מאמר שיטה

ניתוח של miRNA קומבינטורית טיפולים כדי להסדיר מחזור התא, אנגיוגנזה

DOI:

10.3791/59460

⸱

30 במרץ 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe, 2Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 3Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNA הרפוי יש פוטנציאל משמעותי בוויסות התקדמות סרטן. המודגמות כאן גישות אנליטיות משמשים לצורך זיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורית להפסקת מחזור התא, אנגיוגנזה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן הריאות (LC) הוא הגורם המוביל למוות מסרטן ברחבי העולם. בדומה לתאים אחרים סרטן, מאפיין מהותי של תאים LC היא התפשטות ללא פיקוח חלוקת התא. עיכוב של התפשטות בעת עצירת התקדמות מחזור התא הוכח להיות גישה מבטיחה לטיפול בסרטן, כולל LC.

miRNA הרפוי הופיעו כמבקרי ג'ין post-transcriptional חשוב, הם יותר ויותר נחקר לשימוש בטיפול בסרטן. העבודה האחרונה, אנחנו מנוצל miRNAs שני, 143-מיר ומיר-506, כדי לווסת את התקדמות מחזור התא. תאים סרטניים (NSCLC) ריאות שאינם קטנים התא A549 היו transfected שינויים בביטוי הגנים נותחו, פעילות אפופטוטיים להיפגע עקב הטיפול ניתחנו את סוף סוף. Downregulation של kinases תלויי-cyclin (CDKs) אותרו (קרי, CDK1, CDK4 ו CDK6), והפסיקה מחזור התא על המעברים שלב G1/S ו G2/M. ניתוח מסלול הצביעו על פעילות אנטי-אנגיוגנטי פוטנציאלי של הטיפול, אשר מעניק את הגישה עם רבת פעילות. המתוארים להלן למתודולוגיות המשמש לזיהוי פעילות miRNA בדבר עיכוב מחזור התא, אינדוקציה של אפופטוזיס, ואת ההשפעות של טיפול בתאי אנדותל על ידי עיכוב של אנגיוגנזה. יש לקוות כי השיטות המובאות כאן יתמוך למחקר עתידי על miRNA הרפוי ובפעילות המתאים, כי נציג הנתונים ינחה חוקרים אחרים במהלך ניתוח ניסיוני.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחזור התא הוא שילוב של מספר אירועים רגולטוריות לאפשר כפילות של התפשטות ה-DNA של תאים דרך תהליך mitotic1. תלויי-cyclin kinases (CDKs) להסדיר ולקדם את מחזור התא2. ביניהם, mitotic CDK (CDK1) CDKs לאטמוספרה (CDK2, CDK4 ו CDK6) יש תפקיד מרכזי מחזור התא התקדמות3. חלבון רטינובלסטומה (Rb) הוא phosphorylated על ידי CDK4/CDK6 מורכבים כדי לאפשר התקדמות מחזור התא4, CDK1 הפעלה הוא חיוני עבור חלוקת התא מוצלחת5. יש רבים CDK מעכבי פותחה, הערכה בניסויים קליניים לאורך העשורים האחרונים, המציין את הפוטנציאל של פילוח CDKs בטיפול בסרטן. למעשה, שלושה מעכבי CDK אושרו לטיפול....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרביות תאים מיר-143 ו miR-506

התראה: השתמש כפפות גומי, מגן משקפיים, מעיל מעבדה בעת ביצוע הניסויים המתוארים. במידת הצורך, השתמש הקבינט אבטחה עם המאוורר הקבינט על, מבלי לחסום את דרכי הנשימה או להפריע את זרימת האוויר למינריות. תמיד להגדיר חלון זכוכית שיגן על הגובה המתאים, כפי שתואר על ידי היצרן.

  1. הזרע התאים NSCLC A549 בצלחת T25 ס מ2 הבקבוק/6/96 טוב בתקשורת DMEM/F12K בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (תרבות מדיה) בשכונה תרביות רקמה, דגירה בין לילה ב 37 ° C עם 5% CO2 מגשים תרביות רקמה.
  2. להשעות מחקה 143-מיר ו/או מיר-506, או לטרוף siRNA עם סוכן transfecting (2.4 µg של מיר, מעורבים עם 14 µL של סוכן ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח ביטוי גנטי באמצעות RT-qPCR וג'ל אלקטרופורזה

ניתוח ביטוי גנטי דיפרנציאלי באמצעות RT-qPCR הפגינו משמעותית downregulation של גנים יישוב CDK1, CDK4 ו- CDK6. CDK1 ו- CDK4/6 הראו להם להיות אינסטרומנטלי G2/M ומעברים G1/S, בהתאמה. בביצוע ניתוח מותר השוואה ישירה בין מירס בודדים ופעילות מיר קומבינטורית. השימוש של siRNA לטרוף עם הסוכן transfecting מותר הערכה של הפרעות ההליך ב זוהה הגן downregulation, אשר היה מינימלי........

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNAs יכול לפעול טיפולים ממוקדים לטיפול בסרטן, לזהות את dysregulation של רמות ביטוי נגועים לעומת רקמות רגילה. מחקר זה שמטרתה לקבוע miRNAs זה פוטנציאל לעצור את מחזור התא התקדמות בשלבים מרובים. זה זוהה 143-מיר ומיר-506 לעצור את מחזור התא של תאים סרטניים, ואת הפרוטוקולים הציג שמטרתם להבין את הפעילות של טיפול זה miRNA קומבינטורית.

למתודולוגיות שתואר לספק הבנה העל על תפקיד miRNAs. האתגרים של הלומדים miRNAs משויכות היכולת שלהם היעד גנים מרובים, ובכך להשפיע על נתיבים מרובים. הניתוח מתואר qPCR מאפשר .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים, הייתי רוצה להכיר את ג'ון Caskey באוניברסיטת לואיזיאנה סטייט לסיוע שלו על ניתוח מסלול של הנתונים רצפי RNA, של אוניברסיטת טקסס Southwestern Medical Center, מק'דרמט הבא הדור רצף הליבה המרכזית עבור מבצע את רצפי RNA וניתוח נתונים. מחקר זה נתמך על ידי המכללה לרוקחות, אוניברסיטת לואיזיאנה מונרו סטארט-אפ מימון במכון הלאומי של בריאות (NIH) דרך המכון הלאומי של כללי רפואי מדעי מענקים 5 P20 GM103424-15, GM103424 P20 3-15S1....

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי עניינים מוצהרים.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
-80 מעלות; C מקפיאVWRVWR40086A
96 בארות צלחתCELLTREAT Scientific 50-607-511
96 בארות Microwell צלחות    Thermo Scientific12-556-008
A549 תאי סרטן ריאה של תאים לא קטניםATCCATCC  CCL-185
AgaroseVWR0710-25G
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2938c
משתיק אמביון שליטה שלילית מס' 1 siRNAAmbionAM4611
תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית (100x)Gibco15240-062   
ערכת בדיקת מערך נוגדנים, 2 תגובותFull Moon BioKAS02
מיקרוסקופ שדה בהיר   מיקרוסקופטיקה IV-900
מיקרוסקופ שדה בהיר   New Star Environment LLC
Cell Cycle Antibody Array, 2 שקופיותFull Moon BioACC058
Cell Logic+ Biosafety CabinateLabconco342391100
Cellquest ProBD bioscienceשלבים 5.14; 6.13: משמש לחישוב התפלגות האוכלוסייה לפי מחזור התא   שלב ועבור  חישוב התפלגות האוכלוסייה לניתוח אפופטוזיס 
CFX96 מערכת זמן אמתBioRadCFX96 מודול
Chemidoc מערכת הדמיה מגעBioRadChemidoc מערכת הדמיה
מגע חממת CO2Thermo ScientificHERAcell 150i
Cultrex גורם גדילה מופחת מטריצת ממברנת מרתףTrevigen3433-010-01
מצלמה דיגיטליתAmScope FMA050
DMEM 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, עם נתרן פירובט, עם L-גלוטמיןVWRVWRL0100-0500
DNAse IZymo ResearchE1010
תוסף צמיחת תאי אנדותל (ECGS)BD Biosciences356006
ערכות Eppendorf Pipette Pick-A-PackEppendrof05-403-152
אתנול, מוחלט (200 הוכחה), מולקולרי כיתה בביולוגיה, Fisher BioReagentsBP2818500
Ethidium bromideAlfa acarL07462
F-12K תערובת נוטריינטים (Kaighn's Mod.) עם L-גלוטמין, קורנינגקורנינג45000-354
FACS Calibur FlowcytometerBecton Dickinson
סרום בקר עוברי - פרימיוםאנטלנטה ביולוגיתS11150
עוברי סרום בקר (FBS)פישר סיינטיפיק10438026
פישרברנד באסיקס צינורות מיקרוצנטריפוגה עם כובעי הצמד סטנדרטייםפישרברנד באסיקס02-682-002
פורמה סדרה II מעיל מים חממת CO2תרמו מדעי
תמיסת הפרין (5000 U/mL)HospiraNDC#63739-920-11
מערכת אלקטרופורזה הוריקסונטליתספסל מערכת מעבדהBT102
has-miR-143-3p miRNA MimicABMMCH01315
has-miR-506-3p miRNA MimicABMMCH02824
Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)Thermo ScientificPHC9394   
תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC)תורמים בודדיםIRB# A15-3891
HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
ניתוח מסלול המצאהQiagen: משמש לניתוח
Invitrogen UltraPure DNase/RNase ללא מים מזוקקיםInvitrogen10-977-015
ליפופקטמין 2000 Invitrogen11-668-027
טוען צבע 10Xמדע המחלקה +470024-814
בינוני M199 (עם Earle′ מלחי s, L-גלוטמין ונתרן ביקרבונט)מיקרוסקופ סיגמא אולדריץ'M4530
AmScope MU130
Modfit LTVerity תוכנהשלב 5.15: תוכנה חלופית לניתוח התפלגות
NanodropThermo ScientificNanoDrop one C
Opti-MEMGibco by life technologies31985-070
פניצילין-סטרפטומיצין 10/10אנטלנטה ביולוגיתB21210
Power UP sybr גרין מאסטר מיקסאפלייד ביוסיסטמסA25780
פרופידיום יודידMP ביוכימיקלים LLCIC19545825
Proscanarray HT סורק MicroarrayPerkin elmerASCNPHRG. השתמשנו באורך גל לייזר עירור ב-543 ננומטר.
q PCR כיסוי דבק אופטיApplied Biosystems4360954
ערכות Quick-RNA ZymoResearchR1055
Ribonuclease A מלבלב בקרSigmaR6513-50MG
ScanArray ExpressPerkinElmerשלב 7.33: תוכנת
ShakerThermo Scientific2314
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems
SpectraTube צינורות צנטריפוגה 15 מ"לVWR470224-998
צינורות צנטריפוגה SpectraTube 50 מ"לVWR470225-004
TBS מאגר, 20x נוזלVWR10791-796
בקרת טמפרטורה  צנטריפוגה מאצ'יןThermo ScientificST16R
מיקרו צנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה מאצ'יןEppendrof5415R
Thermo Scientific BioLite תרבית תאים מטופלת צלוחיותThermo Scientific12-556-009
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayThermo ScientificPI23225
Thermo Scientific Pierce RIPA BufferThermo ScientificPI89900
Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well צלחות חצאית מלאהThermo ScientificAB0800WL
Thermo Scientific Verso cDNA ערכת סינתזה (100 ריצות)Thermo ScientificAB1453B
סולם DNA בטווח נמוך במיוחדInvitrogen10597012
VWR מקרר מעבדה דלת מוצק סטנדרטיVWR
אופטיקה תוצאות מסלול ביואינפורמטיקהמצלמה דיגיטלית אוכלוסיית מחזור התאניתוח מיקרו-מערך

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schafer, K. A. The cell cycle: a review. Veternary Pathology. 35 (6), 461-478 (1998).
  2. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  3. Malumbres, M., Barbacid, M.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis
Posted by JoVE Editors on 4/26/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.  An author name was updated.

One of the authors' names was corrected from:

George Matthaiolampakis

to:

George Mattheolabakis

תגיות

miRNAqPCRRNAMicroarray

מאמרים קשורים