שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
האורגניזם מודל C. אלגיה מספק מערכת מעולה לבצע הדמיה vivo סידן. הגוף השקוף והmanipulability הגנטי שלו מאפשרים ביטוי ממוקד של חיישני סידן מקודדים גנטית. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישנים אלה עבור הדמיה vivo של הדינמיקה סידן בתאים ייעודיים, במיוחד שרירי הגוף של התולעים. על ידי ניצול הביטוי המשותף של המתקשר הטרום סינפטיות, גירוי של שחרור אצטילכולין מפני הנוירונים מוטוריים מוטורי יכול להיגרם באמצעות פולסים באור כחול, וכתוצאה מכך שרירים depolarization שריר ושינויים בסידן cytoplasmic רמות. שתי טכניקות השתק התולעים נידונות עם רמות שונות של קושי. השוואה בין טכניקות אלה ממחישה כי שתי הגישות משמרות את הפיזיולוגיה של הצומת העצבי ומאפשרים לכמת את הסידן. על-ידי שיוך אלקטרואופטיקה והדמיה של סידן פונקציונלי, שינויים בטיפול בסידן פוסט-סינפטית והומאוסטזיס ניתן להעריך במגוון של רקעים מוטציה. הנתונים המוצגים מאמתת הן טכניקות השתק ובודקת באופן ספציפי את התפקידים של C. אלגיה sarco (לאנדו) פלמיק סידן ATPase ואת הסידן מופעל בערוץ האשלגן המופעל בתוך שריר קיר הגוף בוויסות הסידן.
מבוא
נייר זה מציג שיטות לדימות סידן vivo של C. אלגיה שרירי קיר הגוף באמצעות הגירוי העצבי הגנטי. זיווג שריר הביע מחוון סידן מקודד גנטית (סמא) עם אור כחול המופעל הנוירופולריזציה והוא מספק מערכת להתבונן בבירור את הארעיות מעורר הסידן סינפטית. זה מונע את השימוש בגירוי חשמלי, המאפשר ניתוח לא פולשני של מוטציות המשפיעות על הדינמיקה סידן פוסט סינפטית.
חד-פלואורוופפור, כגון gcamp, משתמש במולקולה אחת של חלבון פלורסנט התמזגו לתחום M13 של רירן שרשרת האור בקצה N-terminal שלה ו קלמודולין (CaM) ב C-טרמינוס. עם כריכת סידן, התחום CaM, אשר יש זיקה גבוהה לסידן, עובר שינוי הקונפורמציה גרימת שינוי מאוחר יותר בחלבון פלורסנט המוביל להגדיל את עוצמת הקרינה הפלוא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. התקנת מיקרוסקופ
- השתמש במיקרוסקופ מורכב עם יכולות של קרינה פלואורסצנטית. עבור מחקר זה, הנתונים נאספו על מיקרוסקופ זקוף (טבלת חומרים) מצויד נוריות עבור עירור.
- כדי להמחיש כראוי שינויים בעלי קרינה פלואורסצנטית שרירי הגוף, להשתמש במטרה הגדלה גבוהה.
- לקראת ההכנות לגזור, השתמש ב 60x NA 1.0 המים מטרה טבילה (טבלת חומרים).
- להכנות באמצעות nanobeads, השתמש ב-60x NA 1.4 מטרה טבילה שמן (טבלת חומרים). הגדלה זו מבטיחה רזולוציה מספקת של השרירים על חיישן המצלמה.
- השתמש במצלמה רגישות גבוהה מחוברת למיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות בקצב מסגרת גבוהה כדי לעקוב אחר שינויים מהירים ברמות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
טכניקה זו העריכה שינויים מוטציות חשבו להשפיע על טיפול בסידן או depolarization השריר. רמות הניאון הבסיסית ו ארעיות פלורסנט היו דמיינו ומנוחה cytosolic סידן וקינטיקה סידן בתוך השריר הוערכו. חשוב כי החיות גדלו על הרשתית כל הטרנס לפחות שלושה ימים כדי להבטיח את התאגדות מוצלחת של הרשתית, ובכך לאחר מכן הפעלת המתקשר (איור 2א). אם בעלי חיים אינם חשופים הרשתית כל טרנס, לא השריר החולף הסידן הוא הפעיל (איור 2ב
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הסמנים הם כלי רב-עוצמה בנוירוביולוגיה. עבודה קודמת יש שימוש בטכניקות הדמיה סידן כדי לבחון מגוון רחב של פונקציות הן נוירונים ותאי שריר, כולל תגובות חישה והתנהגותית, עם שיטות מגוונות של גירוי. מחקרים מסוימים השתמשו גירויים כימיים כדי להפעיל מארעיות סידן בנוירונים אפר חושי22,23 או כדי לגרום לגלי סידן בשריר הלוע24. קבוצה נוספת מנוצל גירוי מכני בעוד תולעים הוחזקו בצ microflu, כדי לבחון תגובות סידן ב קולטן מגע נוירונים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מודים לד ר אלכסנדר גוטשאלק עבור ZX1659, RCaMP והמתקשרים המכילים זן התולעת, ד ר Hongkyun קים עבור מאמץ התולעת איטי-1 (eg142) , ואת הפרויקט הלאומי Bioresource עבור מאמץ של לסרוק -1 (tm5339) תולעת.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| all-trans רשתית | סיגמא-אולדריץ' | R2500 | הכרחי לעירור של ערוץ רודופסין |
| תאורת LED | ענבר RCaMP | ||
| Arduino UNO | Mouser | 782-A000066 | שולט בתאורת פלואורסצנטיות |
| LED | תאורת רודופסין | ||
| BX51WI מיקרוסקופ | אולימפוס | מיקרוסקופ מורכב במצב קבוע | |
| נשלט זרם רעש נמוך ספק כוח ליניארי | Ametek | Sorenson | בקרות עוצמת LED |
| Igor Pro | Wavemetrics | Wavemetrics.com | תוכנת גרפים |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov | תוכנת עיבוד תמונה |
| LUMFLN 60x מים NA 1.4 | אולימפוס | מטרת טבילה במים עבור הכנה מנותחת | |
| מאסטר-8 סטימולטור | A.M.P.I | טיימר מאסטר לרכישת תמונה ותאורת LED | |
| מיקרו-מנהל | micro-manager.org | בקרות רכישת מצלמות והנעת LED | |
| גיליון אלקטרוני | של מיקרוסופט | מיקרוסופט | |
| pco.edge 4.2 CMOS מצלמה | pco | 4.2 | מצלמה מהירה |
| PlanApo N 60x שמן NA 1.4 | אולימפוס | להכנת ננו-חרוזים | |
| מיקרוספירות Polybead | Polysciences, Inc. | 00876-15 | עבור קיבוע תולעת |
| מתגי מצב מוצק | Sensata Technologies | Crydom CMX100D6 | בקרות תזמון של תאורת LED |
| מתח טרנסגני, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Richmond Lab | SY1627 | ערוץ עצבי מעורררודופסין ושריר דופן הגוף RCaMP המבטא קו תולעת עם אלל מוטנטי SERCA |
| זן טרנסגני, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Richmond Lab | ערוץ עצבי מעורררודופסין ושריר דופן הגוף RCaMP המבטא קו תולעת עם אלל מוטנטי של תעלת אשלגן BK המופעל על ידי סידן | |
| , [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35] | Gottschalk Lab | ZX1659 | תעלה עצבית מעוררתרודופסין ושריר דופן הגוף RCaMP המבטא קו תולעת |
מקורות
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. G....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
