מאמר שיטה

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

DOI:

10.3791/59128

⸱

12 בפברואר 2019

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר שיטה ישימה מיועד לשימוש עם תא תרבות supernatants לאתר epitopes משטח על שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EV). הוא מנצל immunoprecipitation EV ספציפי באמצעות חרוזים בשילוב עם נוגדנים מזהה אנטיגן פני שטח CD9, CD63, CD81. השיטה ממוטבים לניתוח cytometry במורד הזרם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometry זרימה (FC) היא שיטת הבחירה למדידה כמותית למחצה של סמני אנטיגן פני התא. לאחרונה, נעשה שימוש בטכניקה זו עבור ניתוחים פנוטיפי של שלפוחית חוץ-תאית (EV) כולל exosomes (מסכות) הדם ההיקפיים, נוזלי גוף אחרים. גודל קטן של EV מנדטים שימוש בכלים ייעודיים שיש סף גילוי סביב 50-100 ננומטר. לחלופין, EV יכולות להיות קשורות לטקס. גרגרי שניתן לאתר על ידי מועדון הכדורגל. . גרגרי, מצומדת עם נוגדנים מזהה EV-הקשורים סמני/אשכול של בידול CD63, CD9, CD81 יכול לשמש עבור EV לכידה. Exo מבודד ס מ ניתן לנתח עם או בלי העשרה מראש על-ידי ultracentrifugation. גישה זו מתאימה ניתוחים EV באמצעות מכשירים FC המקובלת. התוצאות שלנו להפגין מתאם ליניארי בין ערכי עוצמת קרינה פלואורסצנטית מתכוון (MFI) וריכוז EV. שיבוש EV דרך sonication באופן דרמטי ירד MFI, המציין כי השיטה אינו מזהה את קרום פסולת. . מדווחים שיטה מדויקת ואמינה עבור הניתוח של אנטיגנים משטח EV, אשר ניתן ליישם בקלות במעבדה כלשהי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים מפרישים חוץ-תאית שלפוחית (EV) בגדלים שונים, כולל שלפוחיות זעירות (MV) ו exosomes (מסכות). האחרון ניתן להבדיל בין MV גם בגודל וגם תא subcellular המקור. MV (200 – 1,000 ננומטר בגודל) משתחררים מתאי האב על ידי ששפך של קרום פלזמה. לעומת זאת, Exo (30-150 ננומטר) שמקורם ממברנות endosomal, משתחררים לחלל חוץ-תאית, כאשר הגופים multivesicular (MVB). להתמזג עם קרום התא1,2.

EV יותר ויותר משמש האבחון סמנים ביולוגיים כמו גם, באופן פוטנציאלי, כלים טיפוליים בתחומים רבים, לרבות אונקולוגיה, נוירולוגיה, קרדיולוגיה, מחלות שריר-שלד3,4,5. הרוב המכריע של מחקרים מתמשכת באמצעות EV כמו סוכני טיפולית לנצל את ניתוקה של שלפוחית מ תאים ממוזגים בינוני (ס מ) של תאים בתרבית במבחנה. גזע mesenchymal (MSCs) מפעילים השפעות מועילות בהקשרים מספר, MSC-derived EV הראו יתרונות במודלים של שריר הלב איסכמיה/פגיעה reperfusion פציעה6 ו במוח פציעה7. MSC-derived EV התערוכה גם המערכת החיסונית פעילויות modulatory, שעלולים להיות מנוצלים לרעה לטיפול הדחייה החיסונית, כפי שמתואר במודל של טיפול-חסיני אש שתל – מול – מארח מחלות8. תאי גזע נוזל מי השפיר (hAFS) להעשיר באופן פעיל ס מ עם MVs, מסכות, heterogeneously מופץ בגודלם (50 – 1,000 ננומטר), אשר לתווך מספר אפקטים ביולוגיים, כגון התפשטות של תאים, אנגיוגנזה, עיכוב של פיברוזיס, ו cardioprotection4. לאחרונה הראו לנו EV, במיוחד מסכות, מופרש על ידי האדם, נגזר הלב ובתאים (Exo-CPC) להקטין לאוטם שריר הלב ב חולדות5,9.

Exo שיתוף ערכה משותפת של חלבונים על פני השטח שלהם, כולל tetraspanins (CD63, CD81, CD9), מתחם מרכזי histocompatibility מחלקה אני (MHC-אני). בנוסף זו ערכה משותפת של חלבונים, Exo מכילים גם חלבונים ספציפיים עבור המשנה EV סוג התא מפיק. Exo סמני צוברות חשיבות עליונה כי הם לשחק תפקיד מכריע בתקשורת הבין-תאית, ובכך ויסות תהליכים ביולוגיים רבים5,10. בשל גודלם הקטן, מציאת דרך קלה כדי לנתח EV באמצעות זרימה קלאסית cytometry (FC) שרידים משימה מאתגרת.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוטה לניתוח EV באמצעות FC, אשר יכול להיות מיושם דגימות מראש מועשר שהושג דרך ultracentrifugation או ישירות ס"מ (איור 1). השיטה משתמשת חרוזים מצופים נוגדן ספציפי המאגד הקנוני Exo-הקשורים משטח epitopes (CD63, CD9, CD81) בלי שוטף נוספים. ניתוחים FC יכול להתבצע באמצעות cytometer המקובלת ללא צורך התאמות לפני מדידות. שיטות אפיון אנטיגנים על חלקיקים קטנים בודדים באמצעות זרימת cytometers תוארו על ידי קבוצות אחרות לגבי יישומים שונים11,12,13. כאן השתמשנו beads מגנטי functionalized ללכידתו של חלקיקים קטנים, מסכות, ואחריו phenotyping החלקיקים שנלכדו על ידי מועדון הכדורגל. אמנם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לאפיין את ההרכב antigenic של שלפוחית קטנה שפורסמו על ידי כל סוג התא במבחנה, כאן אנחנו סיפקנו התרבות תאים מסוים התנאים החלים על התרבות של האדם ובתאים הלב (CPC) ואת ביותר הסביבה המתאימה לייצור של EV על ידי תאים אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איסוף ועיבוד של מדיה ממוזגים

  1. מעיל 55 ס מ2 צלחות פטרי עם ג'לטין העור חזירי 0.02% ב- PBS.
  2. צלחת CPC (8,000/cm2) במנות מצופים מראש עם 7 מ של Iscove שונה Dulbecco בינוני (IMDM) בתוספת 20% FBS (סרום שור עוברית) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S).
    הערה: המונח "עלות לקליק" מתייחס לתאים אנושיים explant נגזר כי כבר תיאר במקום14. ס מ ניתן לאסוף מכל סוגי תאים שונים תרבותי בתנאים תרבות מסוימת. יש ללבוש כפפות ולעבוד תחת ברדס ביולוגי.
  3. ברגע תאים להגיע על 80% הנהרות, להסיר את המדיום תרבות, לשטוף פעמיים עם Dulbecco PBS (PBS) Ca - ו Mg נטול תאים ולהחליף אותו עם 10 מ ל Exo-הייצור ללא סרום בינוני (ששינה הנשר של Dulbecco בינונית [DMEM] גלוקוז גבוהות, 4.5 g/mL).
    הערה: להמשיך עם ירידה הדרגתית של סרום בריכוז בינוני תרבות, להסתגל בהדרגה התאים למצב ללא סרום (SF). עבור תאים הרגישים בינונית ללא סרום להכין למדיום המכיל FBS אך דלה של EV. להכין בינוני שיושלם עם כל החומרים המזינים, בתוספת 10% – 20% (v/v) FBS. Centrifuge המדיום בן לילה ב 100,000 × g, 4 מעלות צלזיוס. שימו לב כי הליך זה אינו מבטיח 100% הסרת FBS-derived EV.
  4. לאחר 7 ימים, לאסוף את ס מ צינורות פוליפרופילן צנטריפוגה.
    הערה: הזמן עבור מיזוג בינונית תלוי בסוג התא. עבור תאים הרגישים בינונית ללא סרום, להגביר את עוצמת הראשונית של מדיום, לקצר את הזמן לאוסף ס"מ ל 24-48 שעות.
  5. ברור ס מ מפני פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב x 3000 g למשך 20 דקות ב 4 – 10 ° C. לאסוף את תגובת שיקוע פנימה צינור מסנן 100 kDa צנטריפוגה.
  6. תתרכז מסומנת ס מ על ידי מסובב את הצינור ב x 2,000 g למשך 20 דקות ב 4 – 10 ° C.
    הערה: שלב זה תפחית את הנפח הראשוני של ס מ המאפשר השימוש בנפח מצומצם צינורות עבור מהירות גבוהה צנטריפוגה שלבים, ויתרום לחסל אגרגטים חלבון קטן.
  7. לאסוף את תרכיז צינור microcentrifuge. צנטריפוגה ב 10,000 x g למשך 15 דקות ב 4 – 10 ° C.
  8. לאסוף את תגובת שיקוע והמשך לסעיף 2 (EV העשרה). אם ultracentrifuge אינה זמינה להמשיך ישירות בסעיף 3 (כימות ניתוח מעקב ננו-חלקיק (נ)).
    הערה: העשרת מראש של EV שבר משפר את read-out הסופית בעוצמתם קרינה פלואורסצנטית (ראה תוצאות נציג, איור 4). שנוקה ס מ (מנקודת 1.8) שניתן לאחסן ב 4 ° C ואז עוד 1-2 ימים או לחילופין-−80 ° C למשך מספר חודשים. 5 ס מ צריך להיות מאושר מראש כדי להסיר את כל פסולת הסלולר לפני האחסון ב- 80 ° C על מנת להבטיח כי פסולת בגודל exosome לא נוצר בתהליך ההקפאה-הפשרה.

2. חוץ-תאית שלפוחית העשרה על-ידי Ultracentrifuge (אופציונלי)

  1. מקם את תגובת שיקוע מהשלב 1.8 בשפופרת פוליקרבונט הקיר עבה ultracentrifuge. ממלאים את הצינור 1 x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) עד שהוא מגיע הקיבולת המקסימלית (3.2 מ"ל).
  2. לטעון דוגמאות רוטור קבוע-זווית טיטניום (8 x 3.2 מ"ל, k-פקטור 13). לטעון את הרוטור ב ultracentrifuge השולחן. Ultracentrifuge ב x 100,000 g עבור h 3-4 – 10 מעלות צלזיוס.
  3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 100 µL ל- 1 x PBS.

3. Nanoparticle מעקב ניתוח (נ) כמת

  1. למהול 1 µL של מדגם (משלב גם 2.3 או 1.8) µL 999 של PBS 1 x. לטעון את הדוגמה של מזרק 1 מ"ל, הימנעות היווצרות בועה. לטעון את המזרק בנמל כניסת לשכת בדיקה.
  2. להפעיל את הלייזר. פתח את המצלמה עם הכפתור ללכוד . התאם את המוקד.
  3. לרשום לפחות 3 מסגרות שונות של 60 s כל.
  4. לנתח את רכישות שונות 3 באמצעות האפשרות תהליך האצווה התוכנה.
    הערה: אם הטכנולוגיה נ אינו זמין, בצע כימות של חלבונים על-ידי וזמינותו ברדפורד (חלקיקים8 עונה 1 פרק 10 תואמות 1 – 2 µg של חלבון הכולל לאחר ultracentrifugation או חלבון סה כ 50-60 µg אם כימות מתבצע ישירות עבור ס מ כ הוא כולל חלבונים מזהמים שונים EV; ראה טבלה 1)5.

4. הכנת הדוגמא

  1. להכין מאגר של 3 הסוגים של לכידת חרוזים (CD9 חרוזים, חרוזים CD63 ו- CD81 חרוזים ב- 1:1:1 יחס; ראה טבלה של חומרים) ו מערבולת.
    הערה: הבריכה נבדקו כדי להיות יציבה במשך חודש. סוג אחד של לכידת חרוז עשוי לשמש, זה יאפשר את זיהוי אוכלוסיות משנה EV לא discriminable עם בריכה של חרוזים. באמצעות אנטיגן יחיד לכידת חרוזים, זה יהיה אפשרי עכשווי להפגין הנוכחות של חלבונים tetraspanin, כגון CD9, CD81 או CD63, וזוהה אנטיגן של עניין על ידי נוגדנים פלורסנט. חרוזים לייטקס אלדהיד חלופי-סולפט מסחרית זמינים גם הם. אלה חרוזים מציגים הידרופובי השטח עבור ספיחה של MV ו- EV.
  2. צינור עגול התחתון, להוסיף את כמות האחסון המתאים חלקיקים8 עונה 1 פרק 10 בתוספת 1 µL של מאגר חרוז, המקביל ל 1.2 x 10 חרוזי5 סה כ (עבור כל בדיקה).
  3. להכין את שפופרת המכילה 1 µL של חרוזים בלי EV שישמש כפקד שלילי, בזאת היא כאל "חרוזים".
  4. לכוון את עוצמת הקול כדי µL 100 עם 1 x PBS. למקם את הצינור התרמו-מיקסר, וללחוץ על 400 סל ד בן לילה ב 4 – 10 ° c
  5. למחרת, להעביר את הדגימות צלחת 96-ובכן התחתון עגול (או צינורות FC).
  6. מוסיפים הנוגדן (µg/mL 10 של CD9_FITC, µg/mL 10 של CD63_PE ו- µg/mL 5 של CD81_PE).
  7. דגירה h 1-4 – 10 מעלות צלזיוס.
  8. להוסיף 100 µL ל- 1 x PBS מכל קידוח.
  9. המשך רכישה.

5. רכישה

  1. לפתוח את התוכנה רכישת ולהתחיל את המכשיר (Cytometer > תוכנית אתחול המערכת). פתח התנסות חדשה.
  2. ליצור תבנית ניסיוני ולאחר מכן בחר צלחת ולאחר מכן להוסיף את הצלחת. בחר את המיקום של הדגימות בצלחת ולאחר מכן הקש להגדיר בתור מדגם טוב.
  3. הזן את שמו מדגם (קרי ובקונגרס #1_CD9FITC) כללי מתן שמות. פתיחת הכרטיסיה ערוץ ולעבור על FITC ועל ערוצי PE.
  4. לטעון את הצלחת בכלי.
  5. לחץ על נקודה מגרש וליצור מגרש נקודה חדשה (P1). הגדר קדימה פיזור אזור (FSC-A) לעומת הצד פיזור-אזור (האס-A).
  6. בחר אתחול כדי להפעיל את הלייזר ואת פלואידיקה. הקש על רכוש כדי להפעיל את הרכישה.
  7. להתאים את קנה המידה כדי להציג את האוכלוסייה באמצע P1. ב- P1 לצייר את השער "חרוזים" סביב האוכלוסייה (למעט פסולת) (איור 2 א). לחץ על עצור.
  8. לחץ על נקודה מגרש וליצור מגרש נקודה חדשה (P2). הגדר קדימה פיזור-גובה (FSC-H) לעומת FSC-א שער העלילה נקודה חדשה על "חרוזים." P2 לצייר שער חדש סביב האוכלוסייה גדולה יותר, בשם "ללבישה" (איור 2 א).
    הערה: אסטרטגיה זו נועדה כדי למנוע כמה שיותר ככל האפשר ההכללה של חרוזים אגרגטים בשלבי רכישת וניתוח.
  9. לחץ על נקודה מגרש וליצור שני מגרשים שונים נקודה; FITC אחת נגד האס-A ו- PE אחד לעומת האס-א שער העלילה נקודה חדשה על "ללבישה."
  10. בחר מספר אירועים לרשום (למשל, 20,000). בחר רשומה ומתחילים את הניסוי.

6. ניתוח נתונים

  1. לטעון את הקבצים רכישה לתוך התוכנה ניתוח.
    הערה: השלבים הבאים צריך להיות מיושם בכל מדגם כולל חרוזים בלבד בכל דגימה לא ידוע.
  2. פתח את פרוטוקול חדש וליצור חלקות נקודה בעקבות האסטרטגיה אותה תיאר בשלב 5.
  3. הגדר צירים כל פיזור לקנה המידה ליניארי ואת כל הצירים זריחה כדי סולם לוגריתמי.
  4. הצג את קרינה פלואורסצנטית הגאומטרי (X-Gmean-MFI) ערוצי FITC ו- PE.
  5. לחשב את היחס בין X-Gמתכוון של הדגימות / X-Gמתכוון של החרוזים צבעונית עם נוגדן ללא exosome.
  6. להשוות את השינוי קיפול MFI של ההכנות EV שונים.

7. טיטור מספר שלפוחית חוץ-תאית

הערה: סעיפים 7 עד 10 יכול להתבצע כדי להגדיר את מספר החלקיקים, נוגדנים ריכוז, ירידה לפרטים, אבל ניתן לדלג אם סוג התא, שממנה נגזרים EV, הנוגדנים נשארים זהים.

  1. לדלל חלקיקים, המתקבל צעד 2.3, PBS 1 x כדי לקבל סדרה של המתלים ועד 5 x 105 2.5 x 108 חלקיקים.
  2. כל השעיה להוסיף צינור עגול התחתון µL 1 של לכידת חרוז הבריכה.
  3. בצע את הפרוטוקול משלב 4.3.

8. נוגדן טיטור

הערה: נוגדן טיטור מתבצע בדרך כלל על-ידי הוספה של נוגדן בודד לכל שפופרת.

  1. לשמור על המספר של EV (הכולל חלקיקים או תכולת החלבון) קבוע כל הדגימות.
    הערה: המספר המתאים נקבע מדעית כפי שמתואר לעיל בסעיף 7.
  2. לפי התקנון מצעדי 4.1-4.5.
  3. מבחן מגוון של נוגדן ריכוזים מעל ומתחת הסכום המומלצים על ידי הספק. לדוגמה, עבור נוגדן עם ריכוז המוצע של µg/mL 10 לכל מבחן, מבחן 1, 2, 5, 10, 20 ו- 50 µg/mL. כוללים מדגם עם "חרוזים בלבד", מוסיף את הריכוז הגבוה ביותר של נוגדן.
  4. תקופת דגירה של h 1-4 – 10 מעלות צלזיוס.
  5. להוסיף 100 µL ל- PBS 1 x עבור כל דגימה.
  6. רוכשים את הדגימות.

9. זמן הדגירה

  1. ודא זמן הדגירה ביצוע רכישות בנקודות זמן שונות (למשל, 1 h, 2 h ו- 5 שעות).
  2. לפי התקנון החל מסעיף 4.
  3. דגירה בדגימות ב 4 – 10 ° C עבור 1 h.
  4. רוכשים את הדגימות.
  5. דגירה בדגימות ב 4 – 10 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  6. רוכשים את הדגימות.

10. פרוטוקול אימות

  1. איגוד EV
    1. צינור עגול התחתון, להוסיף את כמות האחסון המתאים עונה 1 פרק 108 חלקיקים או את כמות החלבון הכולל.
    2. לכוון את עוצמת הקול כדי µL 100 עם 1 x PBS.
    3. לשבש את הקרום EV מאת sonication (לחלופין צעד הלם חום יכול להיות מיושם) על פי הוראות היצרן. הגדרת תדירות ועוצמה. תקופת sonication ניתן מדעית להקים הגדרת ניסוי זמן-קורס (קרי, 0 s, 30 s, 1 דקות, 5 דקות, וכו '.).
    4. להוסיף 1 µL של הבריכה חרוז.
    5. לפי התקנון החל משלב 4.4.
  2. נוגדן ירידה לפרטים
    1. להכין שפופרת אחת עבור כל IgG fluorochrome מצומדת ולהוסיף המתחם של חרוזים-EV כפי שמתואר בשלב 4.6.
      הערה: Isotype fluorochrome מצומדת להתאים עם IgG של הנוגדן בשימוש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המספר הכולל של חלקיקים עבור צביעת יחיד

מאז חרוז אחד באפשרותך לאגוד יותר מחלקיק אחד, בדקנו תנאים שונים כדי לקבוע את הכמות הקטנה ביותר של EV הכולל (יחיד נוגדנים למחזור) כדי להגיע אל השלב מעריכי מוקדם של עקומת MFI. ריכוז קבוע של נוגדן שימש בזמן המספר הכולל של חלקיקים נע בין 5 x 105 2.5 x 108. כפי שמוצג באיור 3A, מספר החלקיקים מאפשר לנו להבטיח הנוגדן מבצעת בתוך MFI...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת FC המקובלת נשאר השיטה האנליטית הברור ביותר לאפיון סמני הביע על גבי המשטח של EV. בהקשר זה, בחירת הפרוטוקול המתאים ביותר הוא חיוני כדי לקבל מידע שימושי בשברים חלקיקים בודדים של עניין על ידי הימנעות מגבלות עקב רגישות המכשיר. אנחנו תיאר שיטה באמצעות חלקיקים מגנטיים בשילוב עם נוגדנים מזהה Exo ו קטן EV אנטיגנים משטח אשר מתאימים ליישום FC במורד הזרם. אנחנו אומת השיטה באמצעות שני סוגי תאים שונים: CPC אנושי ראשוני זה מתגלים כמקור העיקרי תא על-מבוססות-Exo גישות טיפוליות למחלות לב; . ותאים HEK293, קו תא מונצחים בשימוש נרחב ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לי מה להצהיר

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L.B. נתמכה על ידי מענקי מחקר של הלמוט Horten Stiftung ו Velux Stiftung, ציריך (שווייץ). G.V. נתמך על ידי מענקי מחקר של קרן המדע הלאומית השוויצרית, קרן ססיליה-אוגוסטה, לוגאנו לדנציג SHK Stiftung את הרץ-und Kreislaufkrankheiten (שוויץ)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
IMDMGibco12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL מברן, 100  kDa MilliporeUFC910024
CytoFlex, פלטפורמת ציטומטר זרימהבקמן קולטרCytoFlex
DMEM, גלוקוז גבוה, HEPES, ללא פנול אדוםGibco21063045
PBS (PBS) ללא Ca ו-Mg של LonzaBE17-512F
ExoCap CD63 ערכת לכידתJSR מדעי החייםEx-C63-SP
ExoCap CD81 לכידת ערכהJSR מדעי החייםEx-C81-SP
ExoCap CD9 ערכת לכידהJSR מדעי החייםEx-C9-SP
מדולדל אקסוזום FBSThermofisherA2720801
תוסף מדיה FBS מדולדל אקסוזוםSBIEXO-FBS-250A-1
FBS-סרום בקר עובריGibco10270106
FITC נוגדן CD9 אנטי אנושיביולג'נד312104                    RRID: תוכנת
בקמן קולטרקלוזה
NanoSight LM10MalvernNanoSight LM10
NanoSight תוכנהMalvernNTA 2.3
אופטימה Max-XPבקמן קולטר393315
PE אנטי אנושי CD63 נוגדןBiolegend353004                    RRID:AB_10897809
PE אנטי-אנושי CD81 (TAPA-1) נוגדן Biolegend349505                    RRID:AB_10642024
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140122
Thermomixer CEppendorf5382 000 015
רוטוריםבקמן קולטרTLA-110
ניתוח ציטומטר זרימה AB_2075894 TLA-110

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15(2011).
  3. Yadav, D. K., et al. Liquid biopsy in pancreatic cancer: the beginning of a new era. Oncotarget. 9, 26900-26933 (2018).
  4. Balbi, C., et al. First Characterization of Human Amniotic Fluid Stem Cell Extracellular Vesicles as a Powerful Paracrine Tool Endowed with Regenerative Potential. Stem Cells Translational Medicine. 6, 1340-1355 (2017).
  5. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, (2018).
  6. Lai, R. C., et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Research. 4, (2009).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4, 1131-1143 (2015).
  8. Kordelas, L., et al. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28, 970-973 (2014).
  9. Barile, L., et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 103, 530-541 (2014).
  10. Longatti, A., et al. High affinity single-chain variable fragments are specific and versatile targeting motifs for extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 14230-14244 (2018).
  11. Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  12. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  13. Arakelyan, A., et al. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  14. Chimenti, I., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem/progenitor cells in the form of cardiospheres from human cardiac biopsies and murine hearts. Methods Molecular Biology. 879, 327-338 (2012).
  15. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7, 1311-1326 (2012).
  16. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530(2015).
  17. van der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12, 1182-1192 (2014).
  18. Witwer, K. W., et al. Updating the MISEV minimal requirements for extracellular vesicle studies: building bridges to reproducibility. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1396823(2017).
  19. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cellular Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  20. Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7, 11271(2017).
  21. Sodar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316(2016).
  22. Sluijter, J. P. G., et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology. Cardiovascular Research. 114, 19-34 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Flow CytometryCardiac Progenitor CellsUltracentrifugationNanoparticle TrackingAntibody ConjugationMean Fluorescence IntensityCD63 CD9 CD81Bead based Capture

מאמרים קשורים