הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

6.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59082

⸱

14 במרץ 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning, Beijing Center for Disease Prevention and Control/Beijing Center of Preventive Medicine Research, China, 2College of Computer Science and Technology, Qilu University of Technology(Shandong Academy of Sciences), China, 3Key Laboratory of Computational Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Collaborative Innovation Center for Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences-Max Planck Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, China, 4Beijing Key Laboratory of Environmental Toxicology, School of Public Health, Capital Medical University, China, 5School of Life Sciences, La Trobe University, Australia

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

שיטה כמותית פותחה כדי לזהות ולחזות את רעילות חריפה של כימיקלים על-ידי ניתוח באופן אוטומטי את פרופיל פנוטיפי של Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מתאר כיצד להתייחס תולעים עם כימיקלים בצלחת 384-ובכן, לכידת וידאו, לכמת פנוטיפים קשורים רעילות.

תקציר

החלת בדיקות רעילות של כימיקלים עילאיים הסדר, כגון עכברים או חולדות, היא גוזלת זמן יקר, בשל תוחלת החיים הארוכה שלהם בעיות תחזוקה. להיפך, תולעים נימיות Caenorhabditis elegans (C. elegans) יש יתרונות כדי שזה הבחירה האידיאלית לבדיקת רעילות: אורך קצר, טיפוח קל, יעיל רבייה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור אוטומטית פנוטיפי בניית פרופיל של C. elegans בצלחת 384-. טוב. תולעים נמטודות בתרבית בצלחת 384-טוב עם טיפול כימי ובינוניות נוזלי, קטעי וידאו נלקחים כל הבאר כדי לכמת את ההשפעה הכימית על תכונות תולעת 33. תוצאות ניסויית מדגימים כי התכונות פנוטיפ כימות ניתן לסווג לחזות רעילות חריפה על תרכובות כימיות שונות, ליצור רשימה עדיפות לבדיקות רעילות כימית מסורתי הערכת במודל של מכרסמים.

מבוא

עם התפתחות מהירה של תרכובות כימיות שהוחלה על הייצור התעשייתי ועל חיי היומיום של אנשים, חשוב ללמוד רעילות בדיקת מודלים כימיקלים. במקרים רבים, המודל החייתי מכרסמים הוא מועסק כדי להעריך את פוטנציאל רעילות של כימיקלים שונים על הבריאות. באופן כללי, הקביעה של ריכוזים קטלני (קרי, assayed 50% מנה קטלנית [LD50] של כימיקלים שונים) משמש כפרמטר מסורתי במודל מכרסם (עכברוש/עכבר) אין ויוו, וזה זמן רב ויקר מאוד. בנוסף, בשל הקטן, לחדד, או להחליף את העיקרון (3R) היא מרכזית בעלי חיים רווחה, אתיקה מקצועית, שיטות חדשות המאפשרות עבור ההחלפה של בעלי חיים גבוהים יותר הם בעלי ערך מחקר מדעי-1,-2,-3 . C. elegans הוא תולעים נימיות אל-אווירני עצמאי אשר היה מבודד מן הקרקע. זה כבר בשימוש נרחב כאורגניזם מחקר במעבדה בשל מאפייניו מועילים, כגון אורך קצר, טיפוח קל, יעיל רבייה. בנוסף, הרבה מסלולים ביולוגיים בסיסיים, כולל תהליכים פיזיולוגיים בסיסיים ותגובות הלחץ ב- C. elegans, נשמרים ב-6,5,4,יונקים גבוהה יותר7 , 8. כמה השוואות אנחנו ואחרים עשו, יש הקונקורדנציה טוב בין C. elegans רעילות רעילות שנצפתה מכרסמים9. כל זה הופך את C. elegans מודל טוב כדי לבדוק את השפעות רעילות כימית ויוו.

לאחרונה, מחקרים לכמת את התכונות פנוטיפי של C. elegans. התכונות ניתן לנתח את רעילות של כימיקלים2,3,10 , הזדקנות תולעים11. גם פיתחנו שיטה המשלבת תולעת נוזלי culturing מערכת, מערכת ניתוח התמונה, שבה התולעים הם בתרבית בצלחת 384-ובכן תחת טיפולים כימיים שונים12. טכניקה זו כמותיים פותחה לנתח באופן אוטומטי את הפרמטרים 33 של C. elegans לאחר 12-24 שעות של טיפול כימי בצלחת 384-ובכן עם המדיום הנוזלי. שלב במיקרוסקופ אוטומטי משמש עבור רכישת וידאו ניסיוני. קטעי וידאו מעובדות על-ידי תוכנית אישית מעוצבת, 33 תכונות הקשורות להתנהגות נע של התולעים הם לכמת. השיטה משמשת כדי לכמת את התולעת פנוטיפים תחת הטיפול של תרכובות 10. התוצאות מציגות כי רעילות שונים יכולים לשנות על הפנוטיפים של C. elegans. אלה פנוטיפים כימות יכול לשמש כדי לזהות ולחזות רעילות חריפה של תרכובות כימיות שונות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקל על תצפיות ועל כימות פנוטיפי של ניסויים עם C. elegans בתרבות נוזלי. שיטה זו שימושית עבור היישום של C. elegans הערכות רעילות כימית, פנוטיפ quantifications, אשר מסייעים לחזות רעילות חריפה של תרכובות כימיות שונות וליצור רשימת סדר העדיפויות עבור עוד יותר מסורתי בדיקות הערכת כמות רעילה במודל של מכרסמים. בנוסף, שיטה זו ניתן ליישם רעילות הקרנת ובדיקות של כימיקלים חדשים או המתחם ' זיהום הסוכן כתוסף מזון, תרכובות pharmacautical, סביבה אקסוגניים המתחם, וכן הלאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה חיה במרכז בייג'ינג למניעת מחלות ובקרה בסין.

1. הכנה כימי

  1. להשיג כימיקלים (טבלה 1 ו לטבלה של חומרים).
  2. לקבוע את המינון הגבוהים והנמוכים ביותר של כימיקלים בודדים ריכוז מינימלי של 100% הקטלניות (LC100, 24 שעות ביממה) ריכוז מרבי של 100% nonlethality (LC0, 24 שעות ביממה) כדי תולעים. השתמש דילולים לפחות שישה של הריכוז הגבוה ביותר (טבלה 1).
    הערה: לנהל את התולעת ראשוני lethality מבחן9 לחקור את LC100 ואת LC0 עבור כימי חדש, כדי לקבוע את המינון.
  3. לדלל כל כימית עם K-בינוני (טבלה של חומרים) 2 x הריכוז הדרוש. להשתמש K-בינוני כפקד כדי להשוות את השינוי פנוטיפ הנגרמת על ידי הכימיקלים.
    1. לדוגמה, להכין 7 הדרגתיות ריכוזי כלוריד קדמיום (CdCl2) (טבלה 1). להכין 2 x הפתרון מימית מרוכז הגבוהה (4.64 mg/mL), לפזר 92.8 מ ג של אבקת מוצק2 CdCl ב 8 מ ל K-בינוני ומלא עד 10 מ"ל לאחר האבקה פיזר באופן מלא. הכן את רמות ריכוז אחרים על ידי דילול עם K-בינוני.
  4. היכונו שמונה בארות מקבילים בכל ריכוז במעבר הצבע הכימי. כל טוב מכיל 50 µL של 2 x פתרון כימי. להכין לפחות שלוש קבוצות של שמונה בארות מקבילים של K-בינוני כפקדי (טבלה 2).
    הערה: בקצרה, נפח של 500 µL של 2 x הפתרון עובד הוא הכרחי עבור מנה אחת של כל חומר כימי.

2. תולעת הכנה

  1. להשיג פראי-סוג N2 תולעים וללחצים OP50 Escherichia coli מן מרכז הגנטיקה Caenorhabditis (CGC).
  2. להשיג תולעים L4 מסונכרן.
    1. לבחור מושבה בודדת של e. coli OP50 מהצלחת פס. גילוח ורחיצה כירורגית לחסן את המושבה ב- 100 מ ל מרק ליברות, לגדל את זה בן לילה ב 37 º C.
      הערה: הפתרון OP50 e. coli והיא עכשיו מוכנה זריעה ללוחות נמטודות צמיחה בינוני (NGM, טבלה של חומרים).
    2. שופכים NGM לתוך פלסטיק 90 מ מ צלחת פטרי. זרע בכל צלחת עם 300 µL של e. coli OP50 פתרון היום לאחר שמזג. דגירה N2 תולעים על לוחות NGM עם OP50 ב 20 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים עד רוב התולעים הגיעו לשלב למבוגרים.
    3. קציר תולעים gravid לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 15 מ"ל עם סטרילי H2O. תעזוב את התולעים להשתקע למשך לפחות 2 דקות, וארוקן את H2O ולהוסיף 5 מ של מאגר אקונומיקה (טבלה של חומרים).
    4. מערבולת הצינור במשך 5 דקות, לסובב את הצינור ב-30 s (ב x 1300 גרם) כדי הצניפה הביצים, ולמחוק את תגובת שיקוע.
    5. לרחוץ הביצים עם 5 מיליליטר סטרילי H2O ו מערבולת הצינור עבור צנטריפוגה ס' 5 הצינור 30 s (ב x 1300 גרם), הסר תגובת שיקוע של לשטוף שוב.
    6. פיפטה הביצים אל NGM חדש צלחת עם OP50. דגירה אותם ב- 20 ° C. לנטר את התולעים L1 המקווקו בבוקר שלמחרת; התולעים יגיע השלב L4 כ 40 h.
  3. לשטוף את התולעים L4 את צלחות פטרי 90 מ מ עם K-בינוני לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ. התאם את הריכוז של תולעים חיות ~ 40 לכל 100 µL של K-בינוני תחת stereomicroscope. להוסיף 50 µL (~ 20 תולעים) לבאר כל צלחת 384-. טוב. תולעים אלה מסונכרן (שלב L4) מוכנים לטיפול הבא על ידי כימיקלים.

3. טיפול כימי ואת לכידת וידאו

הערה: בצלחת 384-ובכן, תולעים (50 µL היטב כל) מטופלים עד שישה עד שבעה במינונים של חומר כימי בודדים (טבלה 1). להכין שמונה וולס מקבילים, שכל אחד מהם מכיל 50 µL של 2 x כימי פתרון עבור מדי מינון (בארות שמונה מלאים עם זהה כימית, ריכוז זהה, בטבלה 2). כל קטעי הווידאו נאספים באמצעות מצלמה דיגיטלית המחוברים במיקרוסקופ הפוכה (טבלה של חומרים). הניסוי טיפול כימי נמשך 24 שעות ביממה. אל תוסיף חיידקי מזון מכל קידוח במהלך הניסוי טיפול כימי 24 שעות ביממה.

  1. לפני הוספת הכימיקלים, הגדר את הצלחת 384-ובכן עם התולעים מסונכרן על הבמה אוטומטי ולקחת קטעי וידאו של כל טוב עם ההליך רכישה מתוכנת (7 מסגרות לשנייה עבור 2 s; שנדרש ~ 25 דקות לסרוק כל צלחת).
  2. להוסיף 50 µL של 2 x מניות כימי שהוכנו לפי סעיף 1 עבור כל טוב (טבלה 2). לקבוע את הזמן כנקודת 0 h.
  3. דגירה לצלחת 384-ובכן-20 ° C, נוצצים סל ד 80 ב שייקר אינקובטור.
  4. הסר את הלוחית של החממה, להעביר אותו שלב אוטומטי. קח קטעי וידאו של כל טוב של צלחת מלאה, ב- 12 h וב -24 שעות ביממה, כדי לבדוק על הפנוטיפים של התולעים עבור כל טיפול כימי מסוים ב- K-בינוני. כ 25 דקות נדרשות עבור מסך לוח אחד.

4. ניסוי עיבוד וידאו

הערה: תוכנית ניסויית וידאו ותמונות לעיבוד היה נכתב, ארוז. ניתן באופן חופשי להוריד (ראה טבלה של חומרים). וידאו ניסיוני מאוחסן בצורה של רצף מסגרות תמונות, רצף מסגרות וידאו מאוחסן בספריה מסוימת. התוכנית ניתן לזהות תולעים, לכמת פנוטיפים באופן אוטומטי.

  1. ממשק משתמש גרפי (GUI, איור 1), הוסף את הפרמטרים, כגון ספריית רצף מסגרות, את ספריית הפלט, הפרמטר גודל התולעת הפרמטר סף תנועה. לחץ על כפתור ניתוח תהליך תמונות ניסיוני.
    1. לחץ על הלחצן ' בחר ' כדי לבחור ספריית תמונות.
    2. הוסף את הספריה תוצאה האמצעי בממשק.
      הערה: תוצאות הביניים לכלול תמונות מקוטע. תוצאות הביניים אלה שימושיים. התצפית הויזואלית של תמונות מעובד.
    3. להוסיף את ספריית התוצאה הסופית בממשק.
    4. להוסיף את הפרמטר הגודל הממוצע תולעת בתיבת הטקסט של תולעת בגודל בממשק.
      הערה: הפרמטר הגודל המשמשים את הניסויים הוא 2,000.
    5. הוסף את הסף של יחס שהועברו בממשק.
      הערה: היחס שימוש בניסויים הוא 0.93.
    6. לחץ על כפתור ניתוח כדי להפעיל את העיבוד תמונה. לחץ על לחצן ' איפוס ' כדי לנקות את הפרמטרים הוסיף.
      הערה: קיימות תכונות 33 מוגדרת והיא לכמת לתולעים. כל הפנוטיפים מוגדר ממוינים לפי קטגוריות (המופיעה בטבלה 3). ניתן לכמת תכונות אלה מתמונות ניסיוני. השוואה כמותית בין כימיקלים שונים, אשר יש רעילות שונות, יכול להיעשות על-ידי השוואת תכונות אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בדקנו על הפנוטיפים של תולעים נחשפים ריכוזים שונים של כימיקלים יותר מ- 1012. במבחן, 33 תכונות שונות היו לכמת עבור כל תרכובת שלוש נקודות זמן (או 12 שעות, 24 שעות ביממה). בעבר, נעשתה השוואה בין מדריך ניתוח אוטומטי של assay תוחלת החיים11,12. זה assay, מצאנו כי כימיקלים וריכוזי יכול להשפיע על הפנוטיפים תולעת. סקירה כללית של שיטה זו מוצגת באיור2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היתרונות של C. elegans הובילו השימוש הגובר הרעלים9, הן עבור מחקרים מכניסטית וגישות ההקרנה תפוקה גבוהה. תפקיד מוגבר עבור C. elegans משלימים למערכות אחרות דגם במחקר רעילות הינו יוצא דופן בשנים האחרונות, במיוחד להערכה מהירה רעילות של כימיקלים חדשים. מאמר זה מספק וזמינותו החדש של תפוקה גבוהה, כמותיים הקרנת תולעת פנוטיפים בצלחת 384-טוב על זיהוי אוטומטי ועל הערכה של כמות רעילה. זה וזמינותו האידיאלי לבדיקת רעילות חריפה של כימיקלים בתוך 24 שעות, זה יכול להיות מיושם על רעילות subacute בדי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים CGC על מתבקשים לשלוח את C. elegans. עבודה זו נתמכה על ידי מפתח הלאומית למחקר פיתוח תוכנית של סין (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); קרן מדעי הטבע הלאומית של סין גרנט (#31401025, #81273108 #81641184), בריאות ההון מחקר ופיתוח של פרויקט מיוחד בבייג'ינג (#2011-1013-03), הקרן הפתיחה של בייג'ינג המעבדה מפתח של טוקסיקולוגיה סביבתית (# 2015HJDL03), בסיס מדעי הטבע מחוז שאנדונג, סין (ZR2017BF041).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-פרופנולסיגמא-אולדריץ'59300
צלחות 384 בארותתרום142761
אגרבקטו214010
אטרופין סולפטסיגמא-אולדריץ'PHL80892
אקונומיקה0.5 מ"ל של 10 מ' NaOH, 0.5 מ"ל של5% NaClO, 9 מ"ל של מים טהורים
במיוחד קדמיום כלורידסיגמא-אולדריץ'
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'21074
מצלמת CCDZeissAxioCam HRmמיקרוסקופיה Zeiss GmbH
כולסטרולסיגמא-אולדריץ'C8667
נחושת (II) סולפטסיגמא-אולדריץ'451657
אתנולסיגמא-אולדריץ'24105
אתילן גליקולSigma-Aldrich324558
גליצרולSigma-AldrichG5516
K-Medium3.04 גרם NaCl ו-2.39 גרם KCl ב-1 ליטר מים טהורים
במיוחד LB Broth 10  גרם/ליטר  טריפטון,  5  גרם/ליטר  שמרים  לחלץ,  5  גרם/ליטר  NaCl 
מגנזיום גופרתי heptahydrateSigma-Aldrich63140
NGM צלחת3 גרם NaCl, 17 גרם אופגר, 2.5 גרם פפטון ב-1 ליטר מים טהורים במיוחד, לאחר חיטוי מוסיפים 1 מ"ל כולסטרול (5 מ"ג/מ"ל באתנול), 1 מ"ל MgSO4 (1 מ'), 1 מ"ל CaCl2 (1 מ'), 25 מ"ל מאגר PPB
פפטוןבקטו211677
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'60130
אשלגן פוספט דו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'795496
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'795488
מאגר35.6 גרם של K2HPO4, 108.3 גרם של KH2PO4 בשייקר מים אולטרה-טהורים 1 ליטר
ZHICHENGZWY-200D
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'71382
נתרן פלואורידSigma-Aldrichs7920
נתרן הידרוקסידSigma-Aldrich71690
תמיסת נתרן היפוכלוריטSigma-Aldrich239305
הקישור של התוכניתhttps://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
טריפטוןSigma-AldrichT7293
תמצית שמריםSigma-Aldrichמיקרוסקופ אוטומטי Y1625
Zeiss ZeissAXIO Observer.Z1Zeiss microsco אוטומטי עם תוכנה קניינית Zen2012 ומצלמת התקן מצמד טעינה (CCD)
מאגר 202908 PPB

מקורות

  1. Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
  2. Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
  3. Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
  4. Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
  5. Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
  6. Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
  7. Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
  8. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
  9. Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
  10. Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259(2007).
  11. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  12. Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18(2018).
  13. Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
  14. Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
  15. Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

C elegans384High throughput Screening
וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.