Method Article

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

DOI:

10.3791/59035

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2Department of Soil, Water and Environmental Science, University of Arizona, 3Department of Earth Ocean and Atmospheric Sciences, Florida State University, 4Bruker Daltonics Inc., 5Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומר אורגני טבעי (NOM) מורכבת תערובת מורכבת מאוד אלפי תרכובות אורגניות שהוכיח עצמו, מבחינה היסטורית, קשה לאפיין. עם זאת, כדי להבין את הפקדים תרמודינמי, קינטי החממה הפקת גז (פחמן דו-חמצני [CO2] ו- [CH4] מתאן) הנובע הפירוק של NOM, אפיון מולקולרי ברמת בשילוב עם חיידקים פרוטאום ניתוח הכרחי. יתרה מזאת, אקלים ושינויים סביבתיים צפויים perturb הטבעיות, שעשוי להיות מעצבן לאינטרקציות מורכבות המשפיעים על אספקת מצעים חומר אורגני וגם מיקרואורגניזמים ביצוע העתקות. אפיון מולקולרי מפורט של חומר אורגני, מיקרוביאלי פרוטאומיקס, ואת המסלולים המרות שלפיו מפורקת חומר אורגני יהיה צורך לחזות את הכיוון ואת הגודל של ההשפעות של שינויים סביבתיים. מאמר זה מתאר קצב מתודולוגי אפיון מקיף מטבוליט דגימה בודדת על-ידי הזרקה ישירה פורייה המרה יון ציקלוטרון תהודה ספקטרומטר מסה (FTICR-MS), גז כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (GC-MS), תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטר מסה (LC-MS), וניתוח פרוטאומיקס. גישה זו גורמת dataset מצוייד במלואו, אשר משפר את אמון סטטיסטי עבור מסיקים מסלולים של פירוק חומר אורגני, ה-CO הנוצרת2 קצב ייצור4 CH, ואת התגובות ההפרעות הסביבה שלהם. במסמך זה אנו מציגים תוצאות החלת בשיטה זו NOM דגימות נאספו מ peatlands; עם זאת, הפרוטוקול חל דוגמה NOM (למשל, כבול, מיוער קרקעות, משקעים ימיים, וכו ').

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברחבי העולם, ביצות מוערך להכיל עמוד 529 של פחמן (C), בעיקר בתור C אורגני קבורה כבול פיקדונות1. כיום, peatlands כזה לשמש כיור C נטו, sequestering 29 y Tg ג-1 ב צפון אמריקה לבד1. עם זאת, הפרעה סביבתיים כגון ניקוז, שריפות, הבצורת בטמפרטורות חם ניתן להסיט את הכיור C הזה על-ידי הגברת פירוק חומר אורגני וכתוצאה מכך הפסדים C מוגבר באמצעות גז חממה (פחמן דו-חמצני [CO2] ו 1,לייצור מתאן [CH4])2. שינויי אקלים עשויים לתרום הפסד C אם הטמפרטורות חם או תנאים מייבש לעורר הפירוק C מהר יותר על-ידי מיקרואורגניזמים. לחלופין, טמפרטורות גבוהות י....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. רציפים הפקת חומר אורגני בקרקע, משקעים או כבול

  1. לאסוף את הקרקע, משקעים או כבול ויה גלעון ולחלק ליבות על-פי ההשערה הנבדקת (למשל, עומק). דוגמאות לחנות טפלון מצופה מכולות ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לפני ניתוח.
    הערה: כ- 25 מ ג ג יש צורך עבור פרוטוקול זה. עבור כבול (בדרך כלל 45% C), נדרש 50 מ"ג של כבול מיובשים. ייתכן שיהיה צורך כמויות גדולות יותר של דגימה עבור דגימות אורגניות נמוך כמו הרמות או מינרליים מיוערות קרקעות בהתאם C תוכן (עד 5 גרם). מאחר חילוץ עם ממיסים אורגניים ימשוך כל פוליאתילן גליקול (PEG) לתוך תמציות, אשר תהיה השפעה שלילית על יינון במהלך שלב 2.4, חשוב להימנע ומאפשר דגימות לפנות פלסטיק בשלב כלשהו במהלך איסוף, אחסון או חיל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו לבצע את הפרוטוקול המתואר ניתוח משלימים, בהשוואה כבול עם עומק לביצה S1 באתר אשוחית, Peatlands תגובה תחת שינוי סביבות (אשוחית) במינסוטה, ארה ב. תוצאות אלו מושווים לאלו שקיבלו והטראגי, הפן משוודיה הצפוני כדי להראות כמה אתרים עשויים להשתנות בפעילויות מטבוליט של אנזים. זיהינו אנזימים 3,312 בניתוח פרוטאומיקס. ניתוח של פעילות אנזימים עם עומק מגלה כי מספר אנזימים מסרב בחדות בין 15 ס מ 45 ס"מ לביצה אשוחית (איור 1).

בעוד התוצאות פרוטאומיקס מצביעות על אילו חלבונים באים ל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יחיד-התפוקה, זרם מצמידים במלואו ניתוח שימוש כדי לאפיין מטבוליטים, את פרוטאום מספק תובנות מסלולים מאת C איזה רכיבה על אופניים היא היווצרותן של מערכת אקולוגית מורכבת. אדמה, כבול הן מטריצות הטרוגנית, לכן, אחד הצעדים הקריטיים של שיטה זו מתרחשת בשלבים המוקדמים ביותר להבטיח כי ההתחלה כבול או אדמה החומר הוא מאוד הומוגנית. עדיף לטחון את הדגימה גם אגרגטים יכול להפחית את יעילות החילוץ. . זה בעיה מסוימת עבור צבורים ותנאי קרקעות עם C נמוך ואת התוכן מינרלים גבוהה שיחייבו את השימוש מטחנה נירוסטה הכדור כדי שלמאחה homogenize כי הטרוגניו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות ג'יי. פי Chanton במקום Kostka, קולטון ועותרת לקבלת סיוע עם איסוף דגימות כבול. חלקים של עבודה זו נערכו במעבדה סביבתיים מולקולרית מדעי, DOE Office של המשתמש מתקן מדעי בחסות את Office הביולוגיים ואת המחקר הסביבתי. PNNL מופעל על ידי Battelle על האלמונית תחת חוזה דה-AC05-76RL01830. עבודה זו נתמכה על ידי משרד האנרגיה האמריקני, משרד המדע, המחקר הביולוגי של משרד איכות הסביבה (מענקים: דה-AC05-00OR22725, דה-SC0004632, DESC0010580, דה-SC0012088 ו- DE-SC0014416).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מתוקסיאמין הידרוכלורידסיגמא אולדריץ'226904חומר נגזרת
5 מ"מ תהודה משולשת בדיקה קרה עמידה למלח ברוקר
עמוד GC נימי עמוד HP-5MS (30 מ' ופעמים; 0.25 מ"מ ופעמים; 0.25 μ m)מכשורAgilentAG19091S-433
עמוד היברידי משטח טעון פאזה הפוכה (3.0 מ"מ ופעמים; 150 מ"מ ופעמים; 1.7 μ m גודל חלקיקים)מכשורThermoFisher
2 מ"ל בקבוקוני זכוכיתVWR International46610-722בקבוקוני דגימה
אוטומטיים בקבוקוניםVWR International97055-324; 9467671בקבוקוני דגימה
כלורופורםVWR InternationalJT9174-3ממס
אתנולVWR InternationalBDH67002.400ממס
מתנולVWR InternationalBDH85681.400ממס
פירידיןVWR InternationalBDH67007.400ממס
2,2-דימתיל-2-סילפנטן-5-סולפונט-d6סיגמא אולדריץ'178837
חומצת שומן C8-C24 סטנדרטית C8-C24 מתיל אסטרסיגמא אולדריץ'CRM18918
N-מתיל-N- (טרימתילסיליל)טריפלואורואצטמידסיגמא אולדריץ'24589-78-4תקן
חומצה פולבית נהר סוואני תקןהאגודה הבינלאומית לחומרים הומיים2S101Fסטנדרטי
trimethylchlorosilaneסיגמא אולדריץ'89595פתרון
כוונוןתוכנת ניתוח Agilent
FTICR-MSBrukerCompass DataAnalysis 4.1
Formularity SoftwarePacific Northwest NationalLaboratory Formularityזמין להורדה בכתובת: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MSAgilent AgilentGC 7890A עם MSD 5975C
סופג מבוסס סיליקהPhenomenex (טורנס, קליפורניה)Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
צינור NMR 3 מ"מ 8 150 CS5VWR InternationalKT897820-0008NMR
ספקטרומטר תמ"ג 600 מגה-הרץ של Varian Direct Drive Varian Inovaכונן ישיר 600 מגה-הרץספקטרומטר NMR
Chenomx NMR Suite 8.3ChenomxChenomx NMR Suiteתוכנת NMR
כרומטוגרף נוזלי אולטרה ביצועים מיםAquity UPLC H כרומטוגרף נוזלי 
ספקטרומטר מסה Velos-ETD Orbitrap ThermoFisherThermo Scientific LTQ Orbitrap Velosספקטרומטר מסה 
מכשור סטנדרטי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
  2. Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone per....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Natural Organic MatterFTICR MS AnalysisGC MS AnalysisNMR SpectroscopyLC MS AnalysisProteomics AnalysisSequential ExtractionMPLEx ExtractionMetabolite CharacterizationPeatland Samples

Related Articles