המוטיבים אן יציב, 1 י ו- 2D Nanostructures בנוי מולקולות DNA מעגלי קטן

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור T4 מצדו ולטיהור denaturing דף קטן מולקולות DNA מעגלי, חישול, ניתוח דף מקורית של אריחים מעגלית, בהרכבת AFM הדמיה של nanostructures ה-DNA 1 י ו- 2D, כמו גם agarose ג'ל אלקטרופורזה וטיהור צנטריפוגה של סופי אן nanostructures.

תקציר

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של סינתזה של מולקולות DNA מעגלי קטנות, חישול של מעגלי DNA מוטיבים ובניית nanostructures DNA 1 י ו- 2D. במשך עשרות שנים, הפיתוח המואץ של ננוטכנולוגיית דנ א מיוחס השימוש DNAs ליניארית כמו למקורות ראשוניים. לדוגמה, המשבצת דאו (כפול מוצלב, antiparallel, מוזר. מסתבר חצי) היא ידועים כמו אבן בניין להקמת רשתות ה-DNA 2D; המבנה הליבה של DAO עשוי שתי oligonucleotides חד גדילי לינארי (הה), כמו שני חבלים עושה קשר סבתא יד ימין. במסמך זה, סוג חדש של אריחים DNA נקרא cDAO (בשילוב DAO) נבנים תוך שימוש קטן מעגלית ss-DNA של c64nt או c84nt (מעגלית 64 או 84 נוקלאוטידים) וגם סטרנד לגרדום מספר ליניארי האס. אס-DNAs כמו קווצות סיכות. Nanostructures 1D ו- 2D מושלם are התכנסו from cDAO אריחים: nanowires אינסופי, nanospirals, צינורות, nanoribbons; סופי ננו-מלבנים. פרוטוקולים מפורט מתוארים: 1) הכנה על ידי T4 ליגאז וטיהור על ידי denaturing עמוד (לזיהוי אלקטרופורזה בג'ל) של oligonucleotides עגול קטן, 2) חישול של אריחים מעגלית יציב, ואחריו ניתוח דף מקורית, 3) הרכבה של אינסוף 1 י nanowires, nanorings, nanospirals, פומפיה 2D אינסופי של צינוריות nanoribbons ו ננו 2D סופיים-מלבנים, ואחריו AFM (מיקרוסקופ כוח אטומי) הדמיה. השיטה היא פשוטה, חזקים, במחיר סביר עבור רוב מעבדות.

מבוא

היו בשימוש במולקולות דנ א כדי לבנות סוגים רבים של nanostructures במשך עשרות שנים. מוטיבים אופייניים כוללים דיי (מוצלב זוגי, antiparallel, אפילו חצי. מסתבר) ורווקה DAO אריחים^1,2,3, אריחים כוכב^4,5,6,7, תקועים (הה) אריחים^8,9,10, ו- DNA אוריגמי^11,12,13. אלה המוטיבים אן, פומפיה are התכנסו from ss ליניארי-DNAs. לאחרונה, אנחנו ואחרים דיווחו השימוש של האס. אס מעגלית-oligonucleotides כמו פיגומים לבנות מוטיבים, צינורות 1 י, ואת רשתות 2D^14,15,16,17. על-ידי הוספת הולידיי לצומת (ג'ונסון)^18,19,20,21 במרכז c64nt, זוג שני אריחים DAO בשילוב יכול להיות בנוי¹⁷. זה מוטיב cDAO חדש ונגזרותיו יציבים, DNA נוקשה מספיק כדי להרכיב 2D סורגים עד 3 × 5 מיקרומטר². בנייר זה, אנו משתמשים מונח של "אריח מעגלית", אשר מוגדר יציב DNA מורכב מולקולה נבנה עם אחד לגרדום מעגלית ומקומות ליניארי של האס. אס-oligonucleotides, מונח אחר של "אריח ליניארי", אשר נבנה מתוך ערכה מלאה של ליניארי אס-oligonucleotides.

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבנות חמישה סוגים של ה-DNA nanostructures עם מולקולות DNA מעגלי קטן כמו פיגומים: nanowires c64nt ו- c84nt 1 י 1) אינסופי, אינסוף 2) 2D cDAO-c64nt-O, cDAO-c64nt-E (-O מייצגת מספר אי-זוגי של 5. מסתבר חצי ו- E פומפיה מייצג מספר זוגי של חצי-הופכת 4), 3) אינסופי 2D cDAO-c84nt-O ו- cDAO-c84nt-E פומפיה, 4) סופית 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O ו- 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O מלבנים, 5) אינסופי 1 י acDAO-c64nt-E nanorings ו- nanospirals (עיין איור 3-5 סכמטי ציורים, תמונות של חמישה סוגי הדנ א nanostructures לעיל). 1 י c64nt ו- c84nt nanowires are התכנסו from כל לגרדום c64nt ו- c84nt הקשורים עם שתי סיכות ליניארי בהתאמה. כל אריח מעגלית של cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt או cDAO-c84nt הוא annealed מ שלה לגרדום המתאים של c64nt, c74nt או c84nt עם ארבע סיכות ליניארי בהתאמה. פומפיה 2D אינסופי הם התאספו מאותו סוג? של שני אריחים מעגלית עם רצפים שונים. פומפיה מלבן 2D סופית שני are התכנסו from שתי ערכות של 32 אריחים תת מעגלית בהתאמה. כדי לחסוך כסף, c64nt רק אחד רציף, c74nt ו- c84nt משמש לגרדום המתאימים בזמן המסוכך שונות משמשות anneal של 32 cDAO-c64nt, cDAO 12-c74nt, ואריחי cDAO 20-c84nt מעגלית משנה בהתאמה בשלב הראשון אריח תת מחזק, אז מערבבים יחד המתאימים 32 מעגלית תת האריחים ולהחיל בסריג השני חישול שלב להרכיב את סופי 5 × 6 cDAO-c64nt-O ו- 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O רשתות, בהתאמה. . בהחלט, וסודרו באופן שונה פיגומים מעגלית ניתן לאמץ להרכיב מגוון רחב של גודל סופי nanostructures, אולם זה יעלה יותר כסף, עמל. Nanorings acDAO-c64nt-E 1D אינסופי של nanospirals הם annealed האריחים רציף אחד אסימטרי acDAO-c64nt עם חיבורי ליניארי של מספר זוגי של חצי 4. מסתבר. ישנן שתי גישות להרכיב אינסוף פומפיה 2D האריחים מעגלית של cDAO-c64nt ו- cDAO-c84nt, אשר נבדלים על ידי מרחקים intertile של מספר זוגי של 4 ומספר אי-זוגי של חצי 5. מסתבר בהתאמה. לשעבר דורש כל האריחים ייושר באופן זהה; האחרון דורש ניטור פניהם של שני האריחים הסמוכים לאורך הצירים הסליל. אם המשבצת מישורי, כגון cDAO-c64nt הנוקשה, שתי הגישות יפיק nanoribbons מישורי; אם המשבצת מעוקם לכיוון בכיוון אחד, כגון cDAO-c84nt, חיבור intertile של מספר זוגי של 4 פונה חצי יפיק צינוריות, ואילו החיבור intertile של מספר אי-זוגי של 5 פונה חצי יפיקו מישורי nanoribbons בשל חיסול מוטה-עקמומיות הצמיחה על ידי יישור חלופי של אריחים מעוקל. הרכבה מוצלחת של nanostructures ה-DNA 1 י ו- 2D האריחים מעגלית מציין מספר יתרונות של גישה חדשה זו: לאכוף את יציבות, קשיחות של אריחים מעגלית על אריחים ליניארי, אריחים כיראלי להרכבת סימטרית nanostructures כגון nanorings, nanoribbons, חזיונות חדשים על להבין את מכניקת הדנ א ואת מבנה מולקולרי, וכו '.

פרוטוקול

1. הכנת DNAs עגול

1. השתמש כל DNAs ליניאריים הניתנים על ידי חברות מסחריות ישירות ללא טיהור נוסף.
2. Centrifuge דגימות ה-DNA ב 5000 g × במשך 5 דקות כדי לאסוף את כל כדורי ה-DNA בחלק התחתון של הצינורות. הוסף אמצעי אחסון המתאים טה מאגר (10 מ"מ טריס, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) כדי להמיס את ה-DNA.
3. למדוד את הריכוז של "a" ng/µL עבור כל הפתרונות ss-DNA בעזרת ספקטרומטר UV מיקרו של 260 ננומטר. להמיר ng/µL "a" "b" מיקרומטר בעקבות b = × 10³ / (לנטישה המשקל המולקולרי של ה-DNA). התאימו את כמות פתרון טה להפוך 10 מיקרומטר דנ א מניות פתרון.
4. השתמש T4 DNA ליגאז כדי לחבר את קצות 3' ו 5' 5'-phosphorylated ליניארית DNA תבניות ( איור 1) c64nt, c74nt, c84nt מסופקים ישירות של חברות מסחריות.
5. מערבבים את 5'-phosphorylated ליניארית נ (3.5 מיקרומטר) ו שלה המתאימים סד נ (4.5 מיקרומטר) במאגר טה µL 80 ב- 200 µL PCR מבחנה¹⁵. דגירה הצינור בבקבוק תרמו פתוח מלא במים 95 ° C. לקרר מים חמים לטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 2-3 שעות תחת האווירה במעבדה.
6. להוסיף µL 10 x T4 10 מאגר (660 מ"מ טריס-HCl, 66 מ מ MgCl₂, 100 מ מ DTT, ATP 1 מ מ), 10 µL של T4 ליגאז (300 U µL) לתערובת לאמצעי הסופי של µL 100. דגירה את התערובת בתוך thermocycler 16 שעות ב-16 ° c
   הערה: האמור לעיל DNA ריכוז ונפח התגובה של µL ~ 100 הממוטבות מצדו גבוהה ויעילות את התשואה גבוהה של cyclization הנכון oligo-מונומר. להפעיל צינורות שתיים או יותר של תגובות מצדו באותו הזמן על פי הנבחנים. הליך חלופי הדגירה מצדו מחליף שלב 1.6 הוא 4 שעות ב 25 º C.
7. לאחר הדגירה, בטל את ליגאז T4 במים 95 מעלות צלזיוס למשך 5 minminutes. לאחר מכן להעביר הצינור אמבט קרח מים, תקופת דגירה של 5 דקות להתקרר.
8. להוסיף 10 µL של 10 x אקסונוקלאז אני מאגר ו 10 µL של אקסונוקלאז אני (5 U µL) לתערובת quenched דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים למשך 30 דקות באופן סלקטיבי לעכל את DNAs ליניארית הנותרים ולעזוב את DNAs circularized ללא פגע.
9. הכינו 10% denaturing דף ג'ל.
   1. ללבוש כפפות גומי ומשקפת בעת הכנת את הג'ל דף בשכונה fume. להוסיף 2 מיליליטר 10 מ ל 6.67 של 30% (w/v) אקרילאמיד/bisacrylamide פתרון (19:1), x TAE· מאגר מ ג (40 מ"מ. טריס, 40 מ מ HAc, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0, 12.5 מ מ Mg(Ac)₂), 8.4 גר' אוריאה (ז 7) ומים יונים לאמצעי הסופי של 20 מ בשפופרת צנטרפוגה 40 מ.
      התראה: הפתרון אקרילאמיד/bisacrylamide פתרון (19:1) 30% (w/v) הוא רעיל.
   2. הוסף 20 µL של tetramethylethylenediamine (TEMED), µL 100 של קירור (APS, 10% w/v) 40 מ ל צינור לפני העברת הפתרון ג'ל אלקטרופורזה במערכת באופן מיידי. להוסיף 1.5 מ מ עבה עם המסרק 10-. טוב. יש להמתין לפחות 20 דקות עד הפתרון ג'ל פני השטח למוצק.
   3. הגדר מתח קבוע של 80 V עבור ג'ל של 85 × 80 × 1.5 מ מ³ (רוחב × גובה × עובי). להוסיף 1 x TAE· Mg מאגר מערכת אלקטרופורזה, prerun את הג'ל במשך 20 דקות ב V 10/ס.
10. . שימי את ה-PCR מ 1.8 שלב ב 95 ° C מים במשך 5 דקות כדי להשבית אקסונוקלאז אני. לאחר מכן להעביר הצינור אמבט קרח מים, תקופת דגירה של עוד 5 דקות.
11. להוסיף 20 µL של formamide בצינור נפח סופי של 140 µL ומערבבים את הפתרון. להפיץ את הפתרון 7-9 דף denaturing ג'ל בארות באותה מידה עם 16-20 µL עבור כל ג'ל טוב. לערבב 2 µL של טעינת צבען (0.05% bromophenol כחול, 0.05% קסילן cyanol FF, 60% גליצרול, 10 מ מ טריס-HCl, 60 מ מ EDTA, pH 7.6) עם µL 8 מ- DNA ליניארי קודמן המתאים (10 מיקרומטר) ולהזריק את התערובת עד לבאר נפרד לצורך סימוכין.
    הערה: התוספת של formamide היא להגביר את הצפיפות של הפתרון טעינה עבור לשקוע לקרקעית של הג'ל דף. ובכן, גם כדי לבטל שיוך של זוגיות קצת תקועים DNA משקעים.
12. להפעיל את הג'ל על 2 h 10 V/ס מ, תפסיק לרוץ כאשר קסילן cyanol FF הוא במיקום 2/3 של לוח הזכוכית בעין בלתי מזוינת.
13. ללבוש כפפות גומי ומשקפת כדי להגן על עור ועיניים. קח את הג'ל מתוך לוח הזכוכית. להניח את הג'ל על צלחת TLC (שכבה דקה כרומטוגרפיה) פלורסנט. לחתוך את הלהקות ג'ל היעד על ידי סכין גילוח בדיוק כמו מוצללת על ידי הקרנת UV (איור 2).
    התראה: האור האולטרה סגול מזיק לעיניים, עורות.
    הערה: תחת הקרנת UV-254 ננומטר, דנ א לקלוט את האור ואת הטל צל על צלחת TLC. ה-DNA מעגלי רץ לאט יותר המתאימים קודמן ליניארי ה-DNA שלו. כמה DNAs ליניארית מעוכל, לא רצויים מעגלית DNAs בכמויות קטנות אשר מקיפים את הלהקה היעד מוצלל תזהם את ה-DNA מעגלי אם הם נאספו.
14. העברת הלהקות ג'ל לתוך צינור microcentrifuge 2.0 mL. האוויר יבש או מכה יבשה הלהקות ג'ל, ואז מועכים את ג'לים לתוך עיסה באמצעות מרית או מוט זכוכית שעברו שיטוח. ודא שהג'ל נהרס לחלוטין לתוך עיסה, אשר הינה קריטית התשואה הגבוהה של ה-DNA מעגלי. הוסף פעמיים של ג'ל יונים נפח המים לתוך הצינור, לנער את הצינור בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
15. לסנן את התערובת כדי לאסוף את supernatants בשפופרת microcentrifuge 2.0 mL. לשחזר דנ שיורית על ידי שטיפה עם נפח קטן של מים יונים ומסנן שוב כדי לשלב את supernatants.
16. לחלץ את eluent עם נפח שווה של n-butanol. חזור על הליך זה עד האחסון מימית מופחתת לכ-200 µL.
17. להוסיף 500 µL של כוהל מוחלט (−20 ° C) ו 20 µL של NaOAc מ' 3 (pH 5.1) לתערובת עבור ה-DNA משקעים. אחסן את הצינורית על −20 ° C למשך 30 דקות.
18. Centrifuge את הצינור ב 12,000 g × 10 דקות ב 4 ° C, למחוק את תגובת שיקוע. התמיסה DNA הנותרים הוא כ-100 µL בצינור.
19. µL 600 של 75% אתנול (−20 ° C) להוסיף הצינור ואחסן אותו על −20 ° C למשך 30 דקות. ואז צנטריפוגה ב 12,000 × g 10 דקות ב 4 ° C, למחוק את תגובת שיקוע. התמיסה DNA הנותרים הוא פתרון µL כ-100 בצינור שוב. חזור על התהליך פעמיים.
20. לאחר צנטריפוגה אחרון, להשליך את תגובת שיקוע ככל האפשר. יבש את השאריות עם רכז ואקום.
21. מאגר ה-DNA מעגלי מטוהרים בצינור-−20 מעלות צלזיוס.
22. Resuspend ה-DNA מעגלי במאגר טה לעשות 10 מיקרומטר מעגלית דנ א מניות פתרון על פי שלב 1.3 בעת הצורך.

2. חישול של מכלול פתרונות

1. להכין סיר אחד חישול כל אריח או nanostructural הרכבה פתרון של c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt ו- acDAO-c64nt-E עם קבוצת DNAs ליניארית ולא עגול מעוצב.
   1. עבור כל הפתרונות הרכבה, לערבב 2 µL 10 x TAE· מאגר מ"ג, 1 µL של כל פתרון מניות ה-DNA של ערכה של גדילי לינארי, מעגלית שוויון יחסי טוחנת, המאגר הנוסף טה במבחנה 200 µL PCR כדי ריכוז סופי של גדיל אחד-0.5 מיקרומטר, נפח סופי של 20 µL. Anneal את הפתרון הרכבה ב תרמו בקבוק של 95 ° C עד 25 ° C מעל 48 שעות.
2. להכין כל פתרון הרכבה של 2D פומפיה אינסופי של cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E cDAO-c84nt-O עם סט מעוצב של DNAs ליניארית ועוד שני שלבים חישול.
   1. הכן קודמן אריח תת הרכבה פתרון על ידי ערבוב 2 µL 10 x TAE· מאגר מ"ג, 1 µL של כל פתרון מניות ה-DNA של ערכה של גדילי לינארי, מעגלית שוויון יחסי טוחנת, המאגר הנוסף טה במבחנה 200 µL PCR ריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר על גדיל אחד, נפח סופי של 20 µL. בשלב הראשון אריח תת מחזק, anneal כל פתרון אריח תת קודמן thermocycler ה-PCR באמצעות שיטת קירור מהיר לינארית מ 95 ° C עד 25 ° C מעל 2.5 h.
   2. להכין כל פתרון הרכבה של פומפיה אינסופי 4 לעיל על ידי ערבוב 10 µL של כל אחד שני פתרונות אריח המשנה המתאימה יחד כדי ריכוז סופי של 0.25 מיקרומטר על גדיל אחד. בסריג השני חישול שלב, anneal את התערובת 20 µL ב thermocycler PCR באמצעות שיטת קירור איטי של השוהים ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ולצינון בשיעור של 0.1 º C לכל 5 דקות כדי 20 ° C, כ- 24 שעות בסך הכל.
      הערה: שני ניסויים במקביל ניתן להפעיל בו זמנית או לאחר מכן בשלב השני מחזק עבור כל סריג אינסופי 2D.
3. היכונו שני שלבים חישול פתרונות הרכבה של שני מכלולים מלבן סופיים של 5 × 6 cDAO-c64nt-O ו 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O.
   1. הכן קודמן אריח תת הרכבה פתרון על ידי ערבוב µL 1 של 10 x TAE· מאגר Mg, 0.5 µL של כל פתרון מניות ה-DNA של ערכה של גדילי לינארי, מעגלית שוויון יחסי טוחנת, המאגר הנוסף טה במבחנה 200 µL PCR ריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר על גדיל אחד, נפח סופי של 10 µL. בשלב הראשון מחזק, anneal כל פתרון אריח תת קודמן thermocycler ה-PCR באמצעות שיטת קירור מהיר לינארית מ 95 ° C עד 25 ° C מעל 2.5 h.
   2. להכין מלבן סופיים סריג הרכבה פתרון על ידי ערבוב 32 x (2 µL של כל פתרון האריח משנה) ביחד במבחנה 200 µL PCR כדי ריכוז סופי של ~ 15 ננומטר ועבור כל אריח תת נפח סופי של 64 µL. בשלב השני מחזק, anneal את התערובת 64 µL ב thermocycler PCR באמצעות שיטת קירור איטי של השוהים ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, לצנן בשיעור של 0.1 º C כל 5 דקות עד 20 ° C, כ-24 שעות בסך הכל.
      הערה: חמישה ניסויים במקביל ניתן להפעיל בו זמנית או לאחר מכן בשלב השני מחזק להרכבה כל מלבן סופיים.

3. ניתוח דף

1. להכין דף יליד 10% בעקבות צעד 1.9 חוץ הרכיב אוריאה.
2. עבור דגימות הבקרה של c64bp, c84bp, להוסיף 2 µL של כל פתרון הרכבה µL 1 של טעינת לצבוע כדי µL 3 מאגר טה כפקדי בנפרד. לכל אחת הרכבות אחרות מופיע באיור3, להוסיף 1 µL של כל פתרון הרכבה µL 1 של טעינת לצבוע כדי 4 µL טה מאגר.
3. להזריק כל אחד הפתרונות שלעיל כדי ג'ל טוב. להוסיף 5 µL של סמן הדנ א (25-500 bp) באר נפרד לצורך סימוכין.
4. הפעל את הג'ל במשך כ 4 שעות ב 10 V ס באמבט מי קרח. Cyanol קסילן FF יפעל מתוך לוח הזכוכית.
5. ללבוש כפפות גומי ומשקפת כדי להגן על עור ועיניים. קח את הג'ל מתוך לוח הזכוכית, לטבול אותו ב- 100 מ של מים יונים עם 10 µL של כתם ג'ל חומצת גרעין למשך 30 דקות.
   התראה: הפתרון הכתם חומצת גרעין ג'ל הוא רעיל.
6. לצפות את הג'ל תחת UV מערכת הדמיה, לצלם תמונה של הג'ל ויטראז'ים (איור 3).

4. טיהור של סורגים סופיים

1. להכין יליד agarose 2% ג'ל אלקטרופורזה טיהור של סורגים סופיים.
   1. לערבב 1 גר' אבקת agarose, 5 מיליליטר 10 x TBE· מאגר מ ג (89 מ"מ. טריס, 89 מ"מ פנמיות, 2 מ מ EDTA, pH 8.0, 12.5 מ מ Mg(Ac)₂), 2 µL של חומצות גרעין ג'ל כתם של 47.5 מ ל מים יונים בבקבוק 250 מ ל משולש. מרתיחים את התערובת עד הבועות הופכים קטן וצפוף. להוסיף מים חמים בתוך הבקבוק הנפח הכולל של 50 מ ל וריכוז של 2% agarose.
   2. ללבוש כפפות עבות. יוצקים את הפתרון ג'ל לתוך קופסת פלסטיק ג'ל של 7 x 10 x 1 ס מ³ (רוחב אורך × × עובי). הכנס מסרק סמיך, 12-ובכן ג'ל 1.5 מ מ. המתן הג'ל להתקרר לטמפרטורת החדר. במידת הצורך, לשים את הג'ל במקרר 4 ° C.
      התראה: להיות מודעים רותח כי הפתרון הוא חם מאוד.
   3. להוסיף 0.5 x TBE· מאגר מ ג של מערכת אלקטרופורזה. Prerun את הג'ל של 5 V/ס מ במשך 20 דקות באמבט מי קרח על מתח קבוע של 50 V.
   4. מזריקים µL 20 של הפתרון סופיים סריג מוכן בשלב 2.3 בג'ל agarose כל טוב ולהוסיף 5 µL של סמן הדנ א (100-3,000 bp) נפרד היטב. הפעל את הג'ל כבר שעתיים ב 5 V ס באמבט מי קרח.
   5. ללבוש כפפות גומי ומשקפת כדי להגן על עור ועיניים. גזור המטרה ג'ל להקות עם עמדה דומה דה מרקר bp 1,000 תחת אור UV ופרוסות אותם לתוך בסדר חלקים ולמקם את ג'לים כתוש לתוך עמודה מסנן⁸.
   6. Centrifuge את העמודה ב x 2,000 g למשך 5 דקות ב 4 º C. לחלץ את הפתרון מדגם באמצעות המדור. לאסוף את הפתרון עבור הדמיה AFM.
2. לטהר פומפיה סופית על ידי משקעים פג.
   1. מערבבים 50 µL של הפתרון סופיים סריג מוכן בשלב 2.3 עם אמצעי אחסון שווה של 15% PEG8000 (w/v) מאגר (20 מ"מ Mg(Ac)₂, 5 מ מ טריס, 1 מ"מ EDTA ו 505 מ"מ NaCl)²². Centrifuge הפתרון ב × 18,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   2. הסר את תגובת שיקוע והוסף µL 100 מאגר פג. חזור על צנטריפוגה.
   3. לאחר הסרת את תגובת שיקוע, לפזר את גלולה 1 x TAE· מאגר מ"ג עבור הדמיה AFM.
      הערה: טיהור הוא הכרחי עבור פומפיה סופיים של 5 × 6 cDAO-c64nt-O, 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O AFM הדמיה ויישומים אחרים. אם התשואה נמוכה מדי, להגדיל את מהירות צנטריפוגה. אם המוצר אינו טהור מספיק, חזור על שלב 4.2.2.

5. AFM הדמיה

1. ננו-חוט c64nt, ננו-חוט c84nt, acDAO-c64nt-E, פומפיה 2D אינסופי של cDAO-c64nt-E(O), cDAO-c84nt-E(O), להפקיד μL 2 מדגם annealed על משטח נציץ cleaved טרי. להשאיר למשך 2 דקות בשביל ספיחה של רשתות ה-DNA אל פני השטח נציץ. רוחצים את השטח עם 100 µL של מים יונים פעמיים את לייבש אותו על ידי אוויר דחוס.
2. להשיג AFM תמונות של סורגים DNA אינסופי באוויר על-ידי סריקת פני השטח נציץ עם הגששים AFM משולש תחת במצב הקשה. להגדיר את הפרמטרים הבאים עבור סריקה: סריקה בגודל של 0.5 ~ 5 מיקרומטר, לסרוק ברזולוציה של קווים 512, וסרוק בשיעור של 3.5 הרץ (איור 4).
3. עבור רשתות ה-DNA סופיים של 5 × 6 × cDAO-c64nt-O ו- 5 6 cDAO-c74 & c84nt-O, להפקיד µL 80 1 x TAE· מאגר מ ג על משטח נציץ cleaved טרי. µL 5 דוגמאות סופיים להוסיף למאגר. להשאיר למשך 2 דקות בשביל ספיחה של רשתות ה-DNA אל פני השטח נציץ. להוסיף עוד 50 µL 1 x TAE· מאגר מ ג על החללית AFM.
4. להשיג AFM תמונות של סורגים DNA סופיים בנוזל על-ידי סריקת פני השטח נציץ עם הגששים AFM משולש תחת במצב הקשה. להגדיר את הפרמטרים הבאים עבור סריקה: סריקה בגודל של 0.5-1 מיקרומטר, לסרוק ברזולוציה של 256 קווי, וסרוק בשיעור של 1.5 Hz (איור 5).

תוצאות

ה-DNA מעגלי נע לאט יותר ה-DNA ליניארי שלו קודמן denaturing דף (איור 2) כי הנקבובית את ה-dna מעגלי הוא שחדר, מפגר מאת ג'ל הסיבים^23,24,25. יעילות התגובה מצדו הנכון עבור oligo-מונומר cyclization תלוי המצע רצף, ריכוז, טמפרטורת התגובה, זמן, וכו '. כמו הריכוז של הקדמה DNA ליניארי גבוה מספיק מיקרומטר בסביבות 3.5, המוצרים cyclization של c64nt (או c84nt), ההתייחסות ק...

דיון

הפרוטוקולים הציג באופן זה דגש במאמר על הסינתזה של מולקולות DNA מעגלי קטנות, ההרכבה של דנ א nanostructures. רוב העיצובים DNA וסודרו באופן אקראי ניתן להשתמש בפרוטוקול זה. טוהר DNAs מעגלית היא קריטית להצלחת הרכבות ה-DNA. ניתן לשפר את התשואה הפקה של cyclization על-ידי הורדת הריכוז של DNA ליניארי 5'-phosphorylated; עם זאת, זה יהיה להגדיל את עומס העבודה כדי לייצר כמויות זהה של DNAs מעגלית. האורך של גדילי הדנ א סד משפיעה גם על התגובה הנכונה מצדו, זה ממוטבת כדי להיות בסביבות 20 נוקלאוטידים זמן הן c64nt והן c84nt.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
T4 ligase	TaKaRa	2011A
T4 buffer	TaKaRa	2011A
TE buffer	Sangon	B548106
Thermo Bottle		Thermos SK-3000
Thermo cycler	Bio Gener	GE4852T
Exonuclease I	TaKaRa	2650A
Exonuclease I buffer	TaKaRa	2650A
30% (w/v) תמיסת אקריל/ביס (19:1)	סנגון	B546016
TAE פרמיקס פודוור	סנגון	B540023
Mg(Ac)2· 4H2O	נאנג'ינג מגיב כימי	C0190550223
אוריאה	סנגון	A510907
TEMED	BBI	A100761
אמוניום פרסולפט	נאנג'ינג מגיב כימי	13041920295
ספק כוח	בייג'ינג Liuyi	DYY-8C
אמבט מים	Sumsung	DK-S12
פורממיד	סמן	BBI A100314
(25~500 bp)	B600303		סנגון
(100~3000 bp)	מאגר	B500347
	סנגון	B548313
PAGE מערכת אלקטרופורזה	בייג'ינג Liuyi	24DN
מסנן	ASD	5010-2225	0.22 & מיקרו; מערכת
הדמיית UV	M Tanon	2500R
n-butanol	Sangon	A501800
אתנול מוחלט	SCR	10009257
NaOAc	Nanjing מגיב כימי	12032610459
צנטריפוגה	אפנדורף	5424R
רכז ואקום	CHRIST	RVC 2-18
ספקטרום אולטרה סגול	Allsheng	Nano-100
כתם חומצת גרעין	Biotium	16G1010	GelRed
Agarose	Biowest	G-10
Agarose electrophoresis systerm	Beijing Liuyi	DYCP-31CN
צלחת חימום	ג'יאנגסו ג'ינטאן	DB-1
TBE premix podwer	B540024		סנגון
	Bio-Rad	7326165	Freeze 'N עמודת סחיטה
AFM	Bruker	Dimension FastScan
PEG8000	BBI	A100159
Mica	Ted Pella	BP50
משולש AFM בדיקה באוויר	Bruker	FastScan-C
משולש AFM בדיקה ב פוליד	Bruker	ScanAsyst-fluid+
DNA Strands	Sangon