נשימה מיטוכונדריאלי חיוני להישרדות organismal; לכן, קצב צריכת החמצן היא מדד מצוין של בריאות מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש respirometer זמינים מסחרית כדי למדוד הבזליים, שיעורי צריכת חמצן מירבית חיים, שלמים, ולא תאי בחופשיות Caenorhabditis elegans.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידה של קצב הצריכה של חמצן בשלם Caenorhabditis elegans
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפונקציה מיטוכונדריאלי האופטימלי הוא קריטי עבור פעילות תאית בריאה, במיוחד בתאי בעלי אנרגיה גבוהה דרישות כמו אלה במערכת העצבים, שרירים. בקנה אחד עם זה, תפקוד מיטוכונדריאלי היה קשור עם מספר עצום של מחלות ניווניות והתיישנות באופן כללי. Caenorhabditis elegans כבר מערכת מודל רב עוצמה עבור שחקרתי המורכבות הרבה של הפונקציה מיטוכונדריאלי. נשימה מיטוכונדריאלי הוא סימן חזק של פונקציה מיטוכונדריאלי, respirometers פיתחה לאחרונה מציעים פלטפורמה המדינה-of-the-art כדי למדוד את הנשימה בתאים. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים שיטה לנתח חיים, שלמים C. elegans. פרוטוקול זה משתרע על פני תקופה של ~ 7 ימים, כולל שלבי (1) גדל וסינכרון של C. elegans, (2) הכנת תרכובות כדי להיות מוזרק, הידרציה של הגששים, equilibration וטעינה של מחסנית סמים (3), (4) הכנת assay תולעת צלחת assay לרוץ ו ניתוח נתונים לאחר הניסוי (5).
מבוא
אדנוזין טריפוספט (ATP), המקור העיקרי של אנרגיה תאית, מיוצר בתוך המיטוכונדריה על ידי אנזימים בשרשרת האלקטרונים תחבורה (וכו ') הממוקם בתוך הקרומית מיטוכונדריאלי הפנימי. פירובט, מטבוליט מפתח מנוצל לייצור ATP מיטוכונדריאלי, מיובא לתוך מאטריקס מיטוכונדריאלי איפה decarboxylated לייצר אצטיל קואנזים A (CoA). לאחר מכן, אצטיל CoA מזין את מעגל קרבס וכתוצאה מכך הדור של nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH), מולקולה נשא אלקטרונים מפתח. כמו אלקטרונים NADH מועברים למנהל חמצן דרך ועוד, פרוטונים לבנות בחלל intermembrane מיטוכונדריאלי, דבר המתבטא הדור הצבע אלקטרוכימי על פני הקרום. אלה פרוטונים יזרום אז מן המרחב intermembrane מעבר הדרגתי אלקטרוכימי הזה בחזרה לתוך המטריקס מיטוכונדריאלי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: איור 2 מספק מבט סכמטי של פרוטוקול מלא.
1. צמיחה וסינכרון של האוכלוסייה נמטודות9,10
- העברת L4 הזחלים של רקע גנטי הרצוי (למשל, N2 [wild type] ובעלי sel-12) על גבי נמטודות מדיה (NGM) לוחיות גדילה (ראה טבלה 1 למתכון) טרי נזרע עם מדשאה Escherichia coli (OP50)11. להשתמש לפחות שני 100 מ"מ או שלוש צלחות 60 מ מ עבור כל זן. דגירה התולעים בטמפרטורה המתאימה צמיחה (בין 15-25 ° C) במשך 3-4 ימים או עד שהצלחות מרוכז עם מספר רב של ביצים ותולעים gravid.
- לשטוף ביצים עם תולעים מהצלחות, באמצעות כ- 6 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך, OCR של חיות פראי סוג ו מוטנטים שונים sel-12 שלושה זנים היו נחושים. sel-12 מקודד את ortholog C. elegans presenilin17. מוטציות בגן presenilin האנושי הם המפגע גנטי הנפוצים ביותר הקשורים להתפתחות מחלת אלצהיימר משפחתית18. המחקרים שלנו הראו רמות סידן גבוהות מיטוכונדריאלי sel - 12 חיות לעומת חיות פראי סוג3. מאז dysregulation סידן יכול לגרום פונקציה מיטוכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נשימה מיטוכונדריאלי הוא מחוון תובנה של פונקציה מיטוכונדריאלי; לכן, היכולת למדוד את שיעור צריכת החמצן במערכת הביולוגית, בין אם במבחנה או ויוו הוא חשוב מאוד. Respirometers חש רמות החמצן באמצעות חומר זרחני מבוססי פורפירין זה לקבל מתרצה באמצעות חמצן או באמצעות חיישני חמצן amperometric המסתמכים על הדור של פרופורציונלי הנוכחי חשמלי חמצן בלחץ... קלארק אלקטרודה נופל לתוך הקטגוריה השנייה, שימש בהרחבה בספרות, במיוחד במהלך ניתוח נשימה C. elegans. עם זאת, הצורך גודל דגימה גדולה וחוסר היכולת להעריך מדגם אחד או יותר בכל פעם ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים רוצה להכיר את ד ר קווין Bittman להדרכה שלו בהקמת את XFp סוסון ים במעבדה. מכוני הבריאות הלאומיים הענק ש-gm088213 נתמך עבודה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 100 מ"מ, 60 מ"מ צלחות פטרי | Kord-Valmark Labware מוצרים | 2900, 2901 | |
| צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל | גלוב סיינטיפיק | 6285 | |
| צינורות חרוטיים 15 מ"ל | קורנינג | 430791 | |
| 22 ופעמים; 22 מ"מ כיסוי | גלובוס סיינטיפיק | 1404-10 | |
| צינורות חרוטיים 50 מ"ל | קורנינג | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| בקטו פפטון | BD, בקטו | 211677 | |
| בקטו טריפטון | BD, בקטו | 211705 | |
| תמצית שמרי בקטו | BD, בקטו | 212705 | |
| אקונומיקה | כלוריד דיהידרט גנרי | ||
| (CaCl2· 2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| כולסטרול | פישר סיינטיפיק | C314-500 | |
| מים נטולי יונים (dH2O) | |||
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | תומאס סיינטיפיק | C987Y85 | |
| פיפטות פסטר זכוכית | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| מגנזיום סולפט הפטהידראט (MgSO4· 7H2O) | פישר סיינטיפיק | BP213-1 | |
| אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4) | פישר סיינטיפיק | BP363-1 | |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4) | פישר סיינטיפיק | P285-500 | |
| נתרן כלורי | פישר סיינטיפיק | BP358-10 | |
| נתרן הידרוקסיד (NaOH) | פישר סיינטיפיק | BP359-500 | |
| נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים (Na2HPO4) | פישר סיינטיפיק | BP332-1 | |
| סוסון ים XFp אנלייזר | ים זריז | ||
| XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| נתרן אזיד | סיגמא-אולדריץ' | S2002 |
מקורות
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
