הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

Alex Kirui; Malitha C. Dickwella Widanage; Frederic Mentink-Vigier; Ping Wang; Xue Kang; Tuo Wang

doi:10.3791/59152

מאמר שיטה

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

DOI:

10.3791/59152

⸱

12 בפברואר 2019

Alex Kirui^*¹ , Malitha C. Dickwella Widanage^*¹ , Frederic Mentink-Vigier² , Ping Wang³ , Xue Kang¹ , Tuo Wang¹

¹Department of Chemistry, Louisiana State University, ²National High Magnetic Field Laboratory, ³Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול להכנת ¹³ג,¹⁵דוגמאות פטרייתי וצמח התווית על-ידי N רב-ממדי ספקטרוסקופיה NMR של מצב מוצק וחקירות קיטוב גרעיני דינמי (DNP) מוצג.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מראה איך בצורה אחידה ¹³ג, ¹⁵התווית על-ידי N חומרים פטרייתי יכול להיות והופק כמה חומרים רכים אלה צריך להיות המשיך NMR של מצב מוצק, רגישות משופרת DNP ניסויים. ההליך דוגמת עיבוד של הצמח ביומסה גם מפורט. שיטה זו מאפשרת את המדידה של סדרת 1D ו- 2D ¹³C -¹³C /¹⁵N מתאמים ספקטרה, המאפשר הבהרה מבניים ברזולוציה גבוהה של מורכבות biomaterials במצב מקורי, עם ההפרעות מינימלי. האיזוטופ-תיוג יכולים להיבדק על ידי לכימות את עוצמת ב 1 י ספקטרה ואת יעילות העברת קיטוב ב- 2D המתאם ספקטרה. ניתן להעריך את ההצלחה של הכנת הדוגמא קיטוב גרעיני דינמי (DNP) על ידי הגורם שיפור הרגישות. לניסויים נוספים לבחון את ההיבטים המבניים של סוכרים, חלבונים יוביל מודל של הארכיטקטורה תלת מימדי. שיטות אלה ניתן לשנותם ולאחר הותאם לחקור מגוון רחב של חומרים עתירי פחמימות, כולל קירות התא הטבעי של צמחים, פטריות, אצות, חיידקים, וכן מסונתז או תוכנן פחמימות פולימרים ומורכב שלהם עם השני מולקולות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פחמימות תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים שונים כגון אחסון אנרגיה, בניין מבניים, ועל זיהוי הסלולר אדהזיה. הם מועשרים בקיר התא, אשר היא מרכיב מהותי צמחים, פטריות, אצות, חיידקים¹^,²^,³. קיר התא מהווה מקור מרכזי הייצור של דלק ביולוגי, biomaterials, כמו גם מטרה מבטיחים טיפולים מיקרוביאלית⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸ ^, ⁹.

ההבנה העכשווית של חומרים מורכבים אלה כבר מתקדם באופן משמעותי על ידי עשורים של המאמצים הוקדשו אפיון מבניים בשיטות ארבע הגדולות ביוכימי או גנטי. השיטה הראשונה הגדולות מסתמך על טיפולים רציפים באמצעות כימיקלים קשים או אנזימים כדי לשבור את קירות התא לחלקים שונים, שבעקבותיה באה ההלחנה וניתוח הצמדה של סוכרים כל שבר¹⁰. שיטה זו שופך אור על התפלגות התחום של פולימרים, אך הפרשנות עלולה להטעות בשל המאפיינים הכימי והפיזי של מולקולות. לדוגמה, קשה לקבוע אם השבר אלקלי-לחילוץ מקורו מחשבים בודדת של מולקולות פחות מובנים או מולקולות נפרדות עם מסיסות דומות. שנית, חילוץ חלקים או את כל קירות התא ניתן גם למדוד באמצעות פתרון NMR כדי לקבוע את קישורים קוולנטיות, גם כינה crosslinking, בין מולקולות שונות¹¹^,¹²^,¹³^, ¹⁴^,¹⁵. בדרך זו, יכול להיות ובחן את מבנה נתונים היסטוריים של עוגנים קוולנטיות, אך מגבלות יכולה להתקיים בשל המסיסות נמוכה של סוכרים, מספר קטן יחסית של אתרים crosslinking הבורות של תופעות שאינן קוולנטיות זה מייצבת אריזה רב-סוכר, כולל שטני של מימן, ואן דר Waals כוח, אינטראקציה אלקטרוסטטית, שזירה פולימר. שלישית, זיקה מחייבת היה נחוש במבחנה באמצעות פוליסכרידים מבודד¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹, אבל הטיהור הליכים עשוי לשנות באופן משמעותי מבנה ותכונות של מולקולות אלה. שיטה זו נכשלת גם לשכפל את התצהיר מתוחכמים והרכבה של מקרומולקולות לאחר ביוסינטזה. לבסוף, פנוטיפ, מורפולוגיה תאים, תכונות מכניות של מוטציות גנטיות עם ייצור הקלוש של רכיב מסוים דופן התא לשפוך אורות על התפקידים המבניים של סוכרים, אבל הראיות מולקולריות יותר יש צורך לגשר על אלה תצפיות מאקרוסקופית עם הפונקציה שעברו הנדסה לאחור של חלבון machineries²⁰.

התפתחויות אחרונות פיתוח ויישום של רב-ממדי ספקטרוסקופיה NMR של מצב מוצק הציגו הזדמנות ייחודית לפתרון חידות מבניים אלה. ניסויים NMR של מצב מוצק דו-ממדי/תלת-ממדי לאפשר חקירה ברזולוציה גבוהה של הרכב, ארכיטקטורה של חומרים עתירי פחמימות במצב מקורי ללא ההפרעות הגדולות. מבניים מחקרים נערכו בהצלחה על ראשי והן קירות התא משני של צמחים, ביומסה שטופלו catalytically, biofilm חיידקי, הפיגמנט רוחות פטריות ו, לאחרונה על-ידי המחברים, קירות התא שלם בפטריה פתוגניים אספרגילוס fumigatus ²¹ ^, ²² ^, ²³ ^, ²⁴ ^, ²⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ ^, ²⁹ ^, ³⁰ ^, ³¹. ההתפתחות של קיטוב גרעיני דינמי (DNP)³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷^,³⁸ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹ ^, ⁴² מקלה באופן משמעותי על הבהרה מבניים NMR כמו שיפור הרגישות מאת DNP מקצר במידה ניכרת הזמן ניסיוני על biomaterials מורכבים אלה. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את נהלי איזוטופ-תיוג הפטריה fumigatus א והכנת פטרייתי ודוגמאות צמח על אפיון NMR, DNP של מצב מוצק. נהלים תיוג דומים צריך להיות רלוונטי פטריות אחרות שינו בינונית, ההליכים הכנת המדגם צריך להיות בדרך כלל החלים biomaterials עתירי פחמימות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גידול של ¹³ג', ¹⁵התווית על-ידי N אספרגילוס fumigatus בינוני נוזלי

הכנת ללא תווית ו- ¹³C, מדיום הגידול התווית על-ידי N ¹⁵
הערה: שניהם דקסטרוז Peptone לחלץ שמרים בינונית (YPD), את שיפור בינונית מזערי⁴³ שימשו לשם קיום תרבות פטרייתי. כל השלבים לאחר autoclaving מבוצעות בתא למינארי כדי למזער את הזיהום.
1. הכנת בינוני נוזלי ללא תווית: להמיס 6.5 גר' אבקת YPD 100 מ של מים מזוקקים ולאחר מכן אוטוקלב במשך 25 דקות-134 מעלות צלזיוס.
2. הכנת בינוני מוצק ללא תווית
  1. להוסיף 1.5 g של אגר, 6.5 גר' אבקת YPD 100 מ של מים מזוקקים.
  2. אוטוקלב המדיום במשך 25 דקות-121 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מגניב עד כ 50 מעלות צלזיוס.
  3. להעביר 13-15 מ"ל של המדיום לתוך כל פלסטיק מראש עקר פטרי, מכסים את הכלי באמצעות מכסה באופן מיידי.
3. הכנה של ¹³ג', ¹⁵התווית על-ידי N נוזלי בינוני
  הערה: כדי להכין את הפתרון צמיחה איזוטופ תיוג, מדיום מינימלי המכיל ¹³C-גלוקוז, ¹⁵N-נתרן חנקתי, פתרון יסוד קורט מוכן בנפרד הינם מעורבבים אז לפני השימוש.
  1. הכן 100 מ של המדיום מינימלי המכיל איזוטופ כמפורט בטבלה1. להתאים את ה-pH ל 6.6 באמצעות NaOH (1 מ') או פתרון HCl (1 מ').
  2. אוטוקלב אמצעי מינימלי עבור 25 דקות-121 מעלות צלזיוס.
  3. להכין 100 מ ל (1, 000 x) של יסודות קורט פתרון, לפזר את מלחי המופיעים בטבלה 2 במים מזוקקים. אוטוקלב הפתרון עבור 25 דקות-134 מעלות צלזיוס. לקרר ולאחסן את הפתרון ב 4 ° C לשימוש לטווח קצר. ה-pH יהיה בערך 6.5, ניתן לבדוק באמצעות מד pH.
  4. להוסיף 0.1 מ"ל של יסודות קורט פתרון 100 מ של ¹³ג', התווית על-ידי N בינונית מזערי ¹⁵כמפורט בטבלה מס ' 2 לפני השימוש.
הצמיחה של החומרים פטרייתי
1. העברת כמות קטנה של פטריות מהמחסן לצלחת YPD באמצעות ללולאה לחסן ב תא למינארי. שמור את התרבות ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים בתוך אינקובטור.
2. השתמש ללולאה לחסן להעברת פעיל היתרון פטרייתי גדל ¹³ג,¹⁵תיוג-N פתרון תא למינארי. לשמור על התרבות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3-5 ימים על 220 סל"ד ב חממה חזק.
3. צנטריפוגה ב x 4,000 גרם במשך 20 דק. הסר תגובת שיקוע ולאסוף בגדר.
4. השתמש פינצטה כדי לאסוף ~0.5 גר' צניפה שתיתן (> 50 wt % לחות) ללימודי NMR. אובדן לחות בכל נקודה להחמיר באופן משמעותי את הרזולוציה ספקטרלי.
  הערה: אם יש צורך, כמות קטנה (0.1 גר') של תפטיר רטוב ניתן להיות מופרדים, מיובש לחלוטין תחת זרימת גז₂ N ברדס או של איזה שהוא לופילייזר כדי להעריך את רמת לחות ולחשב האחוז המוני יבש. בדרך כלל, גלולה המכילה ~0.3 g ניתן להשיג מסה יבש לאחר 3 ימים. אם הניסוי NMR להתנהל ארוך (> 7 ימים) ו/או אם המדינה של הפטריות צריך לתקן, החומר פטרייתי שיכול להיות עמוק קפוא נוזלי N₂ למשך 10-20 דקות לפני עיבוד נוסף. אם הניסוי יהיה קצר (3-6 ימים), הקפאת יכול תדלג על כך לדוגמה יכול להישאר טריים.
5. לערבב חומר עודף עם 20% (v/v) גליצרול בשפופרת צנטרפוגה ולשמור אותו במקפיא-80 ᵒC לאחסון לטווח ארוך.

2. הכנה של fumigatus א Solid-state NMR ולימודי DNP

הכנת fumigatus א לניסויים NMR של מצב מוצק
1. Dialyze ¹³ג, ¹⁵התווית על-ידי N פטרייתי דוגמת (שלב 1.2.4.) נגד 1 ליטר של 10 מ מ פוספט מאגר (pH 7.0) ב 4 ° C באמצעות שקית דיאליזה עם 3.5 kDa מולקולרית משקל סף כדי להסיר מולקולות קטנות מדיום הגידול לתקופה כוללת של 3 ימים. לשנות את המאגר פעמיים ביום.
  הערה: לחלופין, המדגם יכולים להישטף במשך 6 - 10 פעמים באמצעות מים יונים כדי להסיר שאריות מולקולות קטנות.
2. להעביר את הדגימה לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה במשך 5 דקות (10,000 x g) באמצעות צנטריפוגה benchtop. הסר את תגובת שיקוע, לאסוף את החומרים פטרייתי.
3. חבילת 70-80 מ"ג בצורה אחידה ¹³לדוגמה התווית על-ידי C, שתיתן הדבק לתוך הרוטור₂ ZrO 4-מ מ או 30-50 מ"ג ל- 3.2 מ מ הרוטורים לניסויים NMR. שוב ושוב לסחוט את הדגימה בעדינות באמצעות מוט מתכת, לספוג את המים העודפים שימוש בנייר.
4. בחוזקה קאפ הרוטור, להכניס את הדגימה ספקטרומטר עבור אפיון NMR של מצב מוצק.
  הערה: הרוטורים חדשים מוצעים כדי למזער את האפשרות של הרוטור התרסקות ולטעום נוזלים ב ספקטרומטר NMR. אם יש צורך, הוספה קל-F חד פעמיות עם איטום הברגים יכול לשמש כדי לשמש כגורם מכיל משני בתוך הרוטור.
הכנת fumigatus א דוגמאות לניסויים DNP
1. להכין µL 100 DNP ממיסים²⁹^,⁴⁴ (הידוע גם בשם המטריקס DNP) צינור microcentrifuge 1.5 mL ¹³ג,¹⁵התווית על-ידי N דגימות פטרייתי. מטריצה זו DNP מכיל תערובת של d₈-גליצרול/D₂O H₂O (60/30/10 Vol %).
  הערה: אם הם דוגמאות ללא תווית להיחקר, ואז להכין המטריקס DNP באמצעות¹³מדולדל C d₈-גליצרול (¹²ג₃, 99.95%; ד₈, 98%) ו- D₂O ו- H₂O להימנע ¹³ג אות התרומה ממיסים.
2. להמיס 0.7 מ"ג של AMUPol⁴⁵ ב- µL 100 DNP בממיסים טופס 10 מ מ מניות פתרון רדיקלי. מערבולת למשך 2-3 דקות על מנת להבטיח כי רדיקלים הם מומס באופן מלא הפתרון.
3. משרים 10 מ ג של dialyzed ¹³C, התווית על-ידי N חומרים פטרייתי ¹⁵כפי שתואר בשלבים קודמים (שלבים 2.1.1 ו 2.1.2) לתוך µL 50 של פתרון AMUPol, במתינות לטחון את התערובת באמצעות כבעלי מרגמה כדי להבטיח חדירה של הגורמים הקיצוניים לתוך קירות התא נקבובי.
  הערה: כדי להפחית את קצב איבוד לחות, שהטחינה יכולה להתקיים גם צינור microcentrifuge באמצעות micropestle.
4. להוסיף עוד 30 µL של הפתרון הרדיקלי בגדר חרקו כדי מימה נוספת הדגימה פטרייתי.
5. לארוז בגדר לתוך רוטור ספיר 3.2 מ מ, לסחוט בעדינות ולהסיר הממס DNP עודף. להוסיף פקק סיליקון 3.2 מ מ כדי למנוע את אובדן לחות. בדרך כלל, עמוסים 5-30 מ"ג של הדגימה את הרוטור. הסכום המדויק צריך להיקבע על ידי הדרישה רגישות של הניסויים NMR להתנהל.
6. הכנס לשחחר מדגם ספקטרומטר DNP, למדוד את קשת משופרת DNP תחת הקרנה במיקרוגל ולהשוות אותם עם הקשת מיקרוגל-off. זה יוביל שיפור מקדם חדוה_{הפעלה/כיבוי}, אשר אמור להיות 20-40 עבור חומרים מורכבים אלה. הפעל את הניסויים מעוצב כדי לקבוע מבנה דופן התא.

3. הכנה של הצמח ביומסה NMR ולימודי DNP

הכנת חומרי צמח NMR של מצב מוצק
1. לייצר בצורה אחידה ¹³התווית על-ידי C צמחים ללא צורך במיקור חוץ באמצעות ¹³CO₂ אספקה קאמרית או ¹³C-גלוקוז מדיום הגידול כפי שתואר לעיל⁴⁶^,⁴⁷ או ישירות לרכוש חומרים עם תוויות תיוג-איזוטופ חברות.
  הערה: ¹³C-גלוקוז יכול לשמש רק בצמיחה כהה כדי למנוע את כניסתה של ¹²C על ידי פוטוסינתזה.
2. לחתוך בצורה אחידה ¹³ג שכותרתו חומר צמחי לחתיכות קטנות (בדרך כלל 1-2 מ. מ בממד) באמצעות תער מעבדה.
  הערה: בהתאם למטרה, קירות התא שהופרד נעשה שימוש לעיתים עבור אפיון מבניים, הפרוטוקולים מפורט מדווחים על מחקרים קודמים²¹^,⁴⁶.
3. אם המדגם היה בעבר יבש, להוסיף 100 µL של מים 30 מ"ג של הצמח חומרים צינור microcentrifuge 1.5 mL, מערבולת, equilibrate בטמפרטורת החדר עבור יום אחד. צנטריפוגה ב x 4,000 g 10 דקות ולהסיר עודפי המים באמצעות פיפטה.
4. אם המדגם היה מיובש מעולם לא בשלב כלשהו, להשתמש ישירות המדגם ללא טיפול נוסף.
5. חבילת החומרים הצמח שתיווצר לתוך 3.2 מ מ או 4 מ מ ZrO₂ רוטורים לניסויים NMR של מצב מוצק.
הכנה של חומרים צמח ללימודי DNP
1. להכין פתרון 60 של מניות µL 10 מ מ AMUPol רדיקלית כפי שמתואר שלבים 2.2.1 ו- 2.2.2.
2. לחתוך בצורה אחידה ¹³ג שכותרתו חומר צמחי שילמדו לחתיכות קטנות (1-2 מ מ בממד) באמצעות תער מעבדה ולשקול 20 מ ג של החומרים הצמח.
3. יד-לטחון החלקים צמח לתוך חלקיקים קטנים (~ 1-2 מ"מ) באמצעות ומכתש. אבקות הסופי יש מראה הומוגני.
4. הוסף µL 40 של הפתרון מניות DNP המבושלות צעד קודם (שלב 2.2.2) לחומר צמח, לטחון במתינות למשך 5 דקות להבטיח הומוגנית ערבוב עם הקיצוני.
5. להוסיף עוד 20 µL של הפתרון המניות עוד יותר מימה החומר הצמח לאחר שחיקה.
6. חבילת המדגם צמח equilibrated לתוך 3.2 מ מ רוטור ספיר לניסויים DNP. להוסיף פקק סיליקון כדי למנוע את אובדן לחות.

4. תקן NMR של מצב מוצק ניסויים עבור משלב האפיון הראשוני של Biomaterials עתירי פחמימות

הערה: סקירה קצרה של הניסויים NMR מסופק בסעיף זה. עם זאת, הבהרה מבנית בדרך כלל דורש מומחיות מקיפה. לכן, מומלץ מאמצים משותפים עם NMR spectroscopists.

מדד 1 י ¹³C לחצות קיטוב (CP), ¹³C ישירה קיטוב (DP) עם 2-s ו- 35-s המיחזור עיכובים, ¹H -¹³C מיומן⁴⁸^,⁴⁹ ספקטרה כדי להשיג הבנה כללית של דינמיות הפצה של רכיבים תא (איור 1 א'). קירות התא הם בדרך כלל החלק יחסית נוקשה ולהציג אותות דומיננטי בספקטרום CP.
למדוד סדרת 2D תקן ¹³C -¹³C מתאם ניסויים עבור הקצאות תהודה של אותות ¹³C. להתחיל עם לקוי refocused⁵⁰^,⁵¹ לקבלת קישוריות פחמן, אשר צריך להיות בסיוע סדרה של ניסויים דרך-שטח כגון 1.5-ms RFDR⁵² (איור 1b) חוט 50-ms/דר⁵³ניסויים.
הערה: אם זה עניין למצוא דוגמא עשירה רכיב מסוים, לדוגמה, ראשית או קירות התא משני, אז מקטעים מרובים או צמחים מרובים עשויים צריך למדוד בנפרד כדי למצוא את הדגימה עם הרכב מיטבי.
לערוך ניסויים המתאם¹³C 2D ¹⁵N - אשר ניתן למדוד כדי להקל את ההקצאות תהודה של חלבונים ופחמימות nitrogenated.
הערה: ההקצאה תהודה היא בדרך כלל זמן רב. שיטה כיום מפותח כדי להקל על המשימה תהודה של פחמימות אותות עבור המדענים הללו ללא ניסיון קודם.
למדוד את הניסויים יותר מיוחדים כדי לקבוע את מרחבי proximities (איור 1 c, d), הידרציה ואת mobilities של מולקולות מורכבות כדי לקבוע למבנה התלת ממדי של החומרים עתירי פחמימות כמו באופן שיטתי שתוארה לעיל²²^,²⁹.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איזוטופ תיוג באופן משמעותי משפר את הרגישות NMR, מאפשרת מדידה של סדרת 2D ¹³C -¹³C ו ¹³C -¹⁵N מתאם ספקטרה כדי לנתח את הרכב, לחות, ניידות, אריזה של פולימרים, אשר ניתן לשלב בניית מודל תלת מימדי של דופן התא אדריכלות (איור 1). אם תיוג אחיד מצליחה, ערכה מלאה של 1 י ¹³C ו ¹⁵N ספקטרה ניתן לאסוף בתוך 1 h, כל ספקטרום 2D רגיל צריך לקחת לא יותר מ- 24 שעות של המדידה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לעומת שיטות ביוכימיות, NMR של מצב מוצק יש יתרונות כמו טכניקה הרסניות ו ברזולוציה גבוהה. NMR גם כמותיים בניתוח ההלחנה, בניגוד לרוב שיטות אנליטיות אחרות, לא צריך אי הוודאויות שהוצגו על ידי המסיסות מוגבל biopolymers. הקמת בפרוטוקול הנוכחי מקלה על מחקרים עתידיים על פחמימות-עשיר biomaterials, פולימרים functionalized. עם זאת, יצוין כי הקצאה תהודה וניתוח נתונים יכולה לגזול זמן רב, בדרך כלל דורשים הכשרה. המחברים כיום מפתחים כלים, מסדי נתונים כדי לעזור מדענים ללא ניסיון קודם כדי להתגבר על מחסום זה.

מאז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע דרך ה-NSF אויה-1833040. נבחרת גבוהה השדה המגנטי מעבדה (NHMFL) נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע דרך DMR-1157490, פלורידה. מערכת MAS-DNP-NHMFL הוא מומן בחלקו על ידי NIH S10 OD018519 ואת ה-NSF צ'ה-1229170.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אמוניום מוליבדט טטרהידרט	אקרוס אורגני	12054-85-2
AMUPol	Cortecnet	C010P002
איזון שקילה אנליטי	B730439218	אוהאוס	דגם PA84C
ביוקלאב 16 ליטר	VWR	470230-598
ארון בטיחות ביולוגית	תאגיד Labconco	302319100
חומצה בורית	חנות VWR	BDH9222	ב-15-30 מעלות; C
קובלט (II) כלוריד הקסהידרט	Honeywell \|פלוקה	60820	≥ 98%
נחושת (II) סולפט פנטהידראט	BDH	BDH9312	≥ 98 %
קורנינג LSE אינקובטור טלטול	תרמו פישר סיינטיפיק	7202152
D₂O	סיגמא אולדריץ'	151882	99.9 אטום %
D d₆-DMSO	סיגמא אולדריץ'	151874	99.9 אטומים %
D d₈-glycerol	Sigma Aldrich	447498	≥ 99 אטום %
D צינורות דיאליזה 3.2 kDa	Sigma Aldrich	D2272	132724
דיפוטסיום פוספט	VWR	BDH9266	≥ 98
גליצרול	סיגמא אולדריץ'	G5516	≥ 99.5
Heraus Megafuge 16R צנטריפוגה	תרמו פישר 750004271		מקסימום RCF 25,830 x גרם
ערכת הכנסה חד פעמית HR-MAS	Bruker	B4493	Kel-F
ברזל (II) סולפט Heptahydrate	Alfa Aesar	14498	≥ 99+ %
מגנזיום סולפט Heptahydrate	VWR	10034998	לאחסן בטמפרטורה של 18-26 מעלות; C
מנגן(II) כלוריד טטרהידרט	אלפא Aesar	11563	≥ 99
מונופוטסיום פוספט	VWR	470302-254	≥ 99
מד pH	מטלר טולדו	B706689216
טטרסודיום אתילנדיאמין-טטראצטט	Acros Organics	13235-36-9	≥ 99.5
אבץ גופרתי Heptahydrate	Alfa Aesar	33399	≥ 98 %
¹²C3, d₈-glycerol	Cambridge Isotope Laboratory	CDLM-8660	¹²C3, 99.95%; D8, 98%
¹³C6-גלוקוז	סיגמא אלדריך	364606	≥ 99% (CP)
¹⁵N-נתרן חנקתי	Sigma Aldrich	364606	≥ 98% 15N, ≥ 99 (cp)
3.2 מ"מ ספיר NMR רוטור	Cortecnet	B6939
3.2 מ"מ תקע סיליקון	Bruker	B7089
4 מ"מ ערכת רוטור MAS	Bruker	H14355	זירקוניה

% % % % %

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435(2013).
Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902(2016).
Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747(2018).
Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347(2019).
Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NMR DNP 13 15

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים