מאמר שיטה

ההתרחבות של דו-מימד Electrospun Nanofiber מחצלות שלוש-מימד פיגומים

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/58918

⸱

7 בינואר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מדגים את הטכניקה של הרחבת שטיחון nanofiber המסורתי, נמצא תחת ניהול דו-מימד (2D) electrospun לתוך גרדום (3D) 3-מימד דרך ירידת נוזלים2 CO subcritical. פיגומים אלו רבודה תלת-ממד, רמזים nanotopographic הסלולר מחקים מקרוב, לשמר את הפונקציות של מולקולות וחיסונים אנקפסולציה בתוך nanofibers.

תקציר

Electrospinning כבר הטכנולוגיה המועדפת בהפקת לפיגום סינתטי, פונקציונלי בשל ביומימטיקה מטריצה חוץ-תאית, הפקד נוחות של הרכב, מבנה בקוטר של סיבים. עם זאת, למרות היתרונות הללו, nanofiber electrospun מסורתיים פיגומים באים עם מגבלות כולל מאורגן nanofiber התמצאות, נקבוביות נמוכה, גודל הנקבוביות קטן ו מחצלות בעיקר דו מימדי. בתור שכזה, יש צורך גדול לפיתוח תהליך חדש עבור בדיית פיגומים nanofiber electrospun זה יכול להתגבר על המגבלות הנ. במסמך זה, התווה שיטה פשוטה הרומן. מזרן nanofiber דו-ממדית מסורתית הופכת לפיגום 3D עם עובי הרצוי, המרחק, נקבוביות nanotopographic רמזים כדי לאפשר תא זריעה והתפשטות דרך ירידת נוזלים2 CO subcritical. בנוסף עשו איתו התחדשות רקמות להתרחש, שיטה זו מספקת גם את ההזדמנות כדי לתמצת מולקולות ביו כגון פפטידים מיקרוביאלית למשלוח סמים מקומי. CO2 מורחבת nanofiber פיגומים החזק פוטנציאל התחדשות רקמות, ריפוי פצעים, מידול תלת-ממד רקמות ו תרופות אקטואלי.

מבוא

הרעיון של פיתוח לפיגום סינתטי, זה יכול להיות מושתל לתוך חולים כדי לסייע רקמות תיקון והתחדשות הוא זה יש חילחלו השדה רפואה רגנרטיבית במשך עשרות שנים. לגרדום סינטטי אידיאלי מגישה לזירוז נדידת תאים שבסביבה רקמה בריאה, מספקת ארכיטקטורה התא זריעה אדהזיה, איתות, התפשטות, בידול, תומך vascularization, מאפשר חמצון נאותה, תזונה משלוח, ומקדם את הפעילות החיסונית המארח כדי להבטיח הצלחה לאחר ההשתלה1. בנוסף, זה יכול לשמש כנשא להטבעת מולקולות מיקרוביאלית לסייע1,3,6,7,8,9ריפוי הפצע. היכולת לשלוט על שחרורו הזמני של מולקולות אלה ביולוגי מן לגרדום סינתטי הוא תכונה רצויה אחרת הנחשב מתי הנדסה פיגומים1.

Electrospinning כבר טכניקה היטב שימוש להפקת nanofiber פיגומים1,2,3,4,5,6. ניסיונות קודמים כדי ליצור לפיגום nanofiber כמו האחד והנכון עשו בדרגות שונות של הצלחה. עם זאת, nanofiber מסורתיים פיגומים מוגבלת יכולות כדי להשיג מטרות אלה. פיגומים nanofiber המסורתיים היו בעיקר מחצלות מימדי1,3. פיגומים אלו nonexpanded, בצפיפות מלאים גדלים הנקבובית קטן; זה מגביל תא הסתננות, הגירה, בידול כמו זה אינו מקדם סביבה די דומות לאלה שנמצאו ויוו8,7,1,9. מסיבה זו, הוקמו טכניקות חדשות של 3D electrospun nanofiber לגרדום הכנה לתקן את הפגמים הכרוכים שמגיעים עם מחצלות 2D nanofiber. טכניקות אלה לגרום פיגומים תלת-ממד; עם זאת, הם מוגבלת ישימות בשל שיטת ייצור הדורשים פתרונות מימית, ליופיליזציה הליכים. זה עיבוד תוצאות התפלגות אקראית nanofibers בלי הארגון מוגבלת, עובי נכונה, ו/או נקבוביות הרצוי כדי לספק הותאם nanotopographic נאותה הנחוצים נדידת תאים והתפשטות. גורמים אלה התוצאה הקודמת 3D electrospun פיגומים nanofiber חסרי נאותה חיקוי של חיים רקמות1,7,8,9.

ניסיונות מאוחרים יותר בפיתוח של לגרדום המורחב, 3D עם ביומימטיקה טוב יותר של מטריצה חוץ-תאית (ECM) בוצעו באמצעות טיפול פתרון המימית סודיום borohydride (NaBH4) בתבניות מוגדרות מראש כדי לסייע שליטה טובה יותר של צורת וכתוצאה מכך לגרדום7,8. עם זאת, שיטה זו אינה האידיאלי כפי שהוא דורש את השימוש של פתרונות מימית, תגובות כימיות ליופיליזציה שעלולות לפגוע פולימרים כל מולקולות שעברו אנקפסולציה שאינם מסיסים במים. ותוספים עלול לגרום גם לתופעות לוואי במהלך8,התחדשות רקמות9. השיטה הרחבה2 CO שתואר במאמר זה מאוד מפחית את זמן העיבוד, מבטלת את הצורך פתרונות מימית, ושומר את הכמות ואת הפונקציונליות של מולקולות פעילים ביולוגית במידה רבה יותר מאשר בעבר הקים שיטות9.

מחקרים קודמים, אנטיביוטיקה, כסף, 1α, 25 dihydroxyvitamin D3ו פפטיד מיקרוביאלית LL-37 היו נטען לתוך פיגומים nanofiber בנפרד, בשילוב לחקור את הפוטנציאל של פיגומים אלו לשחרר סוכנים סיוע נוספת ב9,10,12,13ריפוי הפצע. לצורך הדגמת שיטת nanofiber לגרדום הרחבה, Coumarine 6, הפלורסנט, ייטען לתוך לגרדום הטמון הטבעה לגרדום עם תרכובות שונות הרצוי. שיטה זו של ייצור לגרדום nanofiber המורחב בשיתוף עם מולקולות ביו במארז בעל פוטנציאל התחדשות רקמות, ריפוי פצעים, היצירה של רקמת תלת-ממד מודלים ו מסירת תרופות אקטואלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ויוו ההליכים המתוארים להלן אושרו על ידי ועדת IACUC במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.

1. מכינים את הפתרונות עבור Electrospinning רגיל

  1. שפופרת זכוכית 20 מ"ל, לפזר 2 גר' poly(ε-caprolactone) (PCL, Mw = 80 kDa) בתערובת ממס של דיכלורומתאן (DCM) ו- N, N-dimethylformamide (DMF) עם קצבה 4:1 (v/v)-ריכוז של 10% (w/v).
    התראה: ידית DCM ו DMF בשכונה מאוורר היטב כדי למנוע חשיפה האדים. אין לחשוף DCM חומרים פלסטיים.
  2. להכניס את מבחנה בתוך מסובב המעבדה עד הפתרון נעשה ברור. הפתרון יכול לערבב בין לילה.
  3. אם מתוך כוונה להטביע ביו חומרים כמו פפטידים או סמים לתוך לגרדום, ליצור פתרון נפרד, לאחסן בטמפרטורה 4 ° C עד מוכן לשימוש.
    1. הכינו את הפתרון הפלורסנט (50 מ"ג/מ"ל) באמצעות 20 מ של פתרון PCL.

2. להרכיב את המערכת Electrospinning (איור 1A)

  1. להוסיף את הפתרון PCL מזרק 20 מ עם מחט בוטה מד 21 המצורפת. ודא כי שם אין אוויר במזרק, אבובים המשויך.
  2. במקום תוף מסתובב פלדה עם האספן הקרקע 12 ס מ בקצה המחט.
  3. שימוש בקליפים התנין, להתחבר אספקת חשמל מתח גבוה זרם ישר (DC) המחט ולהבטיח כי האספן. היא מקורקעת.
    התראה: תמיד לבטל את אספקת החשמל לפני טיפול כל חומר המחובר.

3. Electrospinning

  1. עבור mL 20 בפתרון PCL, להגדיר את הפרמטרים של המשאבה מזרק כדלקמן: קוטר = 20.27 מ מ, קצב הזרימה = 0.5 mL/ה הסימון אם טיפות יוצרים בקצה המחט.
  2. אם שילוב של מולקולות ביו רצוי, להרכיב את המערכת כדי לאפשר electrospinning co-צירית (איור 1B). צור זרבובית קואקסיאליים מותאם אישית באמצעות מזרקים.
    הערה: חרירי כזה הינם גם זמינים מסחרית. שימו לב כי פתרון של צבע מוכן כדי לדמות את הוספת מולקולות כאלה.
    1. להכין פתרון 1% של הפלורסנט קומרין 6 במים. להוסיף 3 מ"ל של 1% לצבוע מזרק קטן. לחבר את המזרק הזרבובית קואקסיאליים אותו כפתרון PCL. שוב, ודא כי ישנם אין בועות אוויר.
    2. על הפתרון הזה 3 מ"ל, להגדיר את הפרמטרים של המשאבה מזרק כדלקמן: קוטר = 9.49 מ מ, קצב הזרימה = 0.02 נקודות mL/ה הסימון אם טיפות יוצרים בקצה המחט.
  3. החלת פוטנציאל חשמלי של 20 kV בין אספן הקרקע את spinneret (מחט בקוטר 22) ממוקם 20 ס מ בלבד spinneret. לאסוף מחצלות nanofiber מיושר תוף מסתובב ב-2000 סל ד. לאסוף מחצלות nanofiber PCL ברגע שיגיעו עובי של ~ 1 מ מ.

4. דור של PCL Nanofiber מחצלות עם חורים ערוכים.

  1. לפברק PCL nanofiber מחצלות.
    1. להמיס PCL חרוזים ב תערובת הממס המורכב DCM ו DMF עם יחס של 4:1(v/v)-ריכוז של 10% (PCL) (w/v). משאבה הפתרון PCL בספיקה של 0.7 מ ל/h באמצעות מזרק משאבה בזמן פוטנציאל של 20 kV מוחל בין spinneret (מחט 22-gage) וממוקם אספן מוארק 12 ס מ spinneret.
    2. לאסוף את הקרום nanofiber באמצעות תוף מסתובב עם מהירות סיבוב גדול מ 500 סל ד.
  2. לטבול מחצלות nanofiber PCL נוזלי N2 במשך 5 דקות (כלומר., להיות נוקשה). לשמור על מחצלות nanofiber PCL נוזלי N2 , אגרוף PCL nanofiber מחצלות עם אגרוף 0.5 מ מ קוטר.

5. הרחבת 2D Nanofiber מחצלות עם או בלי החורים ערוכים ויה Subcritical CO2 נוזל (איור 2).

  1. מניחים מחצלות nanofiber PCL חנקן נוזלי עבור 5 דקות וחותכים לריבועים 1 ס"מ על 1 ס"מ באמצעות מספריים כירורגיים חדה בזמן שקועים חנקן נוזלי כדי למנוע דפורמציה של הקצוות.
  2. מקום על המזרן לחתוך שפופרת צנטרפוגה 30 מ עם ~ 1 גר' קרח יבש. בחוזקה כובע המכסה ולאפשר קרח יבש להחלפה CO נוזלי2.
  3. לאחר שהנוזל הקימה בצינור, במהירות לשחרר את הלחץ על-ידי פתיחת הכיפה.
    התראה: להשתמש ציוד מגן תרמי מתאים בעת עבודה עם חנקן נוזלי וקרח יבש. אל תפתח את הצינור מווסת כלפי הפנים. הצינור צנטריפוגה לא אמור לשמש שוב ושוב.
  4. הסר ובדוק אם צוינו לגרדום פצפוצי מהצינור. הכנס לגרדום שפופרת צנטרפוגה חדש עם קרח יבש וחזור עד לעובי הרצוי מושגת. לחטא פיגומים nanofiber המורחב של-אתילן אוקסיד לפני הדגירה עם תאים.

6. אפיון Nanofiber המורחב פיגומים

  1. לאפיין את המורפולוגיה ואת המבנה של פיגומים nanofiber המורחב באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM).
    1. למקם את הדגימות עם דו-צדדית קלטת מוליך מתכתי הרבעה, מעיל עם פלטינה עבור 40 s באמצעות עם coater לרעוד. להוציא בגיל 40 מא.
    2. לבחון את הסיבים באמצעות SEM לפי מחקרים קודמים9. לאסוף את התמונות במתח מאיץ של 15 kV.
  2. לאפיין במבחנה שחרור ופרופילי אתריים של פפטידים שפורסמו.
    1. משקל 10 מ ג של ממברנות nanofiber לפני ואחרי ההרחבה CO2.
    2. לטבול את הדגימות במאגר PBS ולאסוף μL 10 של תגובת שיקוע בנקודות זמן שונות (0-28 ימים).
    3. השתמש Enzyme-Linked חיסונית Sorbent Assay (אליסה) קיט לכמת את הריכוז פפטיד LL-37 ב תגובת שיקוע שנאספו.
  3. בחן את תגובת ויוו , המארח הסתננות תאית.
    1. הכניסו את החולדות ספראג-Dawley (SD) 9 - בן שבועיים תא הרדמה, להתחבר איזופלוריין אדי, עזים ומתנגד העכברושים. העברת החולדות שולחן הניתוחים לאחר העכברושים להפוך הרדמה מלאה ללא רגשות. ללא הרף עזים ומתנגד החולדות באמצעות קונוס איזופלוריין-האף עם מכשיר אידוי במהלך הניתוח. לגלח את השיער של הגב של חולדה על ידי מכונת הגילוח של חיה ולחטא אותו עם יוד ואלכוהול קרצוף העור. צור תת עורית כיסים דרך חתכים 1.5 ס מ supraspinal אתרים-dorsum באמצעות אזמל.
    2. הכנס nanofiber מורחב אחד לגרדום (1.5 מ מעבה) לתוך הכיס תת עורית באמצעות פינצטה עבור כל החתך. סגור את החתך בעזרת מהדק.
    3. ב- 1, 2 ו- 4 שבועות, המתת חסד החולדות עם 95% CO2. בעדינות לנתח את explant ואת הרקמה שמסביב באמצעות מספריים כירורגיים. לפני ניתוח היסטולוגית, לטבול את הרקמה בפורמלין לפחות 3 ימים ולאחר מכן הטבע עם פרפין. אזור הרקמה עם מיקרוטום ולאחר מכן לבצע hematoxylin אאוזין (H & E), צביעת trichrome מאסון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היעילות של הרחבת electrospun דו-ממדית מסורתית nanofiber מחצלות לתוך פיגומים תלת-ממד באמצעות לחצים של נוזל2 CO subcritical הודגם בתפקידים שונים: העובי של פיגומים עלה מ 1 מ"מ כאשר מטופל-2.5 מ מ, 19.2 מ"מ עם אחד ושני CO2 טיפולים, בהתאמה (איור 3 א-ג). המאפיין נקבוביות-a של הארכיטקטורה קריטי עבור תא זריעה-גם הגדילה באופן התואם עובי מוגברת (איור 3C). נקבוביות פיגומים עלה מ 79.5% עבור לא מטופל מחצל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

להפוך electrospun דו-ממדית מסורתית nanofiber מחצלות המורחב פיגומים תלת-ממד באמצעות CO2 לחצים נחקר. Nanofiber דו-ממדית מסורתית מחצלות בהצלחה המורחב באמצעות subcritical נוזל2 CO. השלבים הקריטיים הם לפברק 2D nanofiber מחצלות תחת תנאי ממוטבת ואחתוך מחצלות ללא עיוות בקצוות (למשל., באמצעות מספריים כירורגיים). זה CO2-nanofiber המורחב פיגומים יש יתרונות רבים על מחצלות 2D המסורתי כולל מבני שכבות (איור 3 א-B), פחות אריזה צפיפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

מחברים מכריז שאין אין ניגוד אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של לאומי המכון כללי רפואי למדע (NIGMS) ב- NIH (20 P 2 GM103480-06 ו- 1R01GM123081 כדי J.X.), את הכספים אוטיס גלאבה קרן למחקר רפואי, NE LB606 ו אתחול הרפואי אוניברסיטת נברסקה מרכז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PolycaprolactoneSigma-Aldrich440744
N,N-DimethlyformamideFisher ChemicalD-199-1
DichloromethaneFisher ChemicalAC61093-1000
Coumarin 6Sigma-Aldrich546283
תוף פלדה מסתובבמותאם אישיתזה משמש כאספן במהלך אלקטרו-ספינינג.
משאבת מזרקפישר סיינטיפיק14-831-200ספינינג קואקסיאלי דורש שתי משאבות מזרק בודדות.
RevolverLab Net InternationalH5600מסובב מעבדה מתכוונן לערבוב פתרונות
מחט היפודרמית (27G x 1 1/2 אינץ')EXCELINT International Co26426זהו חלק מהדוגמה המוצגת בהתאמה אישית של נוזל קואקסיאלי המוצג.
מחט היפודרמית (21G x 1 1/2 אינץ')EXCELINT International Co26416זהו חלק מהדוגמה המוצגת בהתאמה אישית של נוזל קואקסיאלי המוצג.
ספק כוח DC במתח גבוהגמא מחקר מתח גבוהES30
סריקת מיקרוסקופ אלקטרוניםFEINova 2300
מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeissAxio Imager 2
LL 37 ELISA KitHycult BiotechHK321-02

מקורות

  1. Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
  2. Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626(2015).
  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
  5. Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
  7. Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
  8. Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
  9. Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
  10. Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
  11. Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
  12. Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
  13. Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
  14. Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CO2

מאמרים קשורים