים PDGF הקולטן אלפא או 1 חלבון ספציפי פיברובלסט הוקצת תא סוג #1 לשם יצירת קריטריון להגדרת fibroblasts. בשלב הבא, אוכלוסייה זו (תא סוג #1) נאמד לפענח פיברובלסט מסלולים. כדי לעשות זאת, הפונקציה GeneTest דיפרנציאלית של המשקף היה מנוצל, אשר לעומת התאים פדרטיביות קיצוניים בתוך האוכלוסייה ומצא גנים דיפרנציאלי עבור הזמנת את התאים הנותרים באוכלוסייה (איור 5-d). על ידי יישום שיטות למידה סעפת (סוג של הפחתת dimensionality שאינו ליניארי) על פני כל התאים, הוצב קואורדינטה גדולה לאורך נתיב pseudotemporal. מסלול זה היה אז דמיינו ידי תא המדינה (איור 5e) ואת pseudotime (איור 5f).

figure-results-1
איור 1: תרשים זרימה- השלבים של כל בעל חיים הכנה לניתוח יחיד תא RNA-Seq datasets ועד להגשת datasets הסופי ולמאגר זמין לציבור. חרוזי ג'ל בתחליב (אבני חן) מתייחסים חרוזים עם oligonucleotides לבר-קוד אשר לתמצת אלפי תאים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2: יצירת תא בודד קיימא ההשעיה מרקמות עצב. (א) קריקטורה סקירה של בדיקות בקרת איכות. תאים (ב'), פסולת עם תאים עדיין שולבו פסולת (חצים אדומים). (ג) תאים שוחרר מפני פסולת (חצים אדומים). (ד) תא בידוד מאת FACS. P0: פסולת שבר; P1: תאים דמויי שבר; P3: הדרה של duplets; P4: הכדאיות צבען (Sytox כתום) שבר שלילי. (ה) אין שליטה לצבוע הכדאיות. (ו) תמונה של שבר P0 המייצג פסולת מבודד. (ז) תמונה של שבר P4 המייצג מבודד התאים קיימא (חצים אדומים). (b) (ג) (ו) והיה (גרם) גרעיני צבע הוסיף 20 דקות לפני הדמיה. סרגלי קנה מידה: 80 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3: רצף רדוד מנבאת את מספר התאים התאושש ב 10 X דגימות מעובד. (א) הוא דוגמה (לדוגמה 1.6) שנוצר על-ידי MiSeq csv רישום תא ברקודים ו- UMI המקביל שלו סופרת כפי שנקבע על ידי קריאות בביטחון ממופה. (ב) העלילה דרגה ברקוד מדגם 1.6 מראה טיפה אחת משמעותית בספירת UMI כפונקציה של התא ברקודים. הקווים מוצק ואיתן מקווקווים מייצגים החיתוך בין תאים לבין הרקע כפי שנקבע על ידי בדיקה ויזואלית. (ג) תא ברקודים נצפתה באמצעות הפקחים תא צינור הפוסט-HiSeq מגלה רצף רדוד במדויק לקרב את ערכיהן מספר התאים עבור מדגם 1.6. (ד) דוגמה של מלכודת זרימה-התא המבוסס על רצף רדוד נגזר תא הערכות. עבור מדגם 1.6, מאז רצף רדוד חזה 3480 תאים, מסלולים 1.17 שהוזמנו כדי להבטיח > קריאות 100,000 לכל רצף הקליטה ב- HiSeq. הערה: כל הנתיבים עליך להוסיף ל- 100%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4
איור 4: בקרת איכות, ביואינפורמטיקה של תא בודד RNA-Seq dataset שימוש בחבילת סרה R. (א) חלקות מדדים בקרת איכות הכוללים מספר גנים, מספר מזהים ייחודיים מולקולרית (UMIs), ואת האחוז של תעתיקים מיפוי הגנום מיטוכונדריאלי. (ב) דוגמת ג'ין חלקות גילוי תאים עם רמות חריגה של תעתיקים מיטוכונדריאלי UMIs. (ג) מדגם מגרש המרפק משמש נחישות אד הוק של מחשבים אישיים משמעותיים מבחינה סטטיסטית. הקווים מקווקו והשמדת על-ידי נקודה מייצגים החיתוך בה "מרפק" ברור הופך לעין בגרף. PC מידות לפני זה המרפק כלולים בניתוח במורד הזרם. (ד, ה) אשכולות מבוססי גרף תא דמיינו ברזולוציות שונות שני ברווח נמוך-ממדי באמצעות מגרש tSNE. (f) סמן העליון גנים (צהוב) עבור כל אשכול דמיינו על heatmap ביטוי באמצעות פונקציית DoHeatmap של סרה. (ז) להמחיש סמן ביטוי, לדוגמה, ג'ין Cd68 המייצג מקרופאגים (סגול) באמצעות פונקציית FeaturePlot של סרה. הדבר מצביע על שהאשכול הזה 2 ו- 4 (ברה החלונית) של ערכת נתונים זה מייצג מקרופאגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5
איור 5: תא חלוקה לקטגוריות וסידור לאורך מסלול peudotemporal באמצעות ערכת מונוקל. (א) בוחן את ההפצה של mRNA (להסיק מן UMI ספירות) על פני כל התאים במדגם. רק תאים עם ה-mRNA בין 0 - ~ 20,000 שימשו לצורך ניתוח במורד הזרם. (b, c) הקצאת וספירת סוגי תאים בהתבסס על שושלת היוחסין הידועה תא סמנים. לדוגמה, תאים המבטאים PDGF הקולטן אלפא או 1 חלבון ספציפי פיברובלסט הוקצת תא סוג #1 המייצג פאן-fibroblasts באמצעות פונקציית newCellTypeHierarchy של המשקף. מספר סוגי תאים שונים, ניתן לאבחן תרשים עוגה (b) וכן טבלה (c). (ד) באמצעות תאים מסוג #1 (fibroblasts) כדוגמה, הגנים המשמש עבור הזמנת תאים ניתן לאבחן באמצעות מגרש פיזור המדגים ג'ין נפיצה לעומת הביטוי מרושע. העקומה אדום מראה החיתוך עבור גנים המשמש עבור הזמנת מחושב לפי מודל אומר-השונות באמצעות הפונקציה estimateDispersions של המשקף. גנים העונים על הפסקת זו שימשו עבור הזמנת pseudotime במורד הזרם. (e, f) ויזואליזציה של התא מסלולים במרחב דו-ממדי מופחתת בצבע "המדינה של התא" (e), וכן מוקצה מונוקל "Pseudotime" (f). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מדגים איך ההכנה המתאימה של תאים בודדים אפשר לחשוף את הטרוגניות תעתיק של אלפי תאים בודדים ולא להפלות הברית תפקודית או זהויות ייחודיות סלולר בתוך רקמה. הפרוטוקול אינה דורשת כתב פלורסנט חלבונים או כלים מהונדס, ניתן להחיל את בידודה של תאים בודדים של רקמות שונות כולל אלה של בני אדם; במחשבה כל הרקמה הוא ייחודי, פרוטוקול זה דורש מידה מסוימת של התאמה/שינוי.

התוכניות תעתיק מגוונים ודינאמיים מאוד בתוך התאים הדגישו את הערך של תא בודד גנומיקה. מלבד בידוד איכותי RNA, צעד הכנת דגימה קריטית הדרושות datasets באיכות גבוהה זה להבטיח כי התאים משתחררות לחלוטין מרקמות וכי התאים הם בריאה ושלמה. זה יחסית ישר קדימה עבור איסוף תאים שנמצאים בקלות שוחרר, כגון מחזורי תאים או ברקמות שבו תאים נשמרים באופן רופף, כגון רקמות הלימפה. אבל זה יכול להיות מאתגר בשביל לרקמות אחרות למבוגרים, עקב מפותחים הארכיטקטורה הסלולר המתפרסות על-פני מרחקים גדולים, סביב מטריצה חוץ-תאית, לעיתים קרובות נוקשה cytoskeletal החלבונים המעורבים שמירה על מבנה התא. אפילו עם דיסוציאציה המתאים טכניקות לשחרור מלא של תאים, יש פוטנציאל עיבוד קפדני וממושך לעתים קרובות נדרש לשנות את איכות ה-mRNA ותקינות תא. בנוסף, בטמפרטורות גבוהות המשמש בסיוע אנזימים דיסוציאציה להשפיע גם על חתימות תעתיק29,30. הכוונה של הפרוטוקול היא להציג את בקרת איכות בודק, באמצעות רקמות כגון העצב למבוגרים סיבי העצב ואת העור למבוגרים עשיר מטריצה חוץ-תאית, כדי להדגים איך אופטימיזציה יכול לעזור להתגבר על מכשולים אלה.

שיקול מרכזי בעת עיצוב כל ניסוי scRNA-Seq הוא הבחירה של רצף עומק. רצף ניתן מאוד מרובב ולקרוא לעומק יכול לנוע בין היותו נמוך מאוד באמצעות שחרור-Seq2 עד 5 מיליון קריאות תא14 באמצעות שיטת ה-RNA-Seq באורך מלא כגון Smart-תת סעיף. רוב הניסויים scRNA-Seq יכול לזהות ביטוי בינונית-גבוהה תעתיקים עם רצף המתחילים 10,000 קריאות תא, אשר מספיקה בדרך כלל עבור תא סוג סיווג41,42. רצף רדוד עומק יהיה ערך כדי לחסוך בעלויות רצף כאשר מנסים לגלות אוכלוסיות תאים נדיר מעבר רקמות מורכבות שבו אלפי תאים עשוי להיות נחוץ כדי לייחס בביטחון אוכלוסיות נדיר. אבל עומק רדוד רצף אינה נאותה כאשר מידע מפורט על ביטוי גנים ותהליכים הקשורים חתימות תעתיק עדין הוא הכרחי. נכון לעכשיו, ההערכה היא כי רובם המכריע של הגנים בתא מזוהים עם 500,000 reads/תא, אבל זה יכול להשתנות בהתאם לפרוטוקול, רקמות הקלד43,44. ואילו רצף באורך מלא התעתיק עוקף את הצורך הרכבה יכול, לפיכך, לזהות הרומן או גרסאות splice נדיר, עלויות רצף מגבילים לעתים קרובות שינוי גודל כזה גישות לבחון אלפי תאים הכוללת מערכת רקמות מורכבות. לעומת זאת, 3' מתויג תא בודד ספריות כמו אלו המתוארים פרוטוקול זה בדרך כלל יש המורכבות נמוך יותר ודורשים רצף רדודים. חשוב לציין כי היה לסדרם ספריות שנוצר באמצעות פרוטוקול המתואר באחד חמש סקוונסרים הנתמכים: 1) NovaSeq, HiSeq 2) 3000/4000, 3) HiSeq 2500 ריצה מהירה, תפוקה גבוהה, 4) NextSeq 500/550 ו 5) MiSeq.

גישה חלופית לתא בודד RNA-Seq, אשר מפחית את הצורך רקמה עדינה ותא טיפול עדיין שומר על חלק מהיתרונות של תא בודד RNA-Seq, הניתוח של RNA מן הגרעינים יחיד45. גישה זו מאפשרת עיבוד מהירה יותר השפלה RNA, ובמידה יותר באמצעים קיצוניים. כדי להבטיח שחרור נאותה של גרעינים, ומאפשר לפיכך סביר לכידה בטוח יותר מהפרופילים תעתיק המייצגים כל התאים בתוך רקמות נתון. זה, כמובן, רק יספק חלק הפעילות תעתיק מתנה בתוך תא נתון, ולכן תלוי מה מטרות הניסוי הן עניין גישה זו עשויה או לא עשויה להיות המתאים.

מלבד להשלים אפיון זהויות סלולר בתוך רקמות נתון, אחד הניתוחים החשובים ביותר עבור scRNA-Seq datasets הוא ההערכה של הברית תעתיק ביניים על פני אוכלוסיות תא 'מוגדרת'. מדינות אלה מתווך להקנות תובנות הגומלין שושלת היוחסין בין תאים בתוך אוכלוסיות מזוהה, דבר שלא היה אפשרי עם מסורתיים בצובר ש-RNA-Seq מתקרב. מספר כלים bioinformatic scRNA-Seq עכשיו פותחו כדי להבהיר את זה. כלים כאלה יכולים להעריך את התהליכים המעורבים, לדוגמה, תאים סרטניים מעבר למצב oncogenic גרורתי, תאי גזע הופך מגוונות הגורלות מסוף או תאים חיסוניים בין מדינות השבתה הדרגתית האקטיביות. ההבדלים העדינים transcriptome בתאים יכול להיות גם מעידה על שושלת היוחסין הטיות, כלים שפותחו לאחרונה bioinformatic כמו FateID, ניתן להסיק47. מאז ההבחנות בין העושים מעבר מיגדרי תאים יכול להיות קשה לאמת נתון ההבדלים תעתיק עשויה להיות עדינים, רצף עמוק עשוי להיות נחוץ46. למרבה המזל, ניתן להגדיל את הכיסוי של ספרייה רדודות ברצף אם מעוניינת חיטוט נוסף את ערכת הנתונים על-ידי הפעלה מחדש של הספרייה על תא אחר זרימת.

יחדיו, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קל להסתגל ומאפשר למשתמשים transcriptionally פרופיל מאות עד אלפי חד-תאים בתוך ניסוי אחד. האיכות הסופית של מבנה נתונים scRNA-Seq מסתמך על בידוד תא ממוטבת, cytometry זרימה, דור ספריית cDNA פרשנות של ג'ין raw-ברקוד מטריצות. לשם כך, פרוטוקול זה מספק סקירה מקיפה של כל השלבים החשובים שניתן לשנותו בקלות כדי לאפשר לימודי סוגי רקמות מגוונות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין גילויים

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו להכיר את צוות התמיכה במתקן שירותי UCDNA, כמו גם צוות המתקן חיה טיפול מאוניברסיטת קלגרי. אנו מודים מאט Workentine בשל תמיכתו ביואינפורמטיקה, ג'נס Durruthy לתמיכה טכנית שלו. עבודה זו היה ממומן על ידי מענק CIHR (חומרי גלם, ג'יי-בי), פרס חוקר חדש CIHR מאד, בריאות מחקר מכון אחווה (י. ס אלברטה לילדים).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>מוצרים
RNAse outBiosciences786-70
פנטוברביטל נתרןאותניל50 מ"ג/ק"ג
HBSSGibco14175-095
Dispase 5U/mlStemCell Technologies79135 מ"ג/מ"ל
קולגנאז-4 125 CDU/מ"גסיגמא-אולדריץ'C51382 מ"ג/מ"ל
DNAseSigma-AldrichDN2510 מ"ג/מ"ל
BSASigma-AldrichA7906
15 מ"ל צינור תחתון צר VWR® צינורות צנטריפוגה בעלי ביצועים גבוהיםVWR89039-666
Sytox כתום כדאיות צבעבדיקות מולקולריות113209721.3 nM/µ l
Nuc Blue Live ReadyProbesInvitrogenR37605
Agilent 2100 Bioanalyzer ריאגנטים DNA רגישות גבוההAgilent5067-4626
Kapa DNA Quantification KitKapa BiosystemsKK4844
כרום תא יחיד 3' ריאגנטים10x גנומיקה
<חזק>ציוד
BD FACSAria IIIBD Biosciences
Agilent 2100 פלטפורמת ביואנלייזרAgilent
Illumina® HiSeq 4000Illumina
Illumina® MiSeq SR50Illumina
10X בקר + אביזרים10x Genomics
Software
The Cell Ranger10x GENOMICSsupport.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/welcome
זכוכית מגדלת דפדפן תא10x GENOMICS
Rhttps://anaconda.org/r/r
support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation. Nature. 510, 363-369 (2014).
  2. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015).
  3. Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database. bioRxiv:206573. , (2018).
  4. Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage. Cell Reports. 18 (3), 777-790 (2017).
  5. Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
  6. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).
  7. Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).
  8. Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
  9. Stratton, J. A., et al. Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
  10. Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocols. 1 (6), 2803-2812 (2007).
  11. 10X Genomics. User Guides. , Available from: https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/ (2018).
  12. 10X Genomics. Chromium Single Cell 3' Training Module. , Available from: http://go.10xgenomics.com/training-modules/single-cell-gene-expression (2018).
  13. Agilent. , Available from: https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135 (2018).
  14. Kolodziejczyk, A. A. Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation. Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).
  15. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343, 776-779 (2014).
  16. Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).
  17. 10X Genomics. Sequencing Requirements for Single Cell 3'. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3 (2018).
  18. Datacamp. Introduction to R. , Available from: https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r (2018).
  19. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
  20. 10X Genomics. User Guides. , Available from: https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/ (2018).
  21. UNIX Tutorial for Beginners. , Available from: http://www.ee.surrey.ac.uk/Teaching/Unix/ (2018).
  22. 10X Genomics. Creating a Reference Package with cellranger mkref. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references (2018).
  23. 10X Genomics. System Requirements. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements (2018).
  24. 10X Genomics. Software Downloads. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest (2018).
  25. 10X Genomics. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization (2018).
  26. 10X Genomics. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial (2018).
  27. scRNA-tools. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data. , Available from: https://www.scrna-tools.org/ (2018).
  28. Conda. Downloading conda. , Available from: https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html (2018).
  29. Anaconda. r / packages / r 3.5.1. , Available from: https://anaconda.org/r/r (2018).
  30. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
  31. Satija Lab. Seurat - Guided Clustering Tutorial. , https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html (2018).
  32. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. , Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
  33. Monocle. , Available from: http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/docs/#constructing-single-cell-trajectories (2018).
  34. Github. An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. , (2018).
  35. Edgar, R. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).
  36. Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. The sequence read archive. Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).
  37. NIH. GenBank Submission Portal Wizards. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/ (2018).
  38. NIH. Submitting data. , Available from: https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/ (2018).
  39. Shah, P. T., et al. Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function. Cell. 173, 1045-1057 (2018).
  40. Anon, Method of the Year 2013. Nature Methods. 11, 1(2013).
  41. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144, 3625-3632 (2017).
  42. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96, 313-329 (2017).
  43. Zeigenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  44. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nature Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
  45. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  46. Janes, K. A. Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method. Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).
  47. Herman, J. S., Sagar,, Grün, D. FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data. Nature Methods. 15 (5), 379-386 (2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Tissue DissociationFACS SortingGEM GenerationLibrary ConstructionBioinformatics AnalysisSeurat R PackageCell Ranger

מאמרים קשורים