מאמר שיטה

שימוש בפני הפנים הללו Immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות

DOI:

10.3791/59325

⸱

20 באוגוסט 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Institute of Cardiovascular Diseases, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לצביעת התאים. האנדותל של בית העורקים של העכבר ישירות טכניקה זו שימושית כשאתה לומד את הפנוטיפים הסלולאריים והמולקולריים של תאי האנדותל בדפוסי זרימה שונים ובפיתוח טרשת עורקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים משתנים בעזרת המבנה האנדותל והורפולוגיה נחשבים לאירועים ראשוניים בפתוגנזה של טרשת עורקים. התבוננות ישירה של האנדותל ללא שינוי תספק מידע רב ערך להבנת האירועים הסלולאריים והמולקולריים בתאי האנדותל הלקוי. כאן, אנו מתארים שונה en הפנים אימונוofor, מכתים הטכניקה המאפשרת למדענים לקבל תמונות ברורות של משטח האנדותל שלמים ולנתח את דפוסי ביטוי המולקולה באתרו. השיטה היא פשוטה ואמינה להתבוננות במערך האנדותל השלמה באתרים שונים של העורקים. טכניקה זו עשויה להיות כלי מבטיח להבנת הפתופסולוגיה של טרשת עורקים, במיוחד בשלב מוקדם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השינויים המוקדמים בכלי הקיבול מפעילים בעיקר את האנדותל, המתפקד כמכשול סלקטיבי בין הדם לקיר הכלי עם הjunctional מתחמים1. ראיות משמעותיות מצביעות על תפקיד קריטי עבור ההשפעות המכאניות של זרימת הדם בפונקציה אנדותל מודולאל2. נוזל הטיית מתח, כוח מתפורר שנוצר על ידי זרימת הדם, צורות דיפרנציאלי של תא מורפולוגיה ותפקוד, בהתאם לתבניות הזרימה הספציפיות באתרי כלי דם שונים2,3. נגעים טרשת עורקים המועדפת מתרחשים באתרים של זרימת דם מופרעת (d-זרימה), כגון כלי עקמומיות, מפרידי זרימה, נקודות הסתעפות, לעומת אזורים של זרימה יציבה (s-flow), כגון קטע ישר של העורק. לפיכך, התבוננות ישירה בדפוסי הביטוי ובביטויים של המולקולה צריכה לספק תובנות חשובות לפנוטיפים הקונסטרוקטיבי והפונקציונליים של תאי האנדותל באמצעות תבניות זרימה משתנות.

תאים אנדותל מתורבת לא יכול לבטא את הפנוטיפים בפועל כפי שהם עושים ב vivo בחלקו עקב אובדן ההשפעה של מתח להטות את הנוזלים, ציטוקינים המקיפים, תא תא או אינטראקציות תא מטריצה. כדי לסייע בכך, ניתן לחקור את המונאולייר השלם של תא האנדותל בסעיפים רוחבי באמצעות אימונוהיסטוכימיה קלאסית. עם זאת, מונאולייר האנדותל הוא כה דק ושברירי שבדרך כלל לא ניתן להבחין בו בבהירות. En הפנים אימונוהיסטוכימיה שימש להתבונן במשטח הפנימי של האנדותל אבל הוא מסובך או בלתי יציב בתוצאותיה, כי האנדותל הוא הסיר בקלות מן הרקמה הבסיסית, או רק חלק של קיר העורקים של חולדות או ארנבים, הקירות שלהם עבים, מותקן4,5.

לדגמי עכבר יש יתרונות ניכרים על פני בעלי חיים אחרים במובנים רבים. כאן, אנו מעסיקים שונה en הפנים הטכניקה החיסונית לנתח את תאי האנדותל של קשת אבי העורקים ואת בית האבי החזה ב C57BL/6 העכבר. טכניקה כזאת שימש רבות כדי לחקור את האנדותל הפתופסולוגיה בדפוסי זרימה שונים ובפיתוח של טרשת עורקים6,7,8,9,10. שיטה זו מאפשרת למדענים להתבונן בכל פני השטח של האנדותל באופן ברור ולהשוות את דפוסי הביטוי של חלבון מסוים באזורים מתחת למתחים שונים של הטיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ניסויי החיות נערכו בהתאם לפרוטוקולים הניסיוניים שאושרו על-ידי הוועדה למשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת ג'יאו טונג שאנגחאי.

1. perfusion של העורקים של העכבר

  1. בקצרה, להפחית 12-שבוע בן C57BL/6 עכברים עם זריקות תוך הצפק של נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג משקל גוף). אשר בעדינות את הזנב מההרדמה.
    הערה: אם לא נצפתה תנועה, החיה מורדם במידה מספקת כדי להתחיל בניסויים.
  2. להקליט את כפות העכבר לערימת מגבות נייר עם קלטות דבק.
  3. להחזיק את העור של העכבר עם מלקחיים ולחתוך את העור עם זוג מספריים מהבטן אל החלק העליון של בית החזה.
  4. פתח את חלל הבטן מתחת לצלעות עם זוג מספריים חדים.
  5. הרם את עצם החזה עם מלקחיים וחתוך את הסרעפת; אז, לחתוך את הצלעות כדי לחשוף את חלל החזה.
  6. , תחתוך את הוריד-כרוב מעל הכבד. עם מספריים
  7. מבשם הלחץ (100 mmHg) עץ העורקים עבור 5 דקות עם מלוחים רגיל מקורר המכיל 40 יחידות/mL הפרין דרך החדר השמאלי עד הריאות והכבד להיות חיוור. לאחר מכן, מבשם עם מקורר 4% פאראפורמלדהיד ב פוספט מאגור מלוחים (PBS, pH 7.4) עבור 3 דקות.
  8. הסירו את כל השרירים, האיברים. והשומן עד שהעורקים ייחשפו
  9. הניחו את העכבר תחת מיקרוסקופ מבתר.

2. חיתוך ופתיחה longitudinally של העורקים

  1. לחשוף את העורקים בבירור תחת מיקרוסקופ מבתר ולהסיר את רקמות החיבור לאורך העורקים נקי ככל האפשר, עם מלקחיים עדינים זוג מספריים עדינים (איור 1).
  2. לנתח את העורקים הבית החזה מהלב אל הגזע הקלבאני עם זוג מספריים עדינים ולשים את העורקים לתוך הצלחת התרבות 6 ס מ תאים עם PBS. לחתוך לפתוח את העורקים longitudinally, לאורך העקומה הפחותה, ולאורך העקומה יותר עד מקטע ישר מתקיים. לחתוך לפתוח את שלושת הענפים של קשת אבי העורקים, כולל המנות, שמאל העורק המשותף והעורק השמאלי של ריחי עם מיקרו מספריים, כפי שמוצג באיור 2.

3. טיפול מקדים וכתמים של העורקים

  1. לחדור את העורקים עם 0.1% polyoxyethylene האתר של החברה ב PBS עבור 10 דקות ולחסום אותו עם 10% סרום עז רגיל מלוחים באגירה טריס (TBS) המכיל 2.5% polysorbate 20 עבור 1 h בטמפרטורת החדר בלוח 12-היטב תרבות התא.
  2. בשלב הבא, מודדת את העורקים עם 5 ג ' והארנב נגד ומטה-VCAM-1 ו-5 העכברוש g/mL anti-VE-cadherin רין במאגר חסימת, לילה ב 4 ° c.
  3. לאחר שטיפה לדוגמה 3x עם פתרון כביסה (TBS המכיל 2.5% polysorbate 20), להחיל את הנוגדנים בעלי מסגרת פלואורסצנטית משני (1:1000 דילול, אלקסה Fluor 555-התווית אנטי ארנבת IgG ו אלקסה Fluor 488-מתויג אנטי עכברוש IgG) עבור 1 h בחדר טמפרטורה. לשטוף את 3x בפתרון כביסה.
  4. להכתים את אבי העורקים עם 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) (1 μg/mL) עבור 10 דקות ולשטוף אותו 3x בפתרון כביסה.

4. הרכבה של העורקים על מגלשת הזכוכית

  1. מניחים את העורקים על שמיכות עם משטח הלומיאל כלפי מטה ולהעביר אותו לאט לפתרון ההרכבה אנטי לדעוך בעבר ירד על הכיסויים. מתחו בעדינות את העורקים. כדי לשמור על הדגימה שטוחה
  2. , הפוך את הסרבל. והניח אותו על הזכוכית הטיפול חייב להילקח כדי לא לאפשר בועות אוויר להישאר בין הדגימה לבין הזכוכית.

5. תצפית על העורקים

  1. בדקו את העורקים עם מיקרוסקופ. ממוקד לסריקת לייזר
  2. לנתח עוצמות צבע של ערוצים שונים מהאזור הרצוי בתמונות הפנים en עם תוכנת תמונה-Pro Plus.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העכבר בן 12 שבועות C57BL/6 מורדמים ומכיל עם תמיסת מלח רגיל המכיל 40 יחידות/mL הפארין ולאחר מכן, מקורר 4% פאראפורמלדהיד. העורקים של העכבר נחשף תחת מיקרוסקופ מבתר (איור 1), גזור, גזור longitudinally פתוח (איור 2). En הפנים אימונוofor, כתמים של התאים כלי הדם האנדותל בוצעה כמודגם באיור 3 ושולחן 1. En הפנים אימונוoforas של מכשיר דם הדבקה של חלבון -1 (VCAM-1) ביטוי עם VE-קדהרין כמו סמן אנד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האנדותל חשוף לגורמים רבים, הכוללים שומנים, מגשרים דלקתיים ונוזלים מדגישים1,11,12. התבוננות ישירה בתאי האנדותל באתרו מספקת את היתרונות המיוחדים לניתוח שינויים במבנה התאים, הצמתים הבינתאיים ודפוסי ביטוי המולקולה בתגובה לגירוי הפציעה.

מחקרים קודמים סיפקו שני שונים בפנים שונות אימונוהיסטוכימיים טכניקות כדי לבחון את האנדותל של קיר העורקים4,5. האחת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה היה נתמך על ידי הקרן הלאומית המדע הטבעי של סין (גרנט No. 81670451, 81770430), התוכנית העולה סטאר של שנגחאי (גרנט 171403000), והוועדה לטכנולוגיה מדע של הממשלה העירונית של שנגחאי (גרנט לא. 14441903002, 15411963700).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תושבת נגד דהייהServicebioG1401
מלקחיים עדיניםRWD מדעי החייםF11001-11
מספריים עדיניםRWD מדעי החייםS12003-09
מלקחיים לניתוחRWD מדעי החייםF12005-10
Mciro מספריים קפיצייםRWD מדעי החייםS11001-08
פוליאוקסיאתילן אוקטיל פניל אתר (טריטון X-100)אמרסקוM143
פוליסורבט 20 (שלישי 20)אמרסקו0777
VCAM-1 נוגדןAbcamab134047
נוגדן VE-CadherinBD Biosciences555289
Alexa Fluor 555 מסומן נגד ארנב IgGinvitrogenA-31572
Alexa Fluor 488 מסומן אנטי-חולדות IgGinvitrogenA-21208
מיקרוסקופ סריקת לייזר קרל זייס

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
  2. Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
  3. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  4. Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
  5. Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
  6. Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000(2013).
  7. Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346(2014).
  8. Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
  9. Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
  10. Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
  11. Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
  12. Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
  13. Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VCAM 1VE CadherinDAPIAtherosclerosis

מאמרים קשורים