חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות Ex-Vivo Confocal מיקרוסקופ

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לתמונה אוכלוסיות תאים שונות בבלוטות לימפה ניקוז ללא שינויים במבנה האיברים.

Abstract

בלוטות הלימפה (LNs) הם איברים התפשטות בתוך הגוף, שם התגובות החיסונית מולדים יכול להתחבר עם חסינות אדפטיבית. למעשה, LNs הם משולבת אסטרטגית בנתיב של כלי הלימפה, המאפשר מגע אינטימי של אנטיגנים רקמות עם כל התאים החיסוניים הקבועים ב-LN. כך, הבנת הרכב הסלולר, הפצה, מיקום ואינטראקציה באמצעות לשעבר vivo הדמיה מלאה יוסיף לידע על איך הגוף מתאם תגובות החיסון המקומי מערכתית. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיה הדמיה vivo ex בעקבות בניהול vivo של נוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט המאפשר מתודולוגיה מאוד מאוד וקלה לביצוע באמצעות קונפוקלית יקרוסקופים קונבנציונאלי ו ריאגנטים מניות. באמצעות הזרקה תת עורית של נוגדנים, ניתן לתייג אוכלוסיות תאים שונות בניקוז LNs מבלי להשפיע על מבני רקמות שעלולים להיפגע על ידי טכניקה מיקרוסקופית החיסונית קונבנציונאלי.

Introduction

בלוטות הלימפה (LNs) הם איברים בצורת ovoid הנוכחי ברחבי הגוף עם הפונקציה הקריטית של גישור התגובות החיסונית מולדים ואדפטיבית. LNs לסנן את הלימפה כדי לזהות חלקיקים זרים ותאים סרטניים כדי לטעון תגובה חיסונית נגדם¹. אנטיגן הצגת תאים (APCs), תאים T ו-B תאים לעבוד לצד ליצור אנטיגן ספציפי נוגדנים (חסינות הומאתית) ו ציטוטוקסיקס לימפוציטים (חסינות הסלולר) כדי לחסל את החלקיקים הזר תאים סרטניים². כך, הבנת הדינמיקה של התאים החיסוניים נוכח במערכת הלימפה יהיו השלכות חשובות על פיתוח החיסון וחיסוני סרטן.

הופעתו של מיקרוסקופים חזק-כולל קונפוקלית וקד חדש ומיקרוסקופים רזולוציה סופר-אפשרה התקדמות יוצאת דופן בהבנת איך אוכלוסיות שונות תאים החיסונית להתנהג בסביבה הטבעית שלהם³. עכשיו זה אפשרי תמונה מספר סוגי תאים בו באמצעות שילוב של רגשים עם עכברים מהונדסים גנטית לבטא חלבונים פלורסנט תחת שליטה של יעדים ספציפיים^4,5. למעשה, טכניקות ממדיות גבוהות, כולל cy, המוני וניתוחי זרימה רב-פרמטרית היו חיוניים להרחבת הידע שלנו על מידור תאים חיסוניים שונה ופונקציונליות בבריאות ובמחלות^{6, 7}. עם זאת, כדי להכין דגימות עבור טכניקות אלה, רקמות צריך עיכול ותאים מופרדים מתוך הסביבה הטבעית שלהם להיות מנותח בתא השבולים. כדי להתעלות על מגבלות אלה ולאפשר תרגום טוב יותר בביולוגיה, המטרה של הפרוטוקול המוצע כאן היא להחיל מתודולוגיה ישירה על התמונה לשעבר vivo בלוטות הלימפה כולו באמצעות קונפוקלית מניות מיקרוסקופים עם היתרון של מהירות משופרת, רקמה שימור המבנה והכדאיות התאית בהשוואה למספר החיסונית הקונבנציונלי. באמצעות גישה זו, הצלחנו להראות כי עכברים לקוי עבור γδ T תאים, סוג של לימפוציטים T מעורב ההגנה המוקדמת מוקדם נגד פתוגנים⁴, יש להתפשר זקיקי ו תא T אזורי לעומת עכברים סוג פראי. ממצאים אלה אפשרו לנו להמשיך במחקר שבו הדגמנו כי תאים γδ T לשחק תפקיד קריטי הומאוסטזיס של איברי הלימפה ותגובה חיסונית ומוראלית⁴. יתר על כן, פרוטוקול זה מספק מסלול פיזיולוגי עבור הבדיקות והנוגדנים כדי להגיע לצומת הלימפה, כפי שהם מנוהלים תת-עורי ומתפזר באמצעות זרימת הלימפה ברקמות, בנייה על דוחות הקודם המשמשים באתרו תיוג עם נוגדנים כדי להמחיש מבנים הקשורים לימפטי^8,9, מרכז מונ, דינמיקה^10,11,12, ומטרות נגישים בקלות כדי זרימת הדם^{13 ,14,15}.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת העמידה על בעלי חיים בבית הספר לרפואה של הרווארד ובריגהם ובית החולים לנשים, פרוטוקול 2016N000230.

1. עכברים המשמשים לניסוי

1. שימוש 8-שבוע עכברים זכר ונקבה על רקע B6 לניהול תערובת נוגדן.
2. השתמש CX3CR1^Gfp/wtCCR2^rfp/wt עכברים כדי לקבוע אם לשעבר vivo שלם הדמיה בתוך יכול להיות גם להחיל על עכברי כתבת ללא מתן שילוב נוגדן, כמו גם כדי לחקור את הנוכחות של תאים mon, כולל אנטיגן הצגת תאים ו phagocytes, ואת התפוצה שלהם ב-LN.
   הערה: CX3CR1^Gfp/wtCCR2^RFP/wt לעכברים כתבת יש חלבון פלורסנט ירוק (gfp) ו חלבון פלורסנט אדום (rfp) הוכנס תחת השליטה של CX3CR1 ו CCR2 יזמים, בהתאמה. עכברים עיתונאי ניתן להשתמש עם או בלי ההזרקה של ערבוב הנוגדן. אנא ראה התייחסות⁴ להזרקה לערבב נוגדן בעכבר עיתונאי. המשך לניתוח אם לא ייזרקו נוגדן.

2. הכנה לערבוב הנוגדן והזרקה

הערה: בצע את השלבים הבאים על עכברים שתוארו בשלב 1.1.

1. לדלל 1:10 של סגול מבריק (BV) 421 anti-CD4 (gk 1.5; 0.2 mg/ml), 1:10 של כחול מבריק (BB) 515 anti-CD19 (1d3; 0.2 mg/mL) ו-1:20 של phycoארימתרין (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0.2 mg/mL) ב PBS עם הנפח הסופי המתאים להזריק לתוך הירך הפנימית (כדי ל התמונה אינרינרית) או לתוך משטח כף היד (כדי התמונה popliteal) הלימפה.
   הערה: השתמש בתור איזוסוגים: BV421 Mouse IgG2b, k בקרת Isotypes (R35-38; 0.2 mg/mL); PE עכברוש IgG2a, κ בקרת איזוטיפ (R35-95; 0.2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, κ בקרת איזוטיפ (R35-95; 0.2 מ"ג/mL). אם שינוי הנוגדן מכתים, השתמש בסוג isotype נכון.
2. כדי להפוך את התמונה בפנים, להזריק 100 μL של שילוב הנוגדן תת-עורי לתוך הירך הפנימית (איור 1A). לחילופין, הכנס 50 μL תת-עורי של מיקס נוגדן לתוך משטח כף היד לתמונה popliteal LN (איור 2A). השתמש עדין 1 mL מזרקים אינסולין, (אינסולין U-100) עם מחט של גודל 0.30 mm × 13 מ"מ (30 מד × 1/2 אינץ).
   הערה: ודא שהזריקה לצביעת הפנים היא תת-עורית ולא מתוך שרירי (הודעה), כמו ערבוב נוגדנים לא יירוקנו כראוי אם מנהל הודעה מבוצע.
3. אל להרדמה בעלי חיים לפני הזרקת נוגדן ערבוב.
4. המתן עד למינימום של 3 שעות (משנה dLN) ו-12 h (popliteal dLN) הזרקת הודעה כדי להסיר את האיברים.
5. אם התיוג בתא אינו נצפה לחלוטין באמצעות צבעי פלורסנט גדולים כגון סגול מבריק או כחול מבריק, השתמש fluorophores קטן יותר, כולל fluorescein isothiocyanate (FITC), PE ו allophycocyanin (APC) כחלופה.

3. הליך הניתוח כדי להסיר את הצומת הלימפה הניקוז

1. המתת חסד באמצעות שיתוף₂ חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.
2. לשתק עכברים על הבמה אקריליק עם דבק ולהחיל שמן מינרלי עם מספוגית כותנה לעור הבטן כדי למנוע התצהיר פרווה סביב החתך (איור 1B). אין צורך בהסרת פרווה.
3. לבצע חתך באמצע הדרך באמצעות מספריים מעוקל מיקרו (11.5 ס מ) ו מלקחיים מעוקל מיקרו (12.5 ס מ) בבטן מן הערווה לתהליך xiphoid (איור 1C).
4. הנתק את השרירים הבטני מהעור (איור 1D).
5. הפוך את העור חתכים אופקיים בחלק העליון והתחתון של קו החתך האנכי כדי ליצור מדפים העור בצד של עניין (על פי הצד של הזרקת הנוגדן לערבב) והכנף את העור כדי להמחיש את הצומת לימפה (איור 1E).
6. מקליט את העור על צלחת אקריליק (איור 1F).
7. להסיר את הצומת הלימפה הניקוז להסרת המוח באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרו (איור 1F). הלימפה יופיע כמו בצבע, בדרך כלל בלהה, כדור מתחת לעור.

4. הליך ניתוח כדי להסיר את הצומת ניקוז לימפה popliteal

1. המתת חסד באמצעות שיתוף₂ חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.
2. לשתק עכברים במצב נוטה על הבמה אקריליק עם דבק ולהחיל שמן מינרלי עם מבער כותנה בעגל ובברך (איור 2א-ד).
3. לבצע חתך באמצע קו בעגל מן העקב אל הברך (איור 2E, F).
4. הנתק את שרירי השרירים של העגל מהעור (איור 2F, G).
5. לחשוף את הפוסות פוקליטיל (איור 2G). בלוטות הלימפה של פופטיל. תופיע ככדור שחור בפוסות הפויבטיל
6. הסר את הצומת הלימפה popliteal באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרו (איור 2G).
7. לחילופין, להפוך את העכבר מעל מיקום פרקדן, ולהתקרב לפוסה popliteal בין שרירי הזרוע והsemitendinosus עבור הסרת popliteal ב ידי ביצוע חתך באמצע הדרך בעגל מן העקב אל הברך ואחריו הדיסוציאציה של העגל שרירים מהעור
   הערה: פוליטיל פוסות הוא דיכאון רדוד הממוקם בחלק האחורי של מפרק הברך. פתח בקפידה כדי לראות את הצומת לימפה popliteal.

5. הכנת צומת לימפה

1. מניחים את כל האיבר בצלחת תרבות עם תחתון זכוכית (35 מ"מ x 10 מ"מ) ולהסיר את השומן המקיף את האיבר באמצעות מלקחיים מעוקל מיקרו (איור 1G-I ואיור 2h).
2. מרכז את האיבר באמצע המנה (איור 1J ואיור 2h).
3. כסו את העוגב בחלק מחלונות המשימה העדינים ושמרו אותו רטוב עם טמפרטורת החדר מלוחים 0.9% או תמיסת פוספט מאגר (איור 1K-M ואיור 2h).
   הערה: אין צורך לשטוף בלוטות הלימפה לאחר ההסרה או לבצע את החילוץ הלימפה במכסה המנוע.

6. vivo לשעבר-מיקרוסקופ קונסקופיה (הדמיה)

1. מקמו את צלחת פטרי בחריץ המיקרוסקופ ההפוך הפוך (איור 1N ואיור 2h).
2. Lns תמונה תחת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (איור 1o ואיור 2h).
3. ראשית, לקבל את המוקד הנכון באמצעות אור קונבנציונאלי של המיקרוסקופ קונפוקלית עם המטרה 4x או 10x. לאחר מכן לשנות מפונקציית האור למצב לייזר.
   הערה: אם המיקרוסקופ קונפוקלית לא מכיל מטרה 4x, המוקד יכול להיות מושגת באופן מושלם באמצעות המטרה 10x.
4. כוונן את כוח הלייזר, היסט והרווח באמצעות מדגם isotype, שאינו מוכתם או שאינו פלורסנט (טבלה 1) כדי להסיר מכתמים אוטומטיים וכתמים לא ספציפיים מנוגדנים המסומנים ב-פלורסנט כגון אלה המשמשים בתמונות הראו ב כתב יד (BV-421 anti-CD4, BB515 אנטי-CD19 ו-PE anti-F4/80).
5. כוונן את מיקומי ה- Z ו- XY , באמצעות מיקרומד ומרכבה, בהתאמה, על אזור העניין בצומת הלימפה.
6. לרכוש תמונות תחת 4 x, 10x ו 20x מטרות התמקדות מבנה LN והפצה סלולרית. השתמש בהגדרה 1024 x 1024-פיקסלים.
   הערה: השיגו חמש תמונות לפחות בתחומים שונים לכל מטרה לכל חיה.
7. לנתח תמונות באמצעות תוכנת תמונה כדי להפריד בין ערוצים, להוסיף קנה מידה וצבעים של עניין, ולשחזר תצוגה תלת-ממדית.

Results

כתב יד זה מראה טכניקות כדי להסיר בלוטות לימפה ומבלי לפגוע במבנה שלהם בעקבות הזרקת נוגדנים המסומנים על ידי פלורסנט כדי להכתים אוכלוסיות תאים מסוימות באיברים אלה (איור 1 ואיור 2 ).

השילוב החזק של האימונויניום של תאי LN עם BV421 anti-CD4 ו BB515 anti-CD19 ו הדמיה מיקוד ניתוח הגדיר את הלוקליזציה של תאי T (CD4 +) ו B תאים (CD19 +) ב אינלירינל ו popliteal LNs. בשני האברים, התאים מוקפים באוכלוסיית תאי T (איור 3,...

Discussion

השילוב של הדמיה עם טכניקות אחרות, כולל ביולוגיה מולקולרית מימדי החיסונית גבוהה החיסון הגדילו את היכולת שלנו לחקור את התאים החיסוניים בהקשר המקורי שלהם. למעשה, בעוד גישות אחרות עשויות לדרוש עיכול רקמות ובידוד התא – אשר יכול להוביל לאובדן שלמות רקמות-השימוש ב vivo או ex הדמיה vivo מעניקה יתרון גדול בחקירת תת סוגים שונים בצורה גיאוגרפית^{3 , 16}. זה לא מפתיע כי הזמינות של זנים העכבר מהונדסים גנטית שבו תאים מיועדים במיוחד fluorophores שונים הוא גדל במהירות. חשוב מכך, שי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 מ"ג mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 מ"ג mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ בקרת איזוטיפ	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 מ"ג מ"ל-1
>BV421 עכבר IgG2b, K בקרת איזוטיפ	BD Horizon		562603 R35-38 0.2 מ"ג מ"ל-1
Cellview צלחת תרבית	Greiner-Bio	627861	35x10 מ"מ עם תחתית זכוכית
מזרקי אינסולין	BD פלסטיפאק-אינסולין		U-100
Kimwipes	מותג המדע Kimtech	7557	גודל 21 x 20 ס"מ / 100 גיליונות לקופסה
מיקרוכירורגיה מלקחיים מעוקלים	WEP מכשירים כירורגיים	בהתאמה אישית	12.5 ס"מ
מספריים מעוקלים מיקרו-כירורגיה	WEP מכשירים כירורגיים	בהתאמה אישית	11.5 ס"מ
מחט	BD PrecisionGlide-30		מד וזמנים; ½ אינץ'
ניקון Eclipse Te + A1R ראש קונפוקלי	ניקון	-	טעון ב-4 קווי לייזר עיקריים (405, 488, 543 ו-647 ננומטר)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 מ"ג mL-1
PE Rat IgG2a, κ בקרת איזוטיפ	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 מ"ג mL-1
Zeiss LSM 710 מיקרוסקופ קונפוקלי	Zeiss		טעון ב-4 קווי לייזר עיקריים (405, 488, 543 ו-647 ננומטר)