הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הטיפול בקרינה של תרבויות אורגנוטימית מתוך הלסת התחתונה ובלוטות הרוק פרודה מודלים מפתח Vivo מאפיינים

7.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59484

⸱

17 במאי 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Arizona, 2Cancer Biology Graduate Interdisciplinary Program, University of Arizona, 3Department of Chemical Engineering, University of Arizona

במאמר זה

סיכום

שימוש תלת מימדי בתרבויות אורגאותוגית להמחיש מורפולוגיה וסמנים פונקציונלי של בלוטות הרוק עשוי לספק תובנות הרומן לתוך מנגנונים של נזק רקמות לאחר הקרינה. מתוארים כאן הוא פרוטוקול לסעיף, תרבות, הקרנת, כתם, תמונה 50 – 90 יקרומטר עבה בלוטת הרוק סעיפים לפני ובעקבות חשיפה לקרינה מייננת.

תקציר

היפרליבציה ו xerostomia ליצור סיבוכים אוראלי כרונית הפחתת איכות החיים בראש ובחולי סרטן הצוואר אשר מטופלים עם הקרנות. הגישות הנסיוניות להבנת מנגנונים של תפקוד בלוטת הרוק ושיקום התמקדו במודלים vivo, אשר מוגבלים על ידי חוסר יכולת למסך בשיטתיות מועמדים טיפוליים ויעילות בניתוח יכולת לתמרן גנים ספציפיים. המטרה של פרוטוקול זה בלוטת הרוק אורגאוטימית התרבות היא להעריך את הזמן המקסימלי של הכדאיות התרבותית ולאפיין שינויים סלולריים בעקבות טיפול קרינה vivo ex. כדי לקבוע מתי אוכלוסיית תאים וסמנים ספציפיים נמצאים בתקופת תרבות של 30 יום. בנוסף, סמנים סלולריים דיווחו בעבר ב vivo מודלים קרינה מוערכים בתרבויות כי הם לשעבר לקרינה vivo. מעבר קדימה, שיטה זו היא פלטפורמה אטרקטיבית עבור הערכה מהירה לשעבר vivo של murine והאדם בלוטת הרוק התגובות התגובה לסוכנים הטיפוליים לשפר את תפקוד הרוק.

מבוא

תפקוד תקין בלוטת הרוק חיוני לבריאות הפה והוא שונה לאחר הטיפול בראש ובצוואר הסרטן עם הקרנות1. ב 2017, כמעט 50,000 מקרים חדשים של סרטן הראש והצוואר דווחו בארצות הברית2. בשל השפעות מזיקות לעתים קרובות בלתי הפיך של טיפול בקרינה על רקמות הסביבה הרגילה כגון בלוטות הרוק, חולים הם לעתים קרובות עזבו עם תופעות לוואי חמורות ואיכות מופחתת של חיים2,3, ד. סיבוכים נפוצים נגרמת על ידי נזק הקרינה מתבטא בתסמינים כגון xerostomia (התחושה הסובייקטיבית של הפה היבש), עששת, היכולת הלקוי ללעוס ולבלוע, דיבור ליקויים, ו מיקרובימי אוראלי פרוצים2, מיכל שלוש , 4. הסימפטומים הללו באופן קולקטיבי יכול להוביל תזונה ולקויה הישרדות אנשים מושפעים5. בעוד תפקוד בלוטת הרוק באוכלוסייה זו היתה מתועדת היטב, המנגנונים הבסיסיים של נזק לתאים acinar היו שנויות במחלוקת, ויש שילוב קטן בין דגמי בעלי חיים שונים6,7.

השיטות הנוכחיות של לימוד תפקוד בלוטת הרוק ונזק המושרה הקרינה כוללים את השימוש במודלים vivo, שורות תאים מונצח, דו מימדי (2-D) מתרבויות התא הראשי, ו תלת מימדי (3-D) התרבות הערבה8, . תשע,עשר,11,12 באופן מסורתי, מודלים של תרבות התא מקווי תאים מונצח ותרבויות דו-ממדיות כרוכות בתאים בעלי שכבות יחיד המתורבת על משטחים שטוחים והם יקרי ערך עבור ניסויים מהירים, קלים וחסכוניים. עם זאת, התנאים של תרבות התא המלאכותי יכולים לשנות את סטטוס הבידול ואת התגובות הפיסיולוגיים של תאים חשופים לתנאים שונים, והתוצאות לעתים קרובות אינן מצליחות לתרגם את כל האורגניזם מודלים14,15. בנוסף, תרביות תאים מונצח דורשים אפנון של פעילות p53, אשר קריטי עבור תגובת בלוטת הרוק נזק DNA16,17.

תרביות תלת-מימד מועשר בתאי גזע ומחולל בזמן מוקדם בתרבות ושימושיים להבנת הרגישות הרדיושל קבוצת משנה זו של תאי בלוטת הרוק9,18. מגבלה קריטית של כל המודלים האלה של התרבות היא שהם לא יעילים בהמחיש את המבנה התלת-ממדי של בלוטת הרוק, כולל מטריצה החילוץ (ECM) ואינטראקציה תא תא על פני שכבות שונות, אשר חיוניים הרוק מודלטינג הפרשה15. הצורך בשיטה המקיף את ההתנהגות של הרקמה כמכלול, אבל יכול להיות גם מניפולציות תחת תנאי מעבדה כדי ללמוד את ההשפעות של הטיפול הוא הכרחי כדי לגלות עוד את המנגנונים הבסיסיים של בלוטת הרוק המושרה קרינה תפקוד.

שימוש ברקמה חיה ותרבות כבר תועד בעבר19,20 והוא משמש לעתים קרובות לחקר אינטראקציות רקמות המוח21. במחקרים קודמים, פרוטיד (PAR) רקמת בלוטת הרוק מפני עכברים היה מנות ב כ 50 יקרומטר ו תרבותי עבור עד 48 h, ניתוח של הכדאיות, מוות תאים, ותפקוד בוצע לאחר מכן19. . סו ואח ' (2016) הורחב במתודולוגיה זו על ידי בלוטות הלסת האנושית של culturing (smgs) בשעה 35 יקרומטר או 50 יקרומטר עבור 14 ימים20. השיטה המוצעת היא התקדמות בכך שהוא כולל בלוטות הרוק השני והלסת התחתונה מנות ב 50 יקרומטר ו 90 יקרומטר והערכה של התרבויות עבור 30 ימים. היכולת לחתוך מגוון רחב של רקמות חשוב בהערכת תאים סלולריים ואינטראקציות תאים-ECM הרלוונטיות לתהליכים סלולריים, כולל קוטביות-באסולתית ושימור הפרשה. יתר על כן, פרוסות בלוטת הרוק הוקרן לקרינה בעוד בתרבות כדי לקבוע את הכדאיות של מודל זה תרבות כדי ללמוד המושרה קרינה נזק בלוטת הרוק.

המטרה של פרוטוקול זה בלוטת הרוק אורגאוטימית התרבות היא להעריך את הזמן המקסימלי של הכדאיות התרבותית ולאפיין שינויים סלולריים בעקבות טיפול קרינה vivo ex. כדי לקבוע את מקטעי הזמן המרביים הקיימים לאחר הניתוח, הכדורית כחול, מכתים תאים חיים וכתמים אימונוהיסטוכימיה עבור מוות תאים בוצעו. מיקרוסקופיה קונפוקלית וכתמים מוחיסוניות מנוצלים להערכת אוכלוסיות תאים מסוימות, מבנים מורפולוגיים ורמות התפשטות. תרביות מקטע רקמות נחשפו גם לקרינה מייננת כדי לקבוע את ההשפעות של קרינה על סמנים שונים במודל זה 3-D. אינדוקציה של מוות התא, הפרעה ציטושלד, הפסד של סמנים בידול, והתפשטות הפצה בתרבויות הvivo לשעבר הקרינה היו לעומת מחקרים קודמים של במודלים vivo. מתודולוגיה זו מספקת אמצעים לחקור את התפקיד של אינטראקציות תא תא בעקבות נזקי קרינה ומספק מודל ניסיוני כדי להעריך ביעילות את היעילות של התערבויות טיפוליות (מניפולציות גנים או סוכני תרופתי ) שעשוי להיות מתאים פחות למודלים vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת הרטט

  1. ספריי להסרה רכיבים של הרטט כולל מגש המאגר, מצורף להב, כייר בלוק agarose, וסרט מעבדה עם 70% אתנול, ולאחר מכן UV-לחטא לפחות 30 דקות.
  2. מקום ולאבטח גיליון נוסף של סרט מעבדה על מגש המאגר כדי למנוע את הקרח מליפול.
  3. למלא את תא קרח עם קרח כתוש, להסיר את הסרט מעבדה ממגש המאגר, ולמלא את מגש המאגר עם 100 mL של הקרח קר 1x פוספט מלוחים באגירה (PBS) פתרון בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין-אמפיצילין (PSA).
  4. מניחים להב גילוח נירוסטה למחזיק להב. השתמש במברג כדי להדק/לשחרר ולשנות את זווית הלהב.

2. הכנת דגימת רקמה בבלוק והפחתה באמצעות הרטט

  1. הקלפה את כל הכלים הנחוצים לניתוח והכללה כולל מלקחיים, מספריים ומכחולים.
  2. הכינו 3% התכה נמוכה הגובה ההיתוך ב-PBS 1-x ומיקרוגל עד agarose מתמוסס לתוך הפתרון. ודא כי הפתרון אינו מרתיחה ומערבולת את הבקבוק מדי פעם כדי לערבב.
    הערה: מניעת המסת ההיתוך הנמוכה מההתגבכת על ידי שמירה על מקלחת מים חמה. הצמח הנמוך הוא נוזל ב-37 ° c ומגדיר ב -25 ° c. עם זאת, אמבט המים צריך להיות מתחת 40 ° c כדי לשפוך את הצמח סביב הרקמה בטמפרטורה פיזיולוגית.
  3. בודד בלוטות הרוק ובמקום לגזור את הרקמה לתוך 2 מ"ל קרח קר 1x PBS בתוספת עם 1% PSA ב סטרילי, 30 מ"מ צלחת התרבות.
  4. באמצעות מלקחיים בלוק להסיר בלוטות הרוק מ 1x PBS + 1% הפתרון PSA ומיקום בתחתית של עובש הטבעה. ממלאים את העובש עם נוזל 3% התכה נמוכה agarose לכסות את הרקמה.
  5. באמצעות מלקחיים, להתאים את הרקמה לאמצע הבלוק ולמקם את בלוטת הרוק במישור המתאים. חתכי הצלב הטובים ביותר עבור בלוטות הלסת התחתונה והתת הפרודיות נמצאים במישור האנכי.
  6. מקום בלוק צמח על הקרח 10 דקות כדי הארדן.
  7. בזהירות להפעיל להב תער סביב הקצה החיצוני של agarose כדי לשחרר ולתת לחסום להחליק על הסרט מעבדה UV-מעוקר משלב 1.1.
  8. השתמש להב גילוח כדי לגזור תיבת agarose המכילה את בלוטת הרוק. ודא שמישור המקטע הוא ישר ומקביל לצד הנגדי של הבלוק (המשטח שיודבק למטה). מאז agarose לא לחדור את הרקמה, לא לקצץ יותר מדי אגקם סביב הרקמה כך הרקמה תהיה נתמכת היטב.
  9. השתמש בדבק על מנת לחבר את הבלוק למשטח החיתוך.
  10. סעיף ב-50 יקרומטר או 90 יקרומטר עובי על-ידי הרטט במהירות של 0.075 מ"מ/s ותדירות של 100 Hz.
    הערה: הגדרת הרטט בתדר הגבוה ביותר ומהירות הלהב הנמוכה ביותר מספקת את הפרוסות האופטימליות ביותר.
  11. לאסוף סעיפים 24-היטב התרבות רקמה המכילה ~ 1 mL קרח קר PBS לכל טוב באמצעות autoclaved מכחול שיער טבעי, הצבת מברשת ב 70% אתנול בין אוספי פרוסה כדי לשמור על עקרות.

3. סעיפים בתפירה

  1. . אוטוקלב מיקרו-מרית ומלקחיים
  2. להפוך את המניה רטט מדיה תרבות עם או בלי סרום שור עוברי (FBS): DMEM/F12 מדיה בתוספת 1% PSA, 5 μg/mL מועבר, 1.1 μM הידרוקורטיזון, 0.1 μM חומצה retinoic, 5 מילימטר μg/אינסולין, 80 ng/mL גורם צמיחה באפידרמיס, 5 מ"מ-גלוטמין, 50 μg gentamicin סולפט, ו 10 μL/mL תערובת האלמנט. הוסף כמות מתאימה של FBS כדי לבצע 0%, 2.5%, 5.0% או 10% פתרונות.
  3. לפני הודעה, להוסיף 300 μl של מדיה מראש מחומם ומקום בקוטר 12 מ"מ, 0.4 יקרומטר ממברנה בגודל הנקבוביות להכניס לתוך כל טוב של לוח 24-היטב הרקמה התרבותית. התקשורת צריכה להגיע לתחתית הקרום כדי ליצור ממשק באוויר הנוזלי עבור התרבות.
  4. בעדינות להניח את קטעי הרוק על גבי להוסיף ממברנה באמצעות מרית ותרבות ב 37 ° c ב מחולל לחות 5% CO2 ו 95% אטמוספירה אוויר חממה.
    1. הוסף כ 300 μL מדיית התרבות הראשית לתוך הבאר וכמה טיפות לתוך הממברנה מוסיף (כ 40 μL) כל יום אחר או לפי הצורך. Culturing נכונה הראה כי התאים מסוגלים לשרוד ולהישמר עד 30 ימים לשעבר vivo.

4. הקרנה של חתכי בלוטת הרוק

  1. טיפול סעיפים עם מנה אחת של קרינה (5 Gy) באמצעות קובלט-60 (או שווה ערך) irradiator.
    1. מחלקים תחבורה למתקן הסקה באמצעות מכולה קלקר מכוסה כדי למנוע תנודות בטמפרטורה. בנוסף, הטיפול צריך להילקח במהלך ההובלה בחזרה לחממה מעבדה כדי להבטיח כי התקשורת לא להתיז על מכסה התרבות ולגרום לזיהום.
    2. מניחים את הצלחת 24-באר המכיל בלוטת הרוק סעיפים 80 ס מ ממקור הקרינה, במרכז של 32 "x 32" שדה קרינה. הקרינה חישובי המינון ואת הזמן המתאים ב-עוצמה ישתנו על ידי כלי מכשיר קובלט-60 ריקבון.
  2. המשך לעקוב אחר מקטעים אלה כמתואר בסעיף 3.

5. הכדאיות מכתים

  1. מנושף את המדיה הישנה ומכבסת פרוסות פעמיים באמצעות הערוץ הטרום-מחמם של 1x.
  2. כתמים מפרקים עם צבע כחול טריכאני.
    1. השתמשו במיקרו-מרית כדי להזיז את הפרוסה מהתרבות למגלצת זכוכית.
    2. הוסף 0.4% טרי, פתרון כחול לפרוסת הרטט עם נפח מספיק כדי לכסות את הרקמה (10 – 20 μL).
    3. מודטת פרוסות בטמפרטורת החדר (RT) בטריקון הכחול עבור 1 – 2 דקות כדי שצבען יחדור לרקמה. תאים לא קיימא יהיה כחול מוכתם, ותאים קיימא יהיה בלתי מוכתם.
  3. צביעת סעיפים עם calcein, לחיות בצבע התאים.
    1. הוסף נפח מספיק של הכתם כדי לכסות את המקטע בבאר אחת של 24 היטב-צלחת (200-300 μL).
    2. מודקון פרוסות ב-RT עבור 15 דקות כדי לאפשר חדירה לצבע.
    3. הסר בזהירות את המקטע מבאר ומניחים על מגלשת זכוכית. פרוסות מעלות עם טיפה אחת של מדיה הכוללת הרכבה.
    4. מקטעי תמונה על מיקרוסקופ פלורסנט ב עירור/פליטת אורכי גל של 488 ננומטר ו 515 nm.

6. נוגדן צביעת סעיפים הרטט

הערה: להלן מספק פרוטוקול נוגדן כללי מכתים ספציפי עבור קי-67; עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש עם כל נוגדן. כל שוטף מתנהלים ב-RT אלא אם צוין אחרת.

  1. בצלחת התרבות רב-היטב של הרקמה, מביסה את המדיה ולשטוף לפחות 2 x עם סטרילי 1x PBS.
  2. לתקן מקטעים באמצעות 4% פאראמפורמלדהיד (כיתה) ב -4 ° c.
  3. מנושף את 4% כדור הראש ולשטוף 3x עם PBT [1x PBS, 1% בסרום שור אלבומין (BSA), 0.1% טריטון X-100].
    הערה: ניתן לאחסן מקטעים ב-1x PBS ב-4 ° c ומוכתם במועד מאוחר יותר. זמן האחסון המקסימלי שנבדק בכתב היד הזה היה 3 שבועות. זמן אחסון ארוך יותר יהיה צורך למטב על-ידי המשתמש הבודד אם הדבר רצוי.
  4. מקטעים מתוך החדירות באמצעות 0.3% טריטון X-100 ב-1x PBS במשך 30 דקות.
    הערה: שלב זה יכול להיות שונה וממוטב עבור מכתים נוגדנים ספציפיים וחדירות.
  5. ללטף את פתרון החדירות.
  6. לשטוף את פרוסות 3x עבור 5 דקות עם 1 x PBS, 1% BSA, ו 0.1% טריטון X-100 (PBT).
  7. לחסום את הפרוסות עם הסוכן חסימת 1% סרום עז רגיל עבור 1 h.
  8. לשטוף את הפרוסות 3 x עבור 5 דקות עם PBT.
  9. מודלת את הפרוסות לילה ב -4 ° צ' עם 500 μL anti-Ki67 הארנב נוגדן מונוטוני ב 1% BSA ב-1x PBS.
    הערה: עבור phalloidin כתמים, לדלג על צעד 6.9 ולהמשיך באמצעות פרוטוקול עבור phalloidin הספציפי המשמש. , בשביל כתמי דנ א. דלג לשלב 6.15
  10. מKi67 את הארנבת. בנוגדן חד-שבטיים
  11. שטוף את הפרוסות 6x עבור 5 דקות ב-1x PBS.
  12. מודלת את הפרוסות ב-500 μL של הנוגדנים משני מצובטים משולשים תואם עם הנוגדן anti-Ki67 מדולל 1% BSA ב-1x PBS ב RT עבור 1.5 h מכוסה מהאור.
    הערה: מבוסס על הנוגדן המשני בשימוש, זמן דגירה עם הנוגדן המשני יכול להיות ממוטב נוסף על ידי המשתמש הבודד. בנוסף, הנוגדן המשני הוא רגיש לאור. כל השיטיפות הבאות חייבות להתבצע בחשכה.
  13. . מנושף נוגדן משני
  14. לשטוף פרוסות עבור 3 x עבור 5 דקות עם 1x PBS.
  15. רוחצים פרוסות עבור 5 דקות במים מפוהים.
  16. פרוסות כתמי נגד עם DAPI (1μg/mL) עבור 20 דקות ב-RT.
  17. שטוף פרוסות (פעם אחת) עבור 5 דקות במים מפוהים.
  18. פרוסות מעלות עם טיפה אחת (~ 40 μL) של התקנת מדיה. כדי להימנע מעודף בועות, הציבו לאט את הכיסויים על המדיה העולה בשקופית, החל בזווית 45 °.
    1. כדי למנוע ריסוק חלקים עבים עם שמיכות, הר כל פרוסה עם מרווח. מרווח יכול להיווצר על ידי הצבת שפה של שומן ואקום במשבצת סביב מקטע הרקמה.
    2. כאשר הנחת שמיכות, הקצוות של שמיכות יכול להיות אטום עם שומן ואקום. לחץ על קצות שמיכות עם האגודל כדי לדבוק אותו בחוזקה על השקופית. לחילופין, לאטום את הכיסויים על שקופית המיקרוסקופ באמצעות לק ברור מסמר.

7. הדמיה מקטעים רטט

  1. תמונה השקופיות ויטראז בתוך 5 ימים של כתמים.
  2. השיגו חלקים אופטיים של הפרוסות המוכתמת ויטראז ' בעזרת מיקרוסקופ קונקטאלי. בעזרת מיקרוסקופ קוננסאני, השג מחסנית z בגודל שלב מוגדר או צלם תמונות בודדות בהתאם לעיצוב הניסיוני של המשתמש. תמונות ניתן לבחון על כל מסך מחשב לאחר איסוף מיקוד.
    הערה: בשל עובי פרוסות הרטט, מומלץ להשתמש במיקרוסקופ מיקוד או בטווח עם יכולת מחסנית z להמחיש פרטים בתוך הדגימות. עבור התמונות המשמשות בכתב יד זה, שימש מטרת הנפט 63 x; עם זאת, ניתן להתאים את זה ולשנות את השימוש על ידי המשתמש הבודד והטווח הספציפי המשמש. רזולוציית פיקסלים מומלצת לכל גורם מטרה וזום עם דגימת נייקוויסט של 2.5 פיקסלים ב-X ו-Y עבור המבנה הקטן ביותר בצורה אופטית שנעשה בו שימוש. עם זאת, כמה פרשנים מציעים 2.3 פיקסלים, בעוד אחרים מציעים 2.8 פיקסלים. לפרטים נוספים על האופן שבו ניתן לבצע חישובים אלה, אנא התייחס למדריך המיקרוסקופיה הביולוגית22 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התרבויות הראשיות דו-ממדיות מגודלים בסרום של שור עוברי (FBS) שיושלם מדיה בזמן שהתרבות הראשית תלת-ממדית של סליספירה מתרבות בדרך כלל בתנאים ללא נסיוב10,11. בנוסף, שני המחקרים הקודמים ניצול תרבויות הרטט מבלוטות מתוך בלוטות הרוק שלהם סעיפים 0% או 10% fbs שנוספו מדיה19,20. פרוסות הלסת התחתונה של העכבר היו מנות בעובי של 50 יקרומטר באמצעות הרטט ותנאי התרבות האופטימליים נקבעו באמצע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר בלוטת הרוק השתמשו במספר דגמי תרבות, כולל תרבויות דו-ממד מונצח, תרבויות דו-מימד ראשיות, תרבויות תלת-מימד, ותרבויות תלת-מימד מפני מתקנים עובריים כדי לברר שאלות על הביולוגיה הבסיסית והפיזיולוגיה. המודלים התרבותיים הללו הניבו מידע תובנה על פני מגוון מגוון של שאלות מחקר וימשיכו להיות כלים חשובים במחקר הרוק. המגבלות של דגמי התרבות הללו כוללות אפנון של פעילות p53 בזמן ההתמוללות, הכדאיות הארעית של התרבויות הראשיות, אובדן הבידול וחלבונים הפרשה בתרבות, וחוסר יכולת להעריך תא תא, תא-ECM וקוטביות אינטראקציות ברקמות למבוגרים. הרא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מימון פיילוט שסופקו על ידי אוניברסיטת אריזונה המשרד של מחקר וגילוי והמכון הלאומי לבריאות (R01 DE023534) כדי קירסטן לימסנד. מלגת ההכשרה לביולוגיה של סרטן, T32CA009213, סיפקה תמיכה של הקצבה ון יו וונג. המחברים רוצים להודות מ ' רייס על התרומה הטכנית היקר שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Vibratome VT1000SLeica BiosystemsN/AVibratome לחיתוך
סכיני גילוח נירוסטה כפוליםקצה אלקטרוני מדעי מיקרוסקופיה72000
AgaroseFisher ScientificBP165-25
פרפילםנמוך סיגמא-אולדריץ'P6543
פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריצין Bלונזה17-745HPSA
24 בארות צלחתCellTreat229124
Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח (DPBS)Gibco14190-144
Loctite UltraGel Control SuperglueLoctiteN/Aנרכש בחנות לחומרי בניין
מכחול עגול סייבל טבעיפרינסטון אמנות & מברשת Co7400R-2
ג'נטמיצין סולפטפישרICN1676045
טרנספריןסיגמא-אולדריץ'T-8158-100 מ"ג
L-גלוטטמיןGibco25030-081
יסודות קורטMP ביו-רפואייםICN1676549
אינסוליןפישר 12585014
גורם גדילה אפידרמיסקורנינג354001
הידרוקורטיזוןסיגמא-אולדריץ'H0888
חומצה רטינואיתפישר סיינטיפיקR2625-50MG
סרום בקר עובריGibcoA3160602
DMEM/F12 מדיהקורנינג150-90-CV
הכנסת תרבית תאים מילי-תאיתMillipore SigmaPICM0125012 מ"מ, גודל נקבוביות 0.4 אום עבור צלחת 24 באר
0.4% Trypan BlueSigma-AldrichT8154
ערכת הדמיה של תאים חיים / מתים (488/570)Thermo-FisherR37601בשימוש רק ברכיב צבע חי
אנטי-Ki-67 טכנולוגייתאיתות תאי9129S
איתות תאינוגדנים נגד E-cadherin3195S
Anti-Claced Caspase-3 נוגדןאיתות תאי טכנולוגיה9661L
נוגדן Anti-SMASigma-AldrichC6198
נוגדן נגד עמילאזSigma-AldrichA8273
Anti-CD31 נוגדןAbcamab28364
Anti-TUBB3 נוגדןתאי איתות5568S
Alexa Fluor 594 נוגדן ערכת תיוגThermo-FisherA20185
Alexa Fluor 594 PhalloidinThermo-FisherA12381
סרום בקר אלבומיןFisher ScientificBP1600
Triton X-100Sigma-Aldrich21568-2500
Paraformaldehyde PrillsFisher Scientific5027632
סוכן חסימה גרעינית בניו אינגלנדPerkin Elmer2346249כבר לא נמכר
DAPICell Signaling Technology4083S
Prolong Gold Antifade Mounting MediaInvitrogenP36934
Leica SPSII ספקטרלי קונפוקליLeica BiosystemsN/Aלהדמיה קונפוקלית
Leica DMIL מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכהLeica BiosystemsN/A
קובלט-60 מכשיר טלתרפיהאנרגיה אטומית של קנדה בע"מ Theratron-80N / A
קופסת Amac, נקהאת חנות המיכל60140עובש בלוק אגרוז
נמס אדום מדעי נוגדנים טכנולוגיית טכנולוגיה

מקורות

  1. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  3. Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
  4. Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
  5. Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
  6. Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
  7. Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
  8. Chan, Y. -H., Huang, T. -W., Young, T. -H., Lou, P. -J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
  9. Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942(2018).
  10. Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170(2003).
  11. Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
  12. Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
  13. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  14. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
  17. Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
  18. Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
  19. Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
  20. Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
  21. Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932(2015).
  22. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , 3rd ed, Springer U.S. Boston, MA. (2006).
  23. Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
  24. Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417(2010).
  25. Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347(2018).
  26. Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
  27. Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
  28. Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
  29. Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
  30. Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
  31. Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
  32. Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תרבית אורגנוטיפית של בלוטות הרוקטיפול בקרינה ex vivoחיתוך רקמהחיתוך בויברטוםצביעה אימונופלואורסצנטיתמיקרוסקופיה קונפוקליתצביעה אימונוהיסטוכימית ל-Ki-67Cleaved Caspase-3צביעה ל-E-cadherinזיהוי עמילאז
הטיפול בקרינה של תרבויות אורגנוטימית מתוך הלסת התחתונה ובלוטות הרוק פרודה מודלים מפתח Vivo מאפיינים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.