חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות Ex-Vivo Confocal מיקרוסקופ

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לתמונה אוכלוסיות תאים שונות בבלוטות לימפה ניקוז ללא שינויים במבנה האיברים.

Abstract

בלוטות הלימפה (LNs) הם איברים התפשטות בתוך הגוף, שם התגובות החיסונית מולדים יכול להתחבר עם חסינות אדפטיבית. למעשה, LNs הם משולבת אסטרטגית בנתיב של כלי הלימפה, המאפשר מגע אינטימי של אנטיגנים רקמות עם כל התאים החיסוניים הקבועים ב-LN. כך, הבנת הרכב הסלולר, הפצה, מיקום ואינטראקציה באמצעות לשעבר vivo הדמיה מלאה יוסיף לידע על איך הגוף מתאם תגובות החיסון המקומי מערכתית. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיה הדמיה vivo ex בעקבות בניהול vivo של נוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט המאפשר מתודולוגיה מאוד מאוד וקלה לביצוע באמצעות קונפוקלית יקרוסקופים קונבנציונאלי ו ריאגנטים מניות. באמצעות הזרקה תת עורית של נוגדנים, ניתן לתייג אוכלוסיות תאים שונות בניקוז LNs מבלי להשפיע על מבני רקמות שעלולים להיפגע על ידי טכניקה מיקרוסקופית החיסונית קונבנציונאלי.

Introduction

בלוטות הלימפה (LNs) הם איברים בצורת ovoid הנוכחי ברחבי הגוף עם הפונקציה הקריטית של גישור התגובות החיסונית מולדים ואדפטיבית. LNs לסנן את הלימפה כדי לזהות חלקיקים זרים ותאים סרטניים כדי לטעון תגובה חיסונית נגדם¹. אנטיגן הצגת תאים (APCs), תאים T ו-B תאים לעבוד לצד ליצור אנטיגן ספציפי נוגדנים (חסינות הומאתית) ו ציטוטוקסיקס לימפוציטים (חסינות הסלולר) כדי לחסל את החלקיקים הזר תאים סרטניים². כך, הבנת הדינמיקה של התאים החיסוניים נוכח במערכת הלימפה יהיו השלכות חשובות על פיתוח החיסון וחיסוני סרטן.

הופעתו של מיקרוסקופים חזק-כולל קונפוקלית וקד חדש ומיקרוסקופים רזולוציה סופר-אפשרה התקדמות יוצאת דופן בהבנת ....

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת העמידה על בעלי חיים בבית הספר לרפואה של הרווארד ובריגהם ובית החולים לנשים, פרוטוקול 2016N000230.

1. עכברים המשמשים לניסוי

1. שימוש 8-שבוע עכברים זכר ונקבה על רקע B6 לניהול תערובת נוגדן.
2. השתמש CX3CR1^Gfp/wtCCR2^rfp/wt עכברים כדי לקבוע אם לשעבר vivo שלם הדמיה בתוך יכול להיות גם להחיל על עכברי כתבת ללא מתן שילוב נוגדן, כמו גם כדי לחקור את הנוכחות של תאים mon, כולל אנטיגן הצגת תאים ו phagocytes, ואת התפוצה שלהם ב-LN.
   הערה: CX3CR1^Gfp/wtCCR2^RFP/wt לעכברים כתבת יש חלבון פלורסנט ירוק (gfp) ו חלבון פלורסנט אדום (rfp) הוכנס תחת השליטה של CX3CR1 ו CCR2 יזמים, בהתא....

Results

כתב יד זה מראה טכניקות כדי להסיר בלוטות לימפה ומבלי לפגוע במבנה שלהם בעקבות הזרקת נוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט כדי להכתים אוכלוסיות תאים מסוימות באיברים אלה (איור 1 ואיור 2 ).

השילוב החזק של האימונויניום של תאי LN עם BV421 anti-CD4 ו BB515 anti-CD19 ו הדמיה מיקוד ניתוח הגדיר את הלוקליזציה של תאי T (CD4 +) ו B תאים (CD19 +) ב אינלירינל ו popliteal LNs. בשני האברים, התאים מוקפים באוכלוסיית תאי T (איור 3,.......

Discussion

השילוב של הדמיה עם טכניקות אחרות, כולל ביולוגיה מולקולרית מימדי החיסונית גבוהה החיסון הגדילו את היכולת שלנו לחקור את התאים החיסוניים בהקשר המקורי שלהם. למעשה, בעוד גישות אחרות עשויות לדרוש עיכול רקמות ובידוד התא – אשר יכול להוביל לאובדן שלמות רקמות-השימוש ב vivo או ex הדמיה vivo מעניקה יתרון גדול בחקירת תת סוגים שונים בצורה גיאוגרפית^{3 , 16}. זה לא מפתיע כי הזמינות של זנים העכבר מהונדסים גנטית שבו תאים מיועדים במיוחד fluorophores שונים הוא גדל במהירות. חשוב מכך, שי.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 מ"ג mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 מ"ג mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ בקרת איזוטיפ	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 מ"ג מ"ל-1
>BV421 עכבר IgG2b, K בקרת איזוטיפ	BD Horizon		562603 R35-38 0.2 מ"ג מ"ל-1
Cellview צלחת תרבית	Greiner-Bio	627861	35x10 מ"מ עם תחתית זכוכית
מזרקי אינסולין	BD פלסטיפאק-אינסולין		U-100
Kimwipes	מותג המדע Kimtech	7557	גודל 21 x 20 ס"מ / 100 גיליונות לקופסה
מיקרוכירורגיה מלקחיים מעוקלים	WEP מכשירים כירורגיים	בהתאמה אישית	12.5 ס"מ
מספריים מעוקלים מיקרו-כירורגיה	WEP מכשירים כירורגיים	בהתאמה אישית	11.5 ס"מ
מחט	BD PrecisionGlide-30		מד וזמנים; ½ אינץ'
ניקון Eclipse Te + A1R ראש קונפוקלי	ניקון	-	טעון ב-4 קווי לייזר עיקריים (405, 488, 543 ו-647 ננומטר)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 מ"ג mL-1
PE Rat IgG2a, κ בקרת איזוטיפ	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 מ"ג mL-1
Zeiss LSM 710 מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeiss		טעון ב-4 קווי לייזר עיקריים (405, 488, 543 ו-647 ננומטר)