פרוטוקול זה מתאר טכניקה לתמונה אוכלוסיות תאים שונות בבלוטות לימפה ניקוז ללא שינויים במבנה האיברים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות Ex-Vivo Confocal מיקרוסקופ
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
בלוטות הלימפה (LNs) הם איברים התפשטות בתוך הגוף, שם התגובות החיסונית מולדים יכול להתחבר עם חסינות אדפטיבית. למעשה, LNs הם משולבת אסטרטגית בנתיב של כלי הלימפה, המאפשר מגע אינטימי של אנטיגנים רקמות עם כל התאים החיסוניים הקבועים ב-LN. כך, הבנת הרכב הסלולר, הפצה, מיקום ואינטראקציה באמצעות לשעבר vivo הדמיה מלאה יוסיף לידע על איך הגוף מתאם תגובות החיסון המקומי מערכתית. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיה הדמיה vivo ex בעקבות בניהול vivo של נוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט המאפשר מתודולוגיה מאוד מאוד וקלה לביצוע באמצעות קונפוקלית יקרוסקופים קונבנציונאלי ו ריאגנטים מניות. באמצעות הזרקה תת עורית של נוגדנים, ניתן לתייג אוכלוסיות תאים שונות בניקוז LNs מבלי להשפיע על מבני רקמות שעלולים להיפגע על ידי טכניקה מיקרוסקופית החיסונית קונבנציונאלי.
מבוא
בלוטות הלימפה (LNs) הם איברים בצורת ovoid הנוכחי ברחבי הגוף עם הפונקציה הקריטית של גישור התגובות החיסונית מולדים ואדפטיבית. LNs לסנן את הלימפה כדי לזהות חלקיקים זרים ותאים סרטניים כדי לטעון תגובה חיסונית נגדם1. אנטיגן הצגת תאים (APCs), תאים T ו-B תאים לעבוד לצד ליצור אנטיגן ספציפי נוגדנים (חסינות הומאתית) ו ציטוטוקסיקס לימפוציטים (חסינות הסלולר) כדי לחסל את החלקיקים הזר תאים סרטניים2. כך, הבנת הדינמיקה של התאים החיסוניים נוכח במערכת הלימפה יהיו השלכות חשובות על פיתוח החיסון וחיסוני סרטן.
הופעתו של מיקרוסקופים חזק-כולל קונפוקלית וקד חדש ומיקרוסקופים רזולוציה סופר-אפשרה התקדמות יוצאת דופן בהבנת ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול אושר על ידי ועדת העמידה על בעלי חיים בבית הספר לרפואה של הרווארד ובריגהם ובית החולים לנשים, פרוטוקול 2016N000230.
1. עכברים המשמשים לניסוי
- שימוש 8-שבוע עכברים זכר ונקבה על רקע B6 לניהול תערובת נוגדן.
- השתמש CX3CR1Gfp/wtCCR2rfp/wt עכברים כדי לקבוע אם לשעבר vivo שלם הדמיה בתוך יכול להיות גם להחיל על עכברי כתבת ללא מתן שילוב נוגדן, כמו גם כדי לחקור את הנוכחות של תאים mon, כולל אנטיגן הצגת תאים ו phagocytes, ואת התפוצה שלהם ב-LN.
הערה: CX3CR1Gfp/wtCCR2RFP/wt לעכברים כתבת יש חלבון פלורסנט ירוק (gfp) ו חלבון פלורסנט אדום (rfp) הוכנס תחת השליטה של CX3CR1 ו CCR2 יזמים, בהתא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כתב יד זה מראה טכניקות כדי להסיר בלוטות לימפה ומבלי לפגוע במבנה שלהם בעקבות הזרקת נוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט כדי להכתים אוכלוסיות תאים מסוימות באיברים אלה (איור 1 ואיור 2 ).
השילוב החזק של האימונויניום של תאי LN עם BV421 anti-CD4 ו BB515 anti-CD19 ו הדמיה מיקוד ניתוח הגדיר את הלוקליזציה של תאי T (CD4 +) ו B תאים (CD19 +) ב אינלירינל ו popliteal LNs. בשני האברים, התאים מוקפים באוכלוסיית תאי T (איור 3,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השילוב של הדמיה עם טכניקות אחרות, כולל ביולוגיה מולקולרית מימדי החיסונית גבוהה החיסון הגדילו את היכולת שלנו לחקור את התאים החיסוניים בהקשר המקורי שלהם. למעשה, בעוד גישות אחרות עשויות לדרוש עיכול רקמות ובידוד התא – אשר יכול להוביל לאובדן שלמות רקמות-השימוש ב vivo או ex הדמיה vivo מעניקה יתרון גדול בחקירת תת סוגים שונים בצורה גיאוגרפית3 , 16. זה לא מפתיע כי הזמינות של זנים העכבר מהונדסים גנטית שבו תאים מיועדים במיוחד fluorophores שונים הוא גדל במהירות. חשוב מכך, שי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי ה-NIH (R01 AI43458 to H.L.W.).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 מ"ג mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 מ"ג mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ בקרת איזוטיפ | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 מ"ג מ"ל-1 |
| >BV421 עכבר IgG2b, K בקרת איזוטיפ | BD Horizon | 562603 R35-38 0.2 מ"ג מ"ל-1 | |
| Cellview צלחת תרבית | Greiner-Bio | 627861 | 35x10 מ"מ עם תחתית זכוכית |
| מזרקי אינסולין | BD פלסטיפאק-אינסולין | U-100 | |
| Kimwipes | מותג המדע Kimtech | 7557 | גודל 21 x 20 ס"מ / 100 גיליונות לקופסה |
| מיקרוכירורגיה מלקחיים מעוקלים | WEP מכשירים כירורגיים | בהתאמה אישית | 12.5 ס"מ |
| מספריים מעוקלים מיקרו-כירורגיה | WEP מכשירים כירורגיים | בהתאמה אישית | 11.5 ס"מ |
| מחט | BD PrecisionGlide-30 | מד וזמנים; ½ אינץ' | |
| ניקון Eclipse Te + A1R ראש קונפוקלי | ניקון | - | טעון ב-4 קווי לייזר עיקריים (405, 488, 543 ו-647 ננומטר) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 מ"ג mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ בקרת איזוטיפ | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 מ"ג mL-1 |
| Zeiss LSM 710 מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | טעון ב-4 קווי לייזר עיקריים (405, 488, 543 ו-647 ננומטר) |
מקורות
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
