הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דוגמנות סרטן השד באמצעות הזרקת הפנים של המין-אדנווירוס המבטא לתוך בלוטת החלב של העכבר

12.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59502

⸱

7 ביוני 2019

 ,  , 
1Division of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

המטרה של הפרוטוקול הזה היא לתאר את הגישה החדשה מידול סרטן השד מבוסס על הזרקת הפנים של יצור-הבעת אדנווירוס לתוך בלוטות החלב של העכבר. גישה זו מאפשרת גם מניפולציה ייחודית לסוג תא ולעוגב של אירועים אונגניים באופן זמני מבוקר.

תקציר

סרטן השד הוא מחלה הטרוגנית, אולי בשל אינטראקציות מורכבות בין תאים שונים של מקורות ואירועים אונגניים. מודלים של עכברים הם אינסטרומנטלי בהשגת תובנות לתהליכים מורכבים אלה. למרות שדגמים רבים של העכבר פותחו כדי ללמוד תרומות של אירועים אונגניים שונים ותאים של המקור חזה tuמוריגנזה, מודלים אלה הם לעתים קרובות לא תא סוג או איבר ספציפי או לא יכול לגרום לחניכה של הפטמות tuמוריגנזה ב אופן זמני מבוקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור סוג חדש של מודלים העכבר של סרטן השד מבוסס על הזרקת הפנים של המין-הביע אדנווירוס (לספירה) לתוך בלוטות החלב של העכבר (MGs). בשל הזרקה ישירה של לספירה לתוך צינורות החלב, גישה זו היא מיוחדת MG, ללא כל האינדוקציה סרטן בלתי רצויות באיברים אחרים. ההליך הזרקת הפנים ניתן לבצע בעכברים בשלבים שונים של פיתוח MG שלהם (ובכך, זה מאפשר שליטה הטמפורלית של האינדוקציה לסרטן, החל מ ~ 3-4 שבועות של גיל). ניתן להשיג את הספציפיות לסוג התא באמצעות היזמים שונים ספציפיים לסוג תא לכונן ביטוי היצור בווקטור אדנונגיפי. אנו מראים כי הלומיאל ותאי האפיתל של הפטמות הבזליים (MECs) יכול להיות ממוקד הדוק עבור מניפולציה הגנטית מבוססי לוטל/loxP באמצעות הזרקה הפנים של Ad-אני מתחת לשליטה של קרטין 8 או קרטין 5 מקדם, בהתאמה. על-ידי שילוב של כתב מותנה כתבת (למשל, בעלי מטרה/inducible Rosa26-YFP ), אנו מראים כי mecs ממוקד על ידי לספירה, ואת התאים הסרטניים נגזר מהם, ניתן לעקוב על ידי ביצוע העיתונאי-חיובי תאים לאחר הזרקה הפנימי.

מבוא

המטרה הכללית של שיטה זו היא לפתח גישה חדשה מידול סרטן השד מבוסס על הזרקה הפנים של לספירה לתוך העכבר MG. הגישה הגנטית של שילוב מבוסס-loxP שימש באופן נרחב כדי לדגמן סרטן השד האנושי בעכברים. הדור הראשון של מודלים מבוססי סרטן השד המבוססת על העכבר מופקים על ידי שימוש בעכברים המבטא המגניים תחת השליטה של MEC ספציפיים היזמים (למשל, Mmtv-היצורים עבור הלומיאל mecs וחלק של הבסיס mecs, Wap- היצור ו בעלי הושלתי ומכתשיים לומיאל מכתשי, K14- היצור עבור בסיס וחלק של הלומיאל mecs1,2,3,4,5)6, מיכל סבן , בן שמונה , 9. עם זאת, בעוד שורות אלה היצורים הטרנסגניים לאפשר שליטה מרחבית של ביטוי היצור (כלומר, בקבוצות משנה שונות של mecs), הם אינם מאפשרים שליטה טמפורלית של ביטוי המין ו-מניפולציה גנטי loxp-תיווך. הדור השני של מודלים מבוססי סרטן השד המבוססת על העכבר לנצל inducible היצירה/ביטוי גישות (g., השימוש של היצור-היתוך קולטן אסטרוגן [CreER], אשר יכול רק לגרום ליצור/loxP שילוב מחדש על הממשל של טמוקסיפן), ו כתוצאה מכך, אלה כלים גנטיים היתר בקרות מרחבית ושליטה טמפורלית של הפעלת אירועים אונגניים ב mecs (למשל, K8-creer-ו K5-creerמודלים מבוססי)10,11,12 . בשני הדורות של מודלים העכבר סרטן השד, כמו היזמים משמש לנהוג ביטוי של היצור או CreER (למשל, Krt8, Krt5) עשוי להיות פעיל בתאי האפיתל של איברים אחרים (כלומר, הם תא סוג ספציפי אבל לא האיבר ספציפי) או יש ביטוי דולף סוגי תאים אחרים מאשר תאים אפיתל (למשל, Mmtv, אשר יש דליפה פעילות במח העצם המטבית), גישות אלה עלולה להוביל לפיתוח של סרטן לא רצויות (s) באיברים אחרים (s). אם אלה סרטן בלתי צפוי לגרום שטחיות בעכברים מושפעים, המטרה המקורית של סרטן השד מידול בעכברים האלה עשויים להיות אסורים (למשל, Mmtv-מונחה יצורים האירועים אונגניים עלול להוביל ממאירות המטתית ומוות מוקדם של העכברים , בשל הדביקות של היזם Mmtv בתאי המטפאות)4.

כאן אנו מדווחים על גישת מידול סרטן השד בעכברים המאפשר גם מניפולציה מסוג תא-ו-איבר ספציפי של אירועים אונגניים באופן זמני מבוקרת. גישה זו מבוססת על הזרקה הפנים של לספירה לתוך העכבר MGs (והוא, ובכך, האיבר ספציפי). ביטוי היצור יכול להיות נשלט באמצעות היזמים שונים מסוג MEC משנה ספציפיים מוטבע וקטור אדנונגיפי (למשל, Krt8 עבור לומיאל Mecs, Krt5 עבור בסיס הבסיס, ובכך להשיג ספציפיים להתאים את התאים). האינדוקציה סרטן ב MGs יכול להיות נשלט באופן זמני על ידי הזרקה של לספירה לתוך עכברים בגילאים שונים, החל מ 3-4 שבועות של גיל (pubertal) לשלב המבוגר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של בריגהם וביה לנשים.

1. הדור והאחזקה של עכברים מעורבבים

  1. להשיג סרטן השד רלוונטי מותנה מותנית הסתרה (g., Trp53tm1Brn [המכונה Trp53L/l], Brca1tm1Aash [Brca1l/l]) או שורות מותנה העכבר טוק-אין (למשל, Gt (רוזה) 26SorTm1 (PIK3CA * H1047R) איגן) ממעבדת ג'קסון (ג'אקס) או מודלים של עכבר NCI של סרטן האדם קונסורציום (MMHCC) מאגר. בנוסף, כדי להקל על הרדיפה של MECs כי לעבור את השילוב של היצור-תיווך מחדש, שורת מותנה הכתב שורה ניתן גם לקבל מ-ג'אקס (למשל, Gt (רוזה) 26SorTM1 (Eyfp) כי [המכונה R26Y]).
  2. מתרבים Trp53L/l homozygous עם עכברים R26Y homozygous כתבת או עם עכברים homozygous נושאים את אלס העיתונאי R26Y וכל הסתרה נוספת מותנה מותנית או טוק-באלס עבור שונים מודלים העכבר, כדי להשיג heterozygous F1 זכר ונקבה צאצאים.
  3. Intercross heterozygous F1 עכברים זכר ונקבה כדי להשיג את העכברים הנקבה F2 מורכבים כי הם homozygous עבור כל אלל (כמו עכברים ניסיוני), כמו גם R26Y-only homozygous נקבות (כמו עכברים שליטה). גנוטיפ F2 עכברים מבוסס על התנאים התחל ואופניים PCR המפורטים להלן, על ידי הגדרת שני רגיל 20 μL התגובות PCR (באמצעות Taq 5X הורים מיקס) בשני צינורות PCR שונים, אחד עם R26Y התחל והשני עם Trp53L צבעי יסוד. השתמש בעכברים מבוגרים (בדרך כלל כ-2 – 4 חודשים של גיל) עבור כל הרבייה.
    1. עבור R26Y, לבצע PCR ב 94 ° c עבור 3 דקות, אז ב 94 ° c עבור 30, 60 ° צ' עבור 30 s, ו72 ° c עבור 1 דקות עבור מחזורים 35, ואחריו 72 ° c עבור 3 דקות, ושמירה על 14 ° c. השתמש בתחל (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT TGT; (ii) R26YFP-2: GCG AAG TCC TCC ACC; (3) R26YFP: GGA GGA גה ATG גת ATG.
      הערה: פס PCR יחיד של 250 bp מצביע על R26Y הומוגוטה, להקה אחת של ה-pcr של 500 bp מציין מסוג פראי (wt), ושני להקות Pcr (R26Y: 250 bp, wt: 500 bp) מצביעים על R26Y הטרוזיציטים (איור 1a).
      עבור Trp53L, לבצע PCR ב 94 ° c עבור 3 דקות, אז ב 94 ° c עבור 30 s, 60 ° c עבור 30, ו 72 ° c עבור 1 דקות עבור 35 מחזורים, ואחריו 72 ° c עבור 3 דקות, ושמירה על 14 ° c. השתמש בתחל (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG טה AAC אמנות עכשווית G; (ii) p53F2-10 1R: AGC ACA תג מחסום.
      הערה: פס pcr יחיד של 370 bp מציין Trp53l/l הומוזיטה, פס pcr יחיד של 288 bp מציין Trp53+/+ WT, ושני להקות pcr (WT: 288 bp, Trp53L: 370 bp) לציין Trp53l /+ הטרוזיגוטה (איור 1b).

2. הכנה לפני הניתוח

  1. האוטוקלב כל כלי ניתוח 1 יום לפני הניתוח.
  2. הכינו 0.1% ברומאופנול כחול בתמיסת מלח (PBS) ואחסן אותה ב -4 ° c. לדלל את הספירה שישמשו עבור הזרקת הפנים בינונית DMEM דיום עם 0.01 M CaCl2 ו ברומאופנול כחול ביחס של 1:10 (כלומר, תערובת ההזרקה).
    הערה: המודעה בשימוש כאן התקבל מאוניברסיטת איווה ליבה וקטורית ויראלי, עם מניות ויראלי סיכוייו של~ 10 10 – 1011 pfu/mL.
  3. לשים את העכבר הנשי (F2 הדור כמתואר בשלב 1.2, גיל החל 3-4 שבועות של גיל למבוגר) באמצעות תא isofלאנה ולהחיל משחה העין. במהלך ההליך, מורדם את העכבר ברציפות על ידי הבטחת שהוא שואף 1% – 2.5% isofלוריאן בחמצן. בדוק את עומק ההרדמה לפחות כל 15 דקות על ידי ביצוע צביטה בבוהן. בזהירות לפקח על העכבר על כל שינוי בקצב הנשימה, התאמת רמת isofלכאן בהתאם, אם יש צורך.
  4. הכנס מלוקסיאם כאבים תת-עורי במינון של 5 מ"ג/ק"ג, לפני ההליך הכירורגי.
  5. לחשוף את האתר כירורגי הפטמה על ידי החלת מספר טיפות של קרם להסרת שיער; להסיר קרם מוגזם ושיער רופף באמצעות מגבות נייר רך.
    הערה: בצע שלב זה באזור הנפרד מהמקום שבו יש לבצע את הניתוח. לא מומלץ להתגלח על מנת למנוע נזק לפטמות. השתמש בזהירות כדי להסיר סוכן מסיר כימי באופן מתוזמן. השארת הסוכן במשך זמן רב עלולה לגרום לכוויות כימיות בעור
  6. לחטא את האתר כירורגי עם שפתי-האדם הראשון, ואחריו 70% אלכוהול, ולסיים עם היישום הסופי של שפתי-התחת קרצוף. עשה זאת בתנועה מעגלית ממרכז אזור העבודה לכיוון הפריפריה בעזרת ספוג גזה או כותנה משופעת. חזור על מחזור 3x – 4x.

3. הזרקת פנים

  1. להשתמש בטכניקות אספטי לאורך ההליך הכירורגי.
  2. הפוך את אתר החתך על העור באורך של ~ 1 ס מ בין שני המקלעים הרביעית הרביעי (איור 2). הפרד בזהירות את כנף העור (עם ה-MG) מצפק הקודקודית כדי להמחיש את עץ החלב.
  3. החזיקו בזהירות את הפטמה בעזרת מלקחיים של שען והסירו את הפטמה החיצונית מבלי לחתוך את העור הסמוך, תוך שימוש במספריים לניתוח מיקרו.
  4. לטעון ~ 3 – 5 μL של הזרקת לספירה הזרקה לתוך 25 μL המילטון מזרק עם המחט מתכת 33 G-hub מודבקת. העריכו את עוצמת תערובת ההזרקה במזרק המבוסס על הצבע הכחול הנכלל בתערובת.
    הערה: השתמש באמצעי אחסון קטן יותר (לדוגמה, 3 μL) בעת הזרקת לתוך MGs של 3-4 שבועות נשים זקנות ונפח גדול יותר (למשל, 10 μL) בעת הזרקת לתוך MGs של נקבות מניקות.
  5. בעדינות להחזיק את הקצה של כנף העור עם פינצטה מעוקל דק ולהזריק את תערובת הזרקה של הזמן לאט לתוך הפטמה, בינתיים ניטור התפשטות הצבע הכחול לעץ החלב. שמור על קצב ההזרקה נמוך ככל האפשר כדי למנוע נזק ללוטל לומן.
    הערה: נוזל מוזרק (כפי שמודגם על-ידי הצבע הכחול הכלול ברומאופנול) המתפשט בכל עץ הדוטל מבלי לדלוף לתא הסטרומה מעיד על הזרקה מוצלחת.
  6. בעדינות למשוך את המחט מן הפטמה כדי למנוע דליפה של הנוזל המוזרק.
  7. בחנו את הצד המרוחק (כלומר, הרחק מן הפטמה) של ה-MG או האזור שמסביב לפטמה המוזרקת. שימו לב כי צבע כחול מתנפח (כלומר, צבען מפזר לתוך הסטרומה הסמוכה) מעיד על הזרקת משטח שומן במקום בזריקה מוצלחת.
  8. סגרו את הפצעים המנתחים (משלב 3.2) בעור עם אטבי פצעים.

4. טיפול פוסט-פעיל

  1. להסיר את העכבר מן ההרדמה ולמקם אותו על משטח חימום בתוך כלוב נקי להתאוששות.
  2. תת-עורי מלוקסיב 5 מ"ג/ק"ג שוב, 24 שעות לאחר הניתוח.
  3. לעקוב אחר התנאים הכלליים של בעל החיים ולחפש סימנים של זיהום באתר החתך במשך 5 ימים.
  4. קליפי הפצע יוסרו ~ 7-10 ימים לאחר הניתוח.

5. ניטור התפתחות הגידול בחלב

  1. עקוב אחר העכברים המוזרקים פעמיים בשבוע על ידי מישוש עבור כל סימן של התפתחות הגידול בפטמות.
  2. לאחר הגידול מוחשי, לפקח על העכבר מדי יום ולמדוד את גודל הגידול עד שהוא מגיע נקודת הקצה ניסיוני, כפי שנקבע על ידי גודל (למשל, להגיע 10% – 15% ממשקל הגוף של העכבר) או מצב (למשל, כיבית או נקרוטיק) של הגידול, או על ידי מצב בריאותי כללי של העכבר (למשל, בתרדמת, מורבנד).
  3. המתת החסד של העכבר על ידי חנק פחמן דו חמצני, ואחריו שיטה משנית (למשל, פריקה צוואר הרחם).
  4. לבודד את רקמות הגידול בחלב ולנתח אותם על ידי הזרמת cy, החיסונית, או ביטוי בפרופיל (למשל, על-ידי רצפי RNA [RNAseq] או microarray), כפי שמתואר בעבר12.
  5. לבצע ניתוח הזרימה cytometric על ידי ביצוע עבור שושלת היוחסין-תאים שליליים (לין-: שלילי עבור סמנים השושלת CD45 [סמן לוקיציט], CD31 [מסמן תא אנדותל], ו TER119 [אריתרופויוקטה סמן]), ולנתח את התאים בגידול בהתבסס על ה ביטוי של YFP, CD24 ו-CD29.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מייצג את תוצאות ה-PCR R26Y ו- Trp53L מוצגים באיור 1.

למרות, בעיקרון, כל 10 MGs יכול להיות נתון הליך הזרקת הפנים, כמעט, שני המקלעים הרביעית הרביעי מסומנים בדרך כלל עבור הזרקה, בשל הנגישות הקלה שלהם בגדלים גדולים יותר MG (איור 2). במהלך הניתוח חשוב לשמור על שטח עבודה מחוטא ומסודר ולבצע את ההליך עם כלים סטריליים (איור 3

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההצלחה של גישה זו לגרימת גידולים בפטמות מקבוצות משנה שונות של MECs מסתמך לא רק על בחירת מתאים מסוג התא המתאים היזמים (כדי לנהוג ביטוי היצור) אבל גם על הליך הזרקת הפנים עצמו. הרעיון מאחורי הגישה הזאת הוא כי וירוסים מוזרק לאחר הספירה נשמרים עץ ductal, שהוא מבנה מוסתר עם לומן, ולכן, רק MECs חשופים לווירוסים והם נגועים על ידי לספירה. בשל החלל לומן מוגבלת בתוך צינורות הפטמות, חשוב רק להזריק נפח קטן של תערובת ההזרקה לכל MG (כלומר, ~ 3-5 μL). יש לכוונן את אמצעי האחסון המוזרק בהתאם לגיל העכברים (כלומר, אמצעי אחסון קטן יותר כאשר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) גרנט R01 CA222560 ועל ידי המחלקה להגנה פריצת דרך פרס W81XWH-18-1-0037.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחט 33 מדהמילטון7803-05סגנון נקודה 3 קהה
7 מ"מ קליפ רפלקס BraintreeScientificRF7 CS
Adenovirus, Ad-K5-Creאוניברסיטת איווה ליבת וקטור ויראליתAd5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)
אדנו-וירוס, Ad-K8-Creאוניברסיטת איווה ליבת וקטור ויראליAd5mK8-nlsCre
אלכוהול פישרHC800-1GALהכנה ל-70% בשימוש
ביוטינילציה CD31eBiosciences13-0311-85
ביוטינילציה CD45eBiosciences13-0451-85
ביוטינילציה TER119eBiosciences13-5921-85
ברומופנול כחולסיגמא-אולדריץ'B0126-25G
CD24-AF-700BD Pharmingen564237
CD24-PEeBiosciences12-0242-83
CD29-APCeBiosciences17-0291-82
CD29-PEeBiosciences12-0291-82
תחליב מסיר שיערNair9 Oz
מזרק המילטוןהמילטון7636-010.025 מ"ל
יודופורבטדין10% Povidone-יוד
איזופלורןבקסטרNDC 10019-360-401-2.5%
LoxicamNorbrookNDC 55529-040-105 מ"ג/מ"ל
חומר סיכה משחת עינייםAkornNDC 17478-062-35
מספריים מיקרו-ניתוחיםPentair9Mמלקחיים של שען
פינצטה מיקרו-ניתוחיםDumontM5
Taq 5X מאסטר מיקסניו אינגלנד ביולאבסM0285L

מקורות

  1. Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
  2. Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
  3. Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
  4. van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881(2014).
  5. Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
  6. Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
  7. Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
  8. Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
  9. Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
  10. Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
  11. Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
  12. Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431(2017).
  13. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
  14. Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
  15. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  16. The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  17. Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
  18. Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

הזרקת אדנווירוספרומוטור קרטין 8פרומוטור קרטין 5פלואומטריה (Flow Cytometry)דוח Rosa26-YFPתאי אפיתל של הגומלהמודל לסרטן השד
דוגמנות סרטן השד באמצעות הזרקת הפנים של המין-אדנווירוס המבטא לתוך בלוטת החלב של העכבר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.