מאמר שיטה

הערכה של הפרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural לאחר התמרה חושית עם רחם של פיתוח העכבר המוח ואת חוט השדרה

6.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59084

⸱

26 בפברואר 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroanatomy and Molecular Brain Research, Ruhr University Bochum, 2Central Animal Facility of the Medical Faculty, Ruhr University Bochum

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

השילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים התמרה חושית ברחם היא גישה חזקה ללמוד שינויים מורפולוגיים במוצא ultrastructure בסדר של מערכת העצבים במהלך הפיתוח. שיטה משולבת זו מאפשרת תובנות שינויים בפרטים מבניים שבבסיס והנוירולוגיה הפלסטית ביחס ייצוגן הטופוגרפי.

תקציר

המחקר הנוכחי משלב התמרה חושית ברחם במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) מכוון ניתוח morphometrical מדויק של פרמטרים ultrastructural במבנים הטופוגרפי חד משמעית מזוהה, מושפע חלבון עניין זה הוא הציג לתוך האורגניזם באמצעות העברה ויראלי. גישה משולבת זו מאפשר מעבר חלק מ macrostructural כדי ultrastructural זיהוי על ידי מפות ניווט הטופוגרפי הבאים באטלס רקמות. מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה של הרקמה בעם רחם-transduced חושף את ultrastructure בסדר של מורכב ואת הפרמטרים שלה פלסטיות, כגון אזורים בוטון סינפטית בחתך רוחב, מספר הסינפטיות, המיטוכונדריה בתוך פרופיל בוטון, האורך של קשרים סינפטיים, אזורים עצב בחתך רוחב, העובי של עטיפות המיאלין, המספר של מיאלין lamellae ואזורי בחתך רוחב של המיטוכונדריה פרופילים. הניתוח של פרמטרים אלה מגלה חיוני תובנות שינויים של ultrastructural פלסטיות באזורים של מערכת העצבים המושפעות על-ידי העברת ויראלי הבונה גנטי. שיטה משולבת זו לא ניתן להשתמש רק ללמוד על השפעה ישירה של מולקולות מהונדס גנטית ו/או סמים על פלסטיות עצביים אבל פותח גם את האפשרות ללמוד חילוץ ברחם פלסטיות עצביים (למשל, בהקשר של מחלות ניווניות).

מבוא

פוטון לא יכולים לחדור של דגימות רקמה ודק במיוחד בכיתה עומק של אלקטרון. זה מייחסת יתרונות שלא יסולא בפז TEM בלכידת ננומטר תמונות ברזולוציה של המבנים המרשימים לעומת טכניקות במיקרוסקופ אור. לדוגמה, TEM מאפשר החזיית תאיים organelles כגון המיטוכונדריה, melanosomes, סוגים שונים של הפרשה בגרגרים, microtubules, שמתרגם, cilia, microvilli, והצמתים המערכת (תא השטח מתמחה), בפרט synapses מערכת העצבים1,2,3,4. המטרה הכוללת של מתודולוגי במחקר הוא ההכרה ultrastructural של שינויים פלסטיות עצבית במהלך הפיתוח על הפרעה לפני הלידה על-ידי שילוב טכניקות המדינה-of-the-art של התמרה חושית ברחם, TEM. לשווק מקודד חלבונים עניין יש כבר transduced ברחם לתוך מערכת העצבים המרכזית5,6,7, כולל את חוט השדרה6. למשל, נעשה שימוש ברחם התמרה חושית בשילוב עם TEM לימוד ההשפעה של המולקולה אדהזיה תא L1 על למידה פלסטיות בעכברים חשוכת-L1, בפרט לגבי יחסי הגומלין בין L1 חלבונים גרעיניים קולטן מוטורית בנוירונים אסטרוציטומה7.

הניתוח של פרמטרים והנוירולוגיה הפלסטית דורש מידע מדויק על הלוקליזציה של האזורים הקטנים בתוך מערכת העצבים. לכן, זה מספיק כדי לתאר פרטים ultrastructural ונטיותיהם הטופוגרפי המדויק לגבי מבנים אחרים. במחקר הנוכחי, מוצגת שיטת הכנה ספציפיים מכוון החקירה נתונים היסטוריים של תחומים ברורים מורפולוגי המבוסס על אור והן מיקרוסקופ אלקטרונים. גישה זו משלבת מספר טכניקות של רקמות מניפולציה, החל ברחם התמרה חושית של העכבר המוח ואת חוט השדרה ואחריו יציבות זלוף, הטבעה-עובש, עיבוד הרקמה TEM. צעד חיוני כללה בין את ההטמעה, העיבוד של הרקמה עבור TEM הוא התיעוד של הרקמה, בטכניקה הפרעות השתקפות אור המאפשר מדויק microphotographic והגדלה נמוכה תיעוד רקמות דגימות8,9,10. טכניקה זו שולבו הגישה הנוכחית, מאפשר לחוקרים לבחון פרטים הטופוגרפי ומבניים של רקמות עצבים משטחים ושל הדגימה פרופילים פרוסה לפני שלהם לקראת TEM.

מסגרת מיוחדת עבור חלוקתה המוח כולו מתאים קואורדינטות stereotaxic. מסגרת זו מועילה מורפולוגי תלת מימדי (3D) בבניה מחדש של אזורי ברקמות עצבים, והוא יכול לשמש לניתוח morphometric. Macrographs הסעיפים מטמיעים מוקצים קואורדינטות הטופוגרפי, ולבנות הסעיפים ממוספרים באופן סדרתי מפות אטלס רקמות.

לאחר שרף עיבוד, הרקמה מוטבע הוא למחלקה למקטעים זגוגית (< 70 ננומטר) המכילים אזורים נבחרים, לפי המפות של הרי האטלס הרקמות הנ ל. הסעיפים זגוגית ותוחלת TEM להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של פלסטיות פרמטרים (למשל, חתך פרופיל תחומי עם העיתון ons סינפטית או סיבי עצב) של התוכן שלהם ושל אנשי קשר למבנים הסמוכים בתוך המתחם מורכב.

בשיטת המתוארים בזאת, חלקה המעבר macrostructures מטמיעים מיקרו - ו nanostructures היתרי השוואתי מעמיק של פלסטיות מורפולוגית עצביים לאחר בתוך הרחם התמרה חושית לפתח לחוצה מערכת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדות האתיקה בעלי חיים מוסדיים של הברית הפדרלית של המבורג, Nordrhein-Westfalen, גרמניה.  השתמש בכלים סטריליים, כפפות מגן ומעילים aseptic לאורך כל תהליך כירורגי.

1. ב. פשוט תאכל התמרה חושית

  1. להכין וירוס adeno-הקשורים סוג 1 (AAV1) קידוד עבור היעד הרצוי (4 x 1011 ויראלי חלקיקים/µL של AAV1) בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב- pH 7.4. להוסיף 0.1 mg/µL מהר ירוק ולהשאיר את התערובת AAV1-מהיר-ירוק-37 מעלות צלזיוס.
  2. להכין טיפ נימי דק לצורה הרצויה (8 מ מ אורך, בקוטר חיצוני מיקרומטר 80 ו מבפנים בקוטר של 50 מיקרומטר), שימוש של פולר micropipette (הגדרות: לחץ = 500, חום = 700, משיכה = 0, מהירות = 80, זמן = 200, לראות את טבלה של חומרים < / c1 >). שבור את הקצה של נים כך שהוא 4-5 מ מ.
  3. להרכיב על צינור ליניקת (44 ס מ x 0.7 ס מ) עם קצה נימי, האחות µL 15 של תערובת AAV1-מהיר-ירוק לתוך נימי.
  4. לשמור על הנבדקים בעלי חיים בטמפרטורה קבועה הגוף הפיזיולוגיות של 37 מעלות צלזיוס לאורך ההליך כולו.
  5. למקם את עכבר C57Bl/6 בהריון (עובריים יום 14.5) אל החדר preincubation, עזים ומתנגד את העכבר עם גזי איזופלוריין 4% (עם קצב זרימת אוויר הנפחי של 0.6-0.8 L/min).
  6. . Subcutaneously, להזריק הבופרנורפין (0.1 mg/kg של משקל גוף).
  7. הנח את העכבר anesthetized בצלחת כירורגי prewarmed (37 מעלות צלזיוס).
  8. מכסים את העיניים עם חומר סיכה.
  9. להתאים את העכבר עם המסכה הרדמה (גזי איזופלוריין 1.5% בקצב זרימת אוויר הנפחי של 0.6-0.8 L/min) על צלחת כירורגי, לגלח האזור בעור בטן. יש לנגב את האזור מגולח עם 3 X 75% אתנול ולאחר מכן עם betadine פתרון.
    הערה: לפקח על אופן הפעולה של הנשימה של העכבר anesthetized ללא הרף. התאם את ריכוז הגז איזופלוריין על פי התבנית שאיפה-נשיפה של העכבר.
  10. בדוק היעדר רפלקס plantar לוחצת פרקי האצבעות כפת האחוריות של העכבר.
  11. פתיחת חלל הבטן לפי כשתפסת את העור עם איריס משונן מעוגל מלקחיים (10 ס מ) וחיתוך העור לאורך mediana לינאה במספריים ישר טונגסטן קרביד (10 ס מ), ולאחר מכן, על-ידי כשתפסת הקיר הצפק עם פינצטה דומונט ישר (12 ס מ, 0.2 מ מ x 0.12 מ"מ), חיתוך חומה לאורך לינאה אלבה עם ואנה ישר מספריים (8 ס"מ).
  12. מניחים חתיכת סרט פרפין fenestrated על פתיחת בטן ולתקן את הסרט בשני הקצוות עם מלקחיים hemostatic מיקרו-יתושים (12.5 ס מ, מעוקל).
  13. לחשוף את הקרניים הרחם באמצעות מכשיר דמוי כפית כדי למנוע פגיעה העוברים בתוך הרחם קרניים. לטפטף מספר טיפות של PBS (37 ° C) על קרנות הרחם ולבדוק את העוברים על נזקים או מומים בתוך השק. הרחם.
  14. תעד את ההזמנה ואת המיקום של העוברים הקרניים הרחם. להפוך את העוברים בזהירות בתוך השק. הרחם עד לתנוחה הרצויה עבור הזרקה.
  15. מזריקים µL 1-2 של תערובת AAV1-מהיר-ירוק על-ידי בדיקה חזותית של ההזרקה (למשל, החדרים במוח) וחדירת צבע תחת stereomicroscope.
  16. לתעד את העוברים מוזרק ולמקם את הקרניים הרחם עם העוברים מוזרק בחזרה לתוך חלל הבטן.
  17. לטפטף מספר טיפות של PBS (37 מעלות צלזיוס) לתוך חלל הבטן. לסגור את החלל על ידי תפירת הקיר הצפק (להשתמש פוליאמיד 6 0-בגודל של התפרים) ועור (להשתמש פוליאמיד 3 0-בגודל של התפרים), שימוש יתוש hemostatic מלקחיים של האלסטד (12.5 ס מ, מעוקל). לחלופין, השתמש דפוס קטע פשוט או תפר מפלדת/סיכות כדי לסגור את חלל הבטן של העור.

2. Telemacrophotography של רקמות מבודד

  1. הכנה של מאגרי
    1. להכין מאגר של Sörensen (1 ליטר) מאת g 14.95 הממיס של Na-2-HPO-4 ו- g 2.182פו ח'4 ב- 1 ליטר של מים מזוקקים תחת ערבוב במהירות של 200 סל ד. עבור זלוף של המנוח ההיריון הגורים ו/או כלבים. אחרי לידה פרקי זמן, להשתמש בגודל המתאים של מחטים להזרקה הבטן או intragastric ולוודא כי הריכוז של ההרדמה מסוף סודיום פנטוברביטל אינו עולה על 180 מ"ג / שוקלים ק ג של הגוף.
    2. להכין פתרון קיבוע של Mugnaini (5 L) על ידי חימום 500 מ"ל של מים מזוקקים עד 75 ° C, להוסיף 50 גר' אבקת paraformaldehyde תחת ערבוב ב 200 סל"ד, הוספת µL 200 של 5 N NaOH, הוספת מל 1,500 מאגר של Sörensen, 1,750 מ ל מים מזוקקים , ו- 500 מ"ל של 25% גלוטראלדהיד. למלא עד 5,000 מ ל מים מזוקקים. השתמש מאגר הסופי זלוף.
      הערה: להכין פתרון קיבוע של Mugnaini מתחת למכסה המנוע, משקפיים מגן ולהימנע האדים. להוסיף מתילן כחול (0.05 g/L) עבור ויזואליזציה טובה יותר של זלוף.
  2. בידוד זלוף ורקמות העכבר
    1. Transcardially perfuse העכברים בהריון שנושאים את העוברים transduced (במקרה של מחקרים העובר) או את הפאבים transduced נולד בגיל הרצוי (למשל, כמחנכת יום 24) על פי נהלי6,7, 11,12,13,14,15,16,17, שימוש בקרום הבטן פנטל מסוף הרדמה (200 mg/kg של משקל גוף).
    2. להזריק את transcardially עכברים עם הפרין פתרון (500 U) באמצעות G 26, 1 המחט ו, לפני קיבוע, להשרות העכברים transcardially עם 10 מ"ל של PBS כדי לשטוף את הדם מן הגוף, perfuse אותם transcardially עם 30 מ של 40 ° C prewarmed Mugnaini קיבוע פתרון.
      הערה: עבור עכברים בוגרים, לבצע זלוף רטרוגרדית חלופית של דרך העורק14.
    3. לבודד את הרקמה perfused עניין (למשל, כל המוח או חוט השדרה), postfix הרקמה לפחות 10 מ"ל של פתרון קיבוע של Mugnaini עוד 24 שעות-4 מעלות צלזיוס.
    4. לשטוף את הרקמה ב 10 מ"ל של PBS עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר.
  3. הטבעה agarose, בתוספת התיעוד ואת חלוקתה
    1. התאם את הרקמה מבודד (למשל, כל המוח) בתוך מסגרת מיוחדת עם לשחזור אופטים זווית8,9,10. לחלופין, להשתמש vibratome עם עובי חיתוך מתכווננת.
    2. המקום רקמת העצבים במסגרת, להתאים את הרקמה עבור telemacrography, ולתעד את נקודות הציון.
    3. להכין 3% התכה נמוכה הטבעה agarose בינוני: מוסיפים 3 גר' agarose 100 מ של המאגר של Sörensen, מחממים את התערובת בתוך אמבט מים עד 90 מעלות צלזיוס.
    4. יוצקים 3% agarose (30 ° C) בתוך המסגרת הכוללת את הרקמה. מכסה את המסגרת עם גוש מתכת חמה, המתן עד התקשות. במהלך התקשות, להשתמש telemacrographic המכשירים לשיקוף הרקמה מוטבע והקואורדינטות שלה בתוך המסגרת.
    5. העבר את הרקמה agarose-מוטבע לתוך מסגרת חיתוך פערים התואם הקואורדינטות של המסגרת הראשונה.
    6. לחתוך את הרקמה מוטבע למקטעים של עובי הרצוי (למשל, כ- 1.5 מ מ) עם מכשיר עם תער דק וקל רוטטת (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: כדי לשפר את הדאייה. הסכין גילוח, לטפטף כמה טיפות גליצרין אל הרקמה מוטבעים.
    7. תמונה בכל קטע רקמה של PBS ולאסוף את התמונות לתוך תיקיה.

3. הכנה של רקמה מבודדת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

הערה: בצע שלבים נוספים של דגירה במנות זכוכית עם מכסים closable בחוזקה על פלטפורמה חזק מתחת למכסה המנוע.

  1. לשטוף את קטעי רקמה 2 x 30 דקות ב- PBS. דגירה הסעיפים בתמיסה מימית אוסמיום ארבע-חמצני 2% (OsO4) עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    התראה: אוסמיום ארבע-חמצני רעיל, שעשויות להזיק יותר. כשזה מגיע במגע עם העור.
  2. לשטוף את הסעיפים osmicated 2 x 30 דקות ב- PBS.
  3. דגירה בסעיפים 30%, 50% ו- 70% אתנול בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות (אופציונלי: דגירה 70% אתנול ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה).
  4. תמונת דגימות osmicated 70% אתנול תחת LED RGB אור8,9,10 (2 x 15 W) חלה על המדגם שמאל, צד ימין בזווית של 45 °. השתמש מנות שחור רקע שחור משעמם כדי למזער את הפיזור ואת את השתקפות האור בזמן תאורה.
    התראה: אל תאפשר את המקטע להתייבש במהלך דימות.
  5. צור אטלס של תמונות סעיף עם נקודות הציון על ידי איסוף תמונות בסדרה בתיקיה.
  6. דגירה דגימות ב 100% אתנול (2 x במשך 30 דקות) ו 100% פרופילן אוקסיד (2 x במשך 30 דקות) בטמפרטורת החדר.
    התראה: אל תאפשר הסעיפים להתייבש בזמן שינוי פתרונות.
  7. מערבבים 260 מ של שרף עם 240 מיליליטר אנהידריד dodecenylsuccinic בתוך כלי זכוכית תוך ערבוב בעדינות עם בר זכוכית. בדוק מעת לעת inhomogeneity, בועות, מריחות. מאוד בעדינות, מערבבים ביד למשך לפחות 45 דקות.
  8. להכין שרף/פרופילן אוקסיד על יחס של 1:2 ו- 1:1, הוספת מאיץ 3% (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).
  9. דגירה הרקמה 1:2 הטמעת הפתרון משלב 3.8 כבר שעתיים ולאחר מכן בפתרון ההטבעה 1:1 מ שלב 3.8 כבר שעתיים בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב.
  10. למקם את הרקמה במנות במול פוליפרופילן, לכסות את הרקמה עם שרף טריים המכיל 3% מאיץ, לרפא את הרקמה מוטבעים ב- 65-85 מעלות צלזיוס במשך 12-24 שעות.
  11. לקרר את הרקמה מוטבע לטמפרטורת החדר דגימות שרף-מוטבע ולהסיר הכלים פוליפרופילן.

4. בחירת והנוירולוגיה הפלסטית Ultrastructural פרמטרים עבור ניתוח כמותי

  1. מיפוי האזור עניין
    1. לבחור אזור התעניינות (למשל, ההיפוקמפוס או המוח הקטן), בתרגום האזור בהרי האטלס מקטע על-ידי בחירת התמונה של הרי האטלס (שלב 3.5) המכיל את האזור הזה.
    2. לשרטט את גבולות האזור של ריבית על גבי התמונה סעיף ו חפש להרכיב אלה גבולות אזור על גבי הדגימה שרף.
    3. שריטה-מארק לגבולות האזור של ריבית (למשל, ההיפוקמפוס או המוח הקטן) על הדגימה שרף, באמצעות מחט בסדר לאמוד (26 G, מס ' 1).
    4. מחממים את הדגימה שרף עד 85 מעלות צלזיוס בתנור כדי לרכך את השרף עבור חיתוך או, לחלופין, להשתמש מכשיר חיתוך, להב דק או נייר זכוכית.
    5. לסלק את תחום העניין מן הדגימה שרף עם סכין גילוח (ראה טבלה של חומרים). הר הדגימה בהחזקת פסי זכוכית אקרילית של הענק נדרשת, למשל עם (בקוטר של 8 מ מ), באורך של 1 ס מ עם דבק. חתוך את הדגימה הנטען עבור חצי ואת חלוקתה ודק במיוחד.
    6. הכנת semithin (0.75 מיקרומטר) ו ודק במיוחד (70 ננומטר) מקטעים של האזור המקוצץ באמצעות ultramicrotome של: להגדיר אותו ב- 1.5 מ מ/s עבור עובי 0.75 מיקרומטר וב -0.7 מ מ/s עבור 70 עובי ננומטר.
    7. לאסוף את הסעיפים semithin על זכוכית נשאים, כתם הסעיפים עם 1% טולדין כחולה ב- PBS (עבור 4 דקות).
    8. לשטוף את המקטעים מספר פעמים במים יונים. לבחון את החלקים המוכתמים במיקרוסקופ אור באמצעות 4 x (נה של 0.1 ∞ /-), 10 x (NA של 0.22 ∞/0.17), 40 x (NA של 0.65 ∞/0.17), ו- 100 x (NA של 1.25 ∞/0.17) מטרות.
    9. איסוף מקטעים ודק במיוחד על רשתות ניקל. נושא הרשתות TEM ב 180 kV ו- 3, 200 x, 6, 000 x, ו/או 8,000 x הגדלה.
  2. ניתוח TEM
    1. לבחור את הפרמטרים ultrastructural עניין לניתוח TEM כמותית (עם העיתון ons, למשל עם שלפוחית, המיטוכונדריה או אקסונים ו ו nonmyelinated), TEM תמונות של פרמטרים אלה מתחת לגיל 3, 500 x, 6,000 x ו/או 8,000 x הגדלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הרדמה מהיר ואמין של עכברים, בטיחות פרמטרים רבים נחשבו, סביבת העבודה של אופטימיזציה של יחידת הרדמה התבררה נאותה (איור 1א'). יחידת נועד לשלוט התערובת של איזופלוריין נוזלי, אויר עם דיוק הנדרש לניתוח מוצלח-חיים קטנים, כגון עכברים וחולדות. אוויר, איזופלוריין מעורב מאדה את בהתאם להגדרות הרצויות, נמסר לתוך תיבת או דרך מסיכה החיה (איור 1א'). נבלה אוספת ולא חלבונית כל גז איזופלוריין עודפים עשויים להיווצר,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

צעד מכריע של התמרה חושית ברחם הוא ההליך הזרקה. הזרקה מדויקת לתוך המוח החדרים או תחום התעניינות נוסף דורש ניסיון ומיומנות מעשית. רזה הטיפ microcapillary, הנזק רקמות עלולות להתרחש; עם זאת, זה על חשבון הגדלת הזרקה בלחץ. בניגוד אלקטרופורציה ברחם19,20,21,22, שיעור ההישרדות של העוברים מוזרק לאחר התמרה חושית ברחם היא גבוהה מאוד. יכול להיות מוזרק כל העוברים של ' קרן ' הרחם, גם אם העוברים ממוקמים בלב לי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים תודה העמיתים של המתקן בעלי חיים בפקולטה לרפואה, אוניברסיטת הרוהר בוכום, תמיכה וטיפול החיה שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,4,6-Tris(dimethyl-aminomethyl)phenolServa36975
26 גרם x 1 אינץ' מחטHenke-Sass, Wolf GmbH
410 יחידת הרדמה למשאבת אווירמכשירים ביו-רפואיים (Univentor)8323102
סרוטיפ וירוס הקשור לאדנו 1 (AAV1)UKE (מתקן ליבה ויראלי)-להפניות ואזורי יעד של AAV1 ראה: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ וגם: וקטורי העברת גנים מעצבים: הנדסה מולקולרית ואבולוציה של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו-קשורה להעברת גנים משופרת. קוון אני, שאפר DV. Pharm Res. 2008 מרץ; 25(3):489-99. וקטורים נגיפיים רקומביננטיים AAV פסאודוטיפ עם קפסידים נגיפיים מסרוטיפים 1, 2 ו-5 מציגים יעילות דיפרנציאלית וטרופיזם תאים לאחר מסירה לאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית. בורגר C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. אוגוסט 2004; 10(2):302-17. וקטורים רקומביננטיים של נגיף אדנו-קשור (scAAV) משלימים את עצמם מקדמים התמרה יעילה ללא תלות בסינתזת DNA. מקארתי DM, מונהאן PE, סמולסקי RJ. ג'ין תר. אוגוסט 2001; 8(16): 1248-54.
AgaroseSigma-AldrichA9414ג'ל נמוך agarose
משאבת אווירמכשירים ביו-רפואיים (Univentor)Eheim 100
AralditeCIBA-GEIGY23857.9שרף להטמעה של
מכלולי כוונון שואבSigma-AldrichA5177-5EA
מסכת נשימה עכבר מכשירים ביו-רפואיים אנודייז אלומיניום(Univentor)-
buprenorphineTemgesicampulesמשכך כאבים
נימיםScience-ProductsGB100TF-10עם מילוי
Dodecenylsuccinic anhydrideFluka44160
פינצטה Dumont (#3, 12 ס"מ, ישר, 0.2 x 0.12 מ"מ)FST11203-23
מכונת גילוח חשמליתפיליפס-
תפרי אתיקון (אתילון, 6-0 ו-3-0)לעיניים אתיקון-פוליאמיד
Bepanthene-Fast
GreenSigma-AldrichF7252להדמיה של נוזלים מוזרקים
מתג ניתוב גז 4/2מחברים מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)8433020
מלקחיים המוסטטיים נגד יתושים (12.5 ס"מ, ישר)FST13011-12
Heparin-NatriumRatiopharm25 000 I.E./5 מ"ל
קופסת אינדוקציה לעכברים
עם מכסה נע אופקית.
מידות פנימיות: LxBxH: 155 מ"מ x 115 מ"מ x 130 מ"מ.
עובי דופן: 6 מ"מ		מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)-
מלקחיים לקשתית (10 ס"מ, מעוקל, משונן)FST14007-14
מספריים לקשתית (11 ס"מ, ישר, טונגסטן קרביד)FST14501-14
Isofluran OP Tisch, מחומם חשמלית, sm
מידות חיצוניות: 257 מ"מ x110 מ"מ x 18 מ"מ.
אזור חימום: 190 מ"מ x 90 מ"מ
הסרת האיזופלורן הנמלט
מסכת הנשימה היא כלפי מטה בהתאם לתקנות
מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)-
isoflurane (Attane)JD רפואיהרדמה אינהלציה
נורות LED RGB נורותקמאוCLQS15RGBWנוריות 2 x 15 W
מיקרוסקופ אור בסיסי DM ELeica-4x(NA 0.1 ∞/-), 10x (NA 0.22 ∞/0.17), 40x (NA 0.65 ∞/0.17), 100x (NA 1.25 ∞/0.17) מטרות
חולץ מיקרופיפטותScience-ProductsP-97
מלקחיים המוסטטיים נגד יתושים (12.5 ס"מ, מעוקל)FST13010-12
רשתות ניקל, 200 רשתטד פלה1GC200
אוסמיום (VIII)-חמצוןDegussa73219
תחמוצת פרופילןפלוקה82320
סכיני גילוחSchick87-10489
נתרן פנטוברביטל (נרקורן)Merial GmbH-
בקר טמפרטורה TC01mR 1-Channal עם משובמכשירים ביו-רפואיים (Univentor)-
Technovit 4004 דבק שני רכיביםKulzer
TelemacrodeviceCanon-CanonSpiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 מ"מ f/3.5-5.6 IS STM Objective, הארכה מתחת ל-150 מ"מ, צינור הארכה ידני טבעת 7 מ"מ, טבעת 14 מ"מ, טבעת 28 מ"מ, טבעת מאקרו הפוכה (58 מ"מ), מעמד צילום של Canon.
Thermopuller P-97SutterInstruments-מכשיר
סכין גילוח רוטט דקKrup-withSzabo להבים דקים
כחול טולואידיןSigma-Aldrich89640
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור C20Phillips-עד200 קילו וולט
Tygon 6/4 חומר צינורות לחיבור כל החלקים
קוטר חיצוני: 6 מ"מ
קוטר פנימי: 4 מ"מ
Wa
ll עובי: 1 מ"מ		מכשירים ביו-רפואיים (Univentor)-
Ultracut EReichert-Jung-ultramicrotome
Univentor Scavengerמכשירים ביו-רפואיים (Univentor)8338001
מספריים Vannas (8 ס"מ, ישר)FST15009-08
רקמות חומר סיכה

מקורות

  1. Blackstad, T. W., Kjaerheim, A. Special axo-dendritic synapses in the hippocampal cortex: electron and light microscopic studies on the layer of mossy fibers. Journal of Comparative. Neurology. 117, 133159(1961).
  2. Hamlyn, L. H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. Journal of Anatomy. 96, 112-120 (1962).
  3. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The Fine Structure of the Nervous System. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1991).
  4. Rollenhagen, A., et al. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses. Journal of Neuroscience. 27, 10434-10444 (2007).
  5. Lutz, D., et al. Myelin basic protein cleaves cell adhesion molecule L1 and promotes neuritogenesis and cell survival. Journal of Biological Chemistry. 289, 13503-13518 (2014).
  6. Lutz, D., et al. Myelin Basic Protein Cleaves Cell Adhesion Molecule L1 and Improves Regeneration After Injury. Molecular Neurobiology. 53, 3360-3376 (2016).
  7. Kraus, K., et al. A Fragment of Adhesion Molecule L1 Binds to Nuclear Receptors to Regulate Synaptic Plasticity and Motor Coordination. Molecular Neurobiology. 55, 7164-7178 (2018).
  8. Andres, K. H., von Düring, M. Interferenzphänomene am osmierten Präparat für die systematische elektronenmikroskopische Untersuchung. Mikroskopie. 30, 139(1974).
  9. Andres, K. H., von Düring, M. Interference phenomenon on somium tetroxide-fixed specimens for systematic electron microscopy. Principle and Techniques of Electron Microscopy: Biological Appliccations. Hayat, M. A. , Van Norstrand Reinhild. 246-261 (1997).
  10. Andres, K. H., von Düring, M. General Methods for Characterization of Brain Regions. Techniques in Neuroanatomical Research. Heym, C., Forssmann, W. -G. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 100-108 (1981).
  11. Palay, S. L., McGee-Russel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues or electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. Journal of Cell Biology. 12, 385-410 (1962).
  12. Webster, H. F., Collins, G. H. Comparison of osmium tetroxide and glutaraldehyde perfusion fixation for the electron microscopic study on the normal rat peripheral nervous system. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1, 109-126 (1964).
  13. Andres, K. H. Zur Methodik der Perfusionsfixierung des Zentralnervensystems von Säugern. Mikroskopie. 21, 169(1967).
  14. Forssmann, W. G., et al. Fixation par perfusion pour la microscopie électronique. Essai. De généralisation. Journal de Microscopie. 6, 279-304 (1967).
  15. Descarries, L., Schröder, J. M. Fixation du tissue nerveux par perfusion à grand debit. Journal de Microscopie. 7, 281-286 (1968).
  16. Langford, L. A., Coggeshall, R. E. The use of potassium ferricyanide in neural fixation. Anatomical Records. 197, 297-303 (1980).
  17. Liu, J., et al. Calretinin-positive L5a pyramidal neurons in the development of the paralemniscal pathway in the barrel cortex. Molecular Brain. 7, 84(2014).
  18. Lee, S. H., et al. Presenilins regulate synaptic plasticity and mitochondrial calcium homeostasis in the hippocampal mossy fiber pathway. Molecular Neurodegeneration. 12, 48(2017).
  19. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cerebral Cortex. , Suppl 1 120-125 (2009).
  20. dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960(2012).
  21. Nishiyama, J., et al. Selective and regulated gene expression in murine Purkinje cells by in utero electroporation. European Journal of Neuroscience. 36, 2867-2876 (2012).
  22. Takeo, Y. H., Kakegawa, W., Miura, E., Yuzaki, M. RORalpha regulates multiple aspects of dendrite development in cerebellar purkinje cells in vivo. Journal of Neuroscience. 35, 12518-12534 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים