ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

Summary

קולטן germinant אשכול חלבונים ב- 'germinosomes' בתוך הקרומית הפנימית של Bacillus subtilis נבגים. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כתב פלורסנט חלבונים כדי להמחיש germinosomes. הפרוטוקול מזהה החולקות הממברנה הפנימית נבג מוכתמים מעדיפים לצבוע הממברנה FM4-64.

Abstract

גודל קטן של נבגים שפע נמוכה יחסית של חלבונים נביטה, לגרום קשיים שלהם ניתוח מיקרוסקופי באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. סופר רזולוציה תלת מימדי מובנים תאורה מיקרוסקופ (3D-SIM) הוא כלי מבטיח כדי להתגבר על המכשול הזה ולחשוף את הפרטים מולקולרית של תהליך הנביטה של נבגים Bacillus subtilis (B. subtilis). כאן, אנו מתארים את השימוש SIMcheck שונה (ImageJ)-תהליך ההדמיה התלת-ממד עוזר וחלבונים פלורסנט כתב על ה-SIM מיקרוסקופיה של germinosomes B. subtilis נבגים, cluster(s) של חלבונים נביטה. אנו מציגים גם שגרה הדמיה תלת-ממד (רגיל)-SIM עבור FM4-64 מכתים של B. subtilis נבג ממברנות. באמצעות הליכים אלה, אנו להשיג רזולוציה מתחרות בלוקאליזציה germinosome ולהראות כי > 80% KGB80 B. subtilis נבגים רדום שהושג לאחר הנבגה באמצעי MOPS מינימלי מוגדר יש אחד או שניים GerD-GFP, GerKB-mCherry מוקדים. מוקדים בהיר היו גם FM4 נצפתה ב- 64 צבעונית תמונות 3D-SIM של נבגים רומז כי הממברנה הפנימית השומנים תחומי סביר שונים נזילות קיימים. בהמשך לימודי המשתמשות כפול תיוג הליכים עם ממברנה צבע ו germinosome כתב חלבונים כדי להעריך משותף לשפות אחרות, ובכך לקבל סקירה אופטימלית של הארגון של חלבונים נביטה Bacillus ממברנה הנבג הפנימי נמצאים אפשרי.

Introduction

נבגים של ההוראות Bacillales ו- Clostridiales סמויה רדום ועמיד בצורה יוצאת דופן בפני משטרים טיהור קשים, אבל אלא אם כן הם לנבוט, לא יכול לגרום השפעות מזיקות של בני אדם¹. מזין germinant מופעלות נביטה של נבגים Bacillus subtilis (B. subtilis), הוא האירוע חניכה germinant קשירה לקולטנים germinant (GRs) הממוקם בקרום הפנימי של הנבג, (IM). לאחר מכן, GRs מגלי אותות אל החלבון ערוץ SpoVA ממוקם גם ההודעה. התוצאה היא תחילתה של חילופי נבג הליבה פירידין-2, 6-dicarboxylic (חומצה dipicolinic; DPA; הכוללת 20% של נבג הליבה יבש wt) עבור מים דרך תעלת SpoVA. לאחר מכן, מהדורת DPA מפעילה את ההפעלה של קליפת פפטידוגליקן הידרוליזה, ספיגת מים נוספת עוקב אחר^2,3,4. אירועים אלה להוביל ללחץ מכני על הרבדים המעיל, קרע העוקבים שלה, תחילתה של תוצר ו, לבסוף, גידול וגטטיבי. עם זאת, הפרטים המדויקים מולקולרית של תהליך הנביטה מזוהים עדיין רחוק.

שאלה גדולה לגבי נבג נוגע המאפיינים ביופיזיקלי של ליפידים המקיפים את החלבונים נביטה IM, כמו גם את החלבונים ערוץ IM SpoVA. זה במידה רבה משותק שכבה ליפידית אים היא המכשול העיקרי חדירות של מולקולות קטנות רבות, כולל משמרים כימיים רעילים, אשר חלקם מפעילים פעולתם במרכז נבג או תא וגטטיבית הציטופלסמה^5,6. אים שכבה ליפידית סביר במצב ג'ל, למרות שיש חלק משמעותי של ליפידים ניידים ב- IM⁵. אים של הנבג יש גם את פוטנציאל הרחבה משמעותית⁵. לפיכך, פני השטח של ההודעה מגדילה 1.6-fold על נביטה ללא ממברנה נוספים סינתזה מלווה אובדן זה קרום אופייני נמוכה חדירות ו ליפיד נייחות^5,6.

בעוד הפרטים מולקולרית של ההפעלה של חלבונים נביטה וארגון של ליפידים IM בנבגים הם נושאים אטרקטיביים למחקר, גודל קטן של B. subtilis נבגים והשפע נמוכה יחסית של חלבונים נביטה, להוות אתגר כדי ניתוח מיקרוסקופי. גריפיתס ואח ' epifluorescence מיקרוסקופ ראיות משכנעות, באמצעות עיתונאים פלורסנט התמזגו חלבונים נביטה, מרמז כי בנבגים B. subtilis החלבון לגרדום GerD מארגן שלושה גרם subunits (A, B ו- C) עבור גארה, B K GRs, ב- אשכול⁷. הם טבע את המונח 'germinosome' עבור מקבץ של חלבונים נביטה, תיאר את המבנים ~ 300 ננומטר גדול IM חלבון foci⁸. באתחול של נבג, germinosome פלורסנט foci בסופו של דבר הופך גדול יותר לפזר דפוסי פלורסנט, עם > 75% של אוכלוסיות ספורה מציג את הדפוס הזה בנבגים מונבטים לשעה עם-ואלין⁸. שימו לב כי העיתון הנ ל משמש בממוצע תמונות מתוך עשרות תמונות פלורסנט רצופים, כדי לצבור עוצמה סטטיסטית להתגבר על המשוכה של אותות פלואורסצנט נמוך ציין במהלך דימות. הדמיה זו של המבנים הללו בנבגים בקטריאלי הייתה בקצהו של מה זה אפשרי מבחינה טכנית עם כלים מיקרוסקופיים קלאסית, גם הערכה של כמות מוקדים ב נבג יחיד ולא היה שלהם לוקליזציה subcellular מפורט יותר אפשרי עם גישה זו.

. הנה, נדגים את השימוש של מובנים תאורה מיקרוסקופ (SIM) כדי להשיג פריט חזותי נתונים היסטוריים, כימות germinosome(s) בנבגים B. subtilis, כמו גם תחומים שלהם השומנים IM⁹. הפרוטוקול מכיל גם הוראות הנבגה, הכנת שקופית וניתוח התמונה על-ידי SIMcheck (v 1.0, תוסף imageJ) כמו גם ImageJ^10,11,12.

Protocol

1. subtillis דרב הנבגה (תזמון: 7 ימים לפני תצפית מיקרוסקופית)

1. יום 1
   1. פסים של התרבות חיידקי על צלחת (1% טריפטון תמצית שמרים 0.5%, 1% NaCl, 1% אגר) אגר לוריא-Bertani מרק (LB)¹³ , דגירה בין לילה ב 37 ° C כדי להשיג אחת המושבות. המתח (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry החתול, גרד-gfp קאן) KGB80 B. subtilis ולהשתמש שלה האב רקע זן B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) כפי שתואר לעיל⁷.
      הערה: השימוש של נבגים עם רקע ΔcotEΔgerE חיוני ב- germinosome ויזואליזציה, על מנת לצמצם את autofluorescence של שכבות המעיל⁷נבג.
   2. לעקר את כל אמצעי התקשורת, צינורות, pipets וחומרים נוספים תרבות כדי לשמש שיטות המתאימות.
2. יום 2
   1. לחסן שמושבה בודדת לתוך מ ל LB בינוני בשעות הבוקר המוקדמות, דגירה התרבות תחת עצבנות מתמדת בשפופרת פקקי בורג ב 200 סל"ד/min ו- 37 ° C עד ה OD₆₀₀ מגיע 0.3-0.4 (כ- 7 שעות).
   2. להפוך 500 מ"ל של המגבים בינוני (pH 7.5) המכיל 3 ננומטר (NH₄)₆מו₇O₂₄·4H₂O, 0.4 μM H₃בו₃, 30 nM CoCl₂·6H₂O, 10 nM CuSO₄·5H₂O, 10 ננומטר ZnSO₄·7H₂O, מ מ 1.32 K₂HPO₄, MgCl 0.4 מ מ₂·6H₂O, 0.276 מ מ K₂אז₄, 0.01 מ מ מכל₄·7H₂O, מ"מ 0.14 CaCl₂·2H₂O, 80 מ מ מגבים, מכשירי, 4 מ מ Tricine, MnCl 0.1 מ מ₂·2H₂O, 10 מ מ D-גלוקוז-monohydrate, ו 10 מ מ NH₄Cl.
   3. להכין בתוך צינורות 10 פקקי בורג^-1- 10^-7 דילולים טורי של התרבות LB ב 5 מ ל MOPS בינוני, דגירה התרבויות בין לילה תחת עצבנות רציפה ב 200 סל"ד/min ו- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: דילולים טורי שהוכנו כאן שואפים להשיג לדילול בשלב מעריכי מוקדם בבוקר הבא. שלב זה, השלב הבא נחוצים לאפשר את התאים להסתגל מדיום הגידול במאגר המגבים.
3. יום 3
   1. בחר באחת המגבים דילולים עם יתר₆₀₀ של 0.3-0.4. לחסן 0.2 מ"ל של התרבות ומחוממת מראש (37 מעלות) 20 מ של המגבים בינוני בבקבוקון חרוט 250 מ ל, דגירה תחת עצבנות מתמדת עד ה OD₆₀₀ מגיע 0.3-0.4 (~ 7 h).
   2. לחסן המדיום המבוססת על הנבגה מגבים (250 מ"ל) עם 1% (v/v) תרבות טרום מהשלב 1.3.1, תקופת דגירה של 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס בבקבוקון ליטר חרוט תחת עצבנות מתמדת. עבור FM4-64 מכתים PS4150 נבגים, להוסיף 2 µg/mL FM4-64 בדיקה (ראה טבלה של חומרים) ש בינוני 1 או 2 הנבגה לאחר שהגיע לשיא OD ערך₆₀₀ של גידול וגטטיבי (בדרך כלל כ 2) ולאפשר את תרבות לאחר מכן sporulate תוך כדי להגן עליה מפני אור⁵.
4. יום 7: קציר של נבגים
   1. לקבוע את התשואה הנבגה (נבגים vs וגטטיבי תאים) באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב בהגדלה X 100 כדי להבחין בין שלב הנבגים בהיר מתאי כהה שלב, כנראה שאינו בוגר נבגים. תשואה נבג בהיר 90% שלב צפוי.
   2. גלולה הנבגים ב x 4,270 g למשך 15 דקות ב 4 ° C התחתון עגול צנטריפוגה צינורות. רחץ בגדר נבג 2 - 3 פעמים עם 40 מיליליטר מים סטריליים סוג 1 demineralized אולטרה טהור צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מ ל (ראה טבלה של חומרים). ספין-מטה ברחיצת כל ב x 4,270 g למשך 15 דקות (4 ° C).
5. יום 7: נבג טיהור
   1. נבג כלים להשתמש טיהור: להשעות את צניפה נבג ב 750 µL של 20% nonionic צפיפות בינונית הדרגתי (ראה טבלה של חומרים) ולא להעמיס על 800 µL של 50% nonionic צפיפות בינונית הדרגתיות צינורות microcentrifuge מעוקר. צנטריפוגה עבור 60 דקות ב 21,500 x g. בגדר שהושג מכיל את הנבגים חינם. להשעות בגדר נבג ב 200 µL של 20% nonionic צפיפות בינונית הדרגתיות, להעמיס על 1 מ"ל של 50% nonionic צפיפות בינונית הדרגתיות microcentrifuge tube, ולאחר צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 21,500 x g.
   2. לשטוף את אחסון והכנה נבג הסופי: בגדר שהושג מכיל את הנבגים רדום מטוהרים. שטיפת בגדר נבג 2 - 3 פעמים עם 1.5 מיליליטר סטרילי-אולטרה טהור סוג 1 מים (ראה טבלה של חומרים) ולמטה ספין-בין ב 9,560 x g למשך 15 דקות ב 4 º C. לבסוף, להשעות את צניפה ב סטרילי מים סוג 1 אולטרה טהור OD סופית₆₀₀ של 30. Aliquots של הנבגים שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס במשך 8 שבועות¹⁴.

2. decoating

1. לטפל PS4150 נבגים עם 0.1 M NaCl/0.1 M NaOH/1% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) / dithiothreitol M 0.1 (DTT) ב 70 ° C עבור ה 1 לשטוף את הנבגים 10 פעמים עם סטיריליים אולטרה טהור סוג 1 מים^15,16. בעשותם כך, כל הספוחה המכשיר FM4-64 הממברנה החיצונית של נבג, שכבות חיצוניות יוסרו.

3. Coverslip והכנות שקופית¹¹ (תזמון: H 1 לפני תצפית)

1. דיוק גבוהה מראש נקי coverslips (ראה טבלה של חומרים) עם HCl M 1 למשך 30 דקות באמבט מים חזק בעדינות. לשטוף את coverslips פעמיים במים סוג 1 אולטרא טהורים ואחסן אותם ב-100% (vol/כרך) EtOH. תני להם להתייבש, לאמת שלהם בהירות לפני השימוש. מראש לנקות בשקופיות זכוכית 70% EtOH. תני להם להתייבש, לאמת שלהם בהירות לפני השימוש.

4. דגימה Microspheres פלורסנט או נבגי במסגרת הגן שקופית¹⁰ (עיתוי 15 דקות)

1. לחמם שני 70% EtOH ניקה, אוויר שקופיות זכוכית מיובשים (ראה טבלה של חומרים) למשך מספר שניות על בלוק חימום 70 מעלות צלזיוס, ירידה μL 65 של agarose 2% סטיריליים שנערך ב- 70 מעלות צלזיוס מעל כוס אחת השקופיות, למקם את השקופית זכוכית אחרים למעלה כדי להפיץ את b agarose etween השקופיות. התיקון agarose יתייבש כ 5 דקות.
2. חותכים את התיקון agarose מקטע 1 x 1 ס מ לאחר הסרת אחת מהשקופיות זכוכית, להוסיף μL 0.4 מדגם (microspheres פלורסנט או נבגים של ~ 10⁸/mL), ולהעביר את התיקון על גבי coverslip ברמת דיוק גבוהה על-ידי הצבת את coverslip על התיקון, . להתקלף.
3. לתקן את מסגרת הגן (1.5 x 1.6 ס מ², 65 µL) על גבי השקופית מיובשים, שעליו מונחת על coverslip לסגור את כל הפינות של המסגרת, ובכך להשלים את השקופית עבור שימוש במיקרוסקופ.

5. הדמיה^11,17(תזמון: 1 H)

1. לכידת תמונות שידור, זריחה של נבגים, כמו גם תערובת של אדום, צהוב, ירוק carboxylate שונה פלורסנט microspheres על מיקרוסקופ תאורה מובנית (ראה טבלה של חומרים) מצוידים 100 x (אובייקטיבית שמן מפתח נומרי = 1.49), CCD מצלמה ותמונה ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים). ליצור כל התמונות בטמפרטורת החדר ללא ההפרעה של אור מקיף. הקפד תמיד מנקה את 100 x אובייקטיבית, השקופית עם 75% אתנול לפני הדמיה.
2. להתמקד 100 ננומטר (קוטר) microspheres פלורסנט ולמטב את הפונקציה הליין (psf) על-ידי התאמת הטבעת תיקון על המטרה 100 x עד psf סימטרי מתקבל, ובכך לחסוך טשטוש התמונה. Psf הוא את תגובת הלם או התגובה של מערכת הדמיה המקור או אובייקט נקודה.
3. בחר תצוגה של שדה כ 10 עגול microspheres פלורסנט. להחיל על פומפיה למקד את ההתאמה עבור שניהם 561 nm ו 488 ננומטר, עירור גל אורכי כמדריך עבור תוכנת ניתוח התמונה.
4. למקד את הנבגים עם האור שידור, לכידת תמונת אור שידור במצב 16 × ממוצע עם 200 ms חשיפות עבור כל תמונה.
5. לכידת תלת-ממד-SIM בתמונות פלורסנט raw של הנבגים עם מצב תאורה "3D-SIM", הגדרות המצלמה למצב readout הכפלת אלקטרון (EM) רווח 10 מגה-הרץ ב- 14-bit, ורווח EM-175. לרגש החללית FM4-64 בנבגים PS4150 עם 561 אור לייזר nm ב 20% עוצמת הלייזר ולאחר תקופה תאורה של 400 אלפיות שניה.
6. לרגש את GerKB-mCherry, גרד-GFP ב KGB80 נבגים עם, בהתאמה, 561 ננומטר לייזר אור עוצמת הלייזר 30% 1 s, ואור 488 ננומטר לייזר של 60% לייזר כוח עבור הגדרות Z-מחסנית ס' 3 הם החלק העליון לחלק התחתון מצב, 0.2 µm / צעד, 7 השלבים, השלבים 20 עבור germinosome ו ניתוח IM, בהתאמה.
   הערה: פרמטרים אלה לייזר הוחלו על מנת להבטיח ערך בהירות מרבית של החלון היסטוגרמה של סביב 4,000.

6. לשחזר תמונות Raw 3D-SIM של FM4-64 צבעונית PS4150 נבגים

1. לבצע את השחזור פרוסה N-SIM עבור FM4-64 צבעונית הנתונים הגולמיים של PS4150 נבגים. לחץ על לחצן Param עבור לשחזר פרוסה על הסדין tab pad N-SIM כדי לפתוח את החלון N-SIM שחזור פרוסה.
2. להגדיר את הפרמטרים שחזור בחלון N-SIM שחזור פרוסה . כדי לקבל תמונות המשוחזרת מושלם, בעקבות הצעתו של ההוראות N-SIM ולחץ על הפקדים המתאימים בחלון N-SIM פרוסה שחזור כדי להגדיר את תאורה אפנון ניגודיות (מל י) אוטומטי, גבוהה דיכוי רעש רזולוציה (HRNS) 1.00, מתוך מוקד טשטוש דיכוי (OFBS) עד 0.05 כנקודות התחלה.
3. לחץ על הלחצן בנייה מחדש פרוסה בחלון N-SIM פרוסה שחזור כדי לשחזר את התמונה. הערכת האיכות של תמונות שוחזר על ידי תמונות מהר פורייה טרנספורמציה (FFT) תוצאת שחזור, אשר להציג לאחר שחזור¹².
4. להתאים את HRNS מ- 0.10 5.00 ו OFBS מ 0.01 עד 0.50 על ידי לחיצה על הפקדים המתאימים בחלון N-SIM שחזור פרוסה עד ההגדרות פרמטר מתקבלים.
5. לחץ על הלחצן ' החל ' בחלון Reconstuction פרוסה N-SIM כדי להחיל פרמטרים שהשתנו. לחץ על סגור כדי לסגור את החלון.
6. להפוך FM4-64 צבעונית PS4150 נבגים raw התמונה הפעילה, לחץ על לחצן לשחזר פרוסה על הסדין tab N-SIM Pad לבצע שחזור פרוסה. לשמור את התמונה המשוחזרת.

7. ניתוח תמונות

1. המרת תמונות פסאודו-Widefield של germinosome KGB80
   1. להמיר תמונות raw 3D-SIM של KGB80 פסאודו-Widefield תמונות על ידי הפעלת באמצעות לחיצה שמאלה התוסף ImageJ SIMcheck כלי סי נתונים גולמיים פסאודו-Widefield¹². פסאודו-Widefield הממוצע של תמונות מ- SIM נתונים גולמיים, מרכיב, לשם השוואה, תמונה שווה ערך ל widefield המקובלת תאורה¹². ראו ImageJ עצמו https://imagej.net/Welcome. בחר באופן אקראי ~ 25 נבגים כל תמונה הפוכה שידור לניתוח germinosome בשלב מאוחר יותר של תמונות פסאודו-Widefield פלורסנט.
   2. בחר סה כ- 350 (בדוגמה זו, 346) נבגים KGB80 ב- 14 שדות ראייה בין שתי שקופיות. המספרים foci פלורסנט GerD-GFP, GerKB-mCherry בנבגים KGB80 הנבחרת צריכה להיחשב באופן עצמאי על ידי שני חוקרים. החוקר יכול להתייחס בחזרה תמונות raw 3D-SIM בכל פעם בספק נוכחות של מוקדים נפרדים germinosome פלורסנט בנבגים.
   3. להעריך את עוצמות המרבי של כל מוקד GerD-GFP, GerKB-mCherry לבין עוצמת משולב של תמונה תלת-ממדית של כל נבג KGB80 עם ImageJ.
2. לנתח פסאודו-Widefield תמונות של germinosome KGB80
   1. להשתמש בערך כלומר העוצמה משולב של 7 ערימות עוצמת האות משולב של הנבג KGB80. לקבוע רקע עוצמות על ידי הדמיה המתח רקע PS4150 באמצעות הגדרות זהות. רואים כתמים פלורסנט בנבגים KGB80 בודדים מוקדים germinosome כאשר הם ניתן להבחנה ברורה מהרקע.
   2. החל חד-כיווני אנובה-בדיקות לקביעת המשמעות עם תוכנת מקור 9.0. בהתחשב P ערכים < 0.05 כמו סטטיסטית משמעותית. השתמש מקדם המתאם דרגה של ספירמן¹⁸ כדי להעריך הקורלציה של GerD-GFP ומספר מוקדים GerKB-mCherry, את המידות של עוצמת האות משולב.

Results

בפרוטוקול הנוכחי מציג SIM מיקרוסקופ הדמיה הליך של נבגים של חיידקים. ההליכים הכנה הנבגה והחלק בוצעו כפי שמוצג באיור 1 לפני הדמיה. מאוחר יותר, ההליכים הדמיה וניתוח הוחלו הן עבור עמעם (חלבון פלואורסצנטי שכותרתו נביטה חלבונים) ובהיר נבג (lipophilic העצמית צבעונית IM) דוגמאות כפי שמוצג בטקסט הבא.

לוקליזציה של germinosomes ב- B. subtilis נבגים

Discussion

פרוטוקול שהוצג מכיל שגרה 3D סטנדרטי-SIM עבור ניתוח של FM4-64 צבעונית B. subtilis נבגים הכוללת הנבגה, הכנת שקופית, הדמיה תהליכים. בנוסף, הפרוטוקול מתאר ששונה SIMcheck (ImageJ)-בסיוע 3D הדמיה תהליך SIM מיקרוסקופיה של B. subtilis נבג germinosomes שכותרתו עם כתבים פלורסנט. ההליך האחרון אפשר לנו להתבונן זה בתיוג עמום עם חדות משופרת. על ידי צימוד משתי השגרות הדמיה, זה אפשר לדמיין דיסקרטית מבנים תת הנבג אותו עם המיקרוסקופ SIM אותו, ובכך שיפור שלנו בסיס להבנה מכניסטית של תהליך הנביטה. שימו לב: ההליך פועל ברזולו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגלשות זכוכית מיובשות באוויר	Menzel Glä ser	630-2870
APO TIRF N20R8 100& מטרת שמן (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mחתול דובדבן, gerD-gfp kan)<
em>B. subtilis PS4150 (PS832 Δ gerE::spc, Δ cotE::tet)
צלוחיות Erlenmeyer 1 ליטר	צלוחיות Sigma-Aldrich	Z567868
Erlenmeyer 250 מ"ל	Sigma-Aldrich	Z723088
FluoSpheres מיקרוספירות שעברו שינוי קרבוקסילט	Invitrogen, 0.1 μ m	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	F34653
Histodenz מדיום שיפוע צפיפות לא יונית	Sigma-Aldrich	D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD מצלמה	Andor Technology		https://imagej.net/Welcome
LB Agar	Sigma-Aldrich	L2897
צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"ל	תרמו פישר מדעי	3451PK
תוכנת הדמיית מיקרוסקופ	ניקון, יפן	NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti מיקרוסקופ
פוליפרופילן בורג מכסה בקבוק 180 מ"ל	תרמו פישר מדעי	75003800
Precision Coverslips	Paul Marienfeld	117650
צינורות תחתונים עגולים 15 מ"ל	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM
צינורות כובע בורג 50 מ"ל	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM