באצווה מחוץ לגופית-מודל תרבות להעריך את ההשפעות של משטרי התערבותית על האדם מיקרוביוטה בצואה

Shokouh Ahmadi; Shaohua Wang; Ravinder Nagpal; Rabina Mainali; Sabihe Soleimanian-Zad; Dalane Kitzman; Hariom Yadav

doi:10.3791/59524

מאמר שיטה

באצווה מחוץ לגופית-מודל תרבות להעריך את ההשפעות של משטרי התערבותית על האדם מיקרוביוטה בצואה

DOI:

10.3791/59524

⸱

31 ביולי 2019

Shokouh Ahmadi^*¹^,²^,³ , Shaohua Wang^*¹^,² , Ravinder Nagpal^*¹^,² , Rabina Mainali¹^,² , Sabihe Soleimanian-Zad³^,⁴ , Dalane Kitzman⁵ , Hariom Yadav¹^,²

¹Department of Internal Medicine- Molecular Medicine, Wake Forest School of Medicine, ²Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest School of Medicine, ³Department of Food Science and Technology, Isfahan University of Technology, ⁴Research Institute for Biotechnology and Bioengineering, College of Agriculture, Isfahan University of Technology, ⁵Department of Geriatrics and Gerontology, Wake Forest School of Medicine

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את מערכת התסיסה התרבותית של תרבות האצווה האנושית של מיקרוביוטה בצואה, באמצעות אינולין (באופן מוכר, ואחד מהמיקרוביוטה הנפוצים ביותר) כדי להדגים את השימוש במערכת זו בהערכת השפעות ספציפיות התערבויות על הרכב microbiota צואה ופעילויות מטבולית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפקיד המתעוררים של מיקרובידום הבטן במספר מחלות אנושיות דורש פריצת דרך של כלים חדשים, טכניקות וטכנולוגיות. שיפורים כאלה נחוצים כדי לפענח את הניצול של מודולים microbiome עבור הטבות בריאות האדם. עם זאת, ההקרנה בקנה מידה גדול אופטימיזציה של מודולטורים כדי לאמת אפנון microbiome ולנבא יתרונות בריאותיים קשורים עשוי להיות קשה כמעט בשל הצורך במספר רב של בעלי חיים ו/או בעלי האדם. לשם כך, במודלים של מבחנה או vivo ex יכול להקל על הקרנה ראשונית של מאפטורים מיקרובידום. בזאת, הוא ממוטב והפגינו לשעבר מערכת התרבות microbiota vivo הצואה שניתן להשתמש בהם כדי לבחון את ההשפעות של התערבויות שונות של מאפטורים במעיים של המעי, כולל פרוביוטיקה, prebiotics ורכיבים אחרים מזון, מלבד ותרופות, על הגיוון וההרכב של מיקרוביוטה המעי האנושי. אינולין, אחד התרכובות הנפוצות ביותר במחקר prebio, ו microbiome מודולטורים, משמש כדוגמה כאן כדי לבחון את השפעתו על הרכב מיקרוביוטה צואה בריא ופעילויות מטבולית שלה, כגון בצואה pH ורמות צואה של חומצות אורגניות כולל חומצות שומן לקטט ושרשרת קצרות (SCFAs). הפרוטוקול עשוי להיות שימושי עבור מחקרים שנועדו להערכת ההשפעות של התערבויות שונות של מודולטורים על פרופילי microbiota צואה ובניבוי השפעות בריאותיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbiota האדם היא קהילה מורכבת המורכבת של חיידקים, הארכנות, וירוסים ו-איקריוטית חיידקים¹, כי לאכלס את גוף האדם פנימי וחיצוני. העדויות האחרונות הקימו את התפקיד הבסיסי של המעיים microbiota ואת המעיים מיקרובידום (האוסף כולו של חיידקים והגנים שלהם נמצא במערכת העיכול האנושית) במחלות אנושיות שונות כולל השמנה, סוכרת, מחלות לב וכלי דם, וסרטן¹^,²^,³. בנוסף, המיקרואורגניזמים החיים בבטן שלנו לייצר ספקטרום רחב של מטבוליטים אשר משפיעים באופן משמעותי על הבריאות שלנו, יכול גם לתרום הפתופסולוגיה של מחלות מספר, כמו גם מגוון של פונקציות מטבוליות⁴^, ⁵. שינויים חריגים (רטבאליות) בקומפוזיציה ובתפקוד של אוכלוסיית המעיים הזאת מכונים בדרך כלל כ "תחושת בטן". דיסביוזיס משויך בדרך כלל עם מצב לא בריא של המארח ולכן ניתן לבדיל מן הקהילה הטבעית (הומאטית) הקשורים במצב בריא של המארח. דפוסים ספציפיים של המעיים מיקרובידום דיסביוזיס מצויים לעתים קרובות במחלות שונות¹^,²^,³^,⁶^,⁷.

התסיסה של מזון בלתי מתעכל, במיוחד פחמימות fermentable/סיבים, על ידי מיקרוביוטה בטן לא רק תשואות אנרגיה אלא גם מייצרת מטבוליטים מפוצלים כולל חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFAs), לקטט, formate, פחמן דו חמצני, מתאן, מימן, ואתנול⁶. בנוסף, מיקרוביוטה המעיים מייצרת גם מספר חומרים ביולוגיים אחרים כגון חומצה פולית, ביוטין, טרימטוליאמין-N-תחמוצת, סרוטונין, טריפטופן, חומצה גמא-עמינח בוטירית, דופמין, נוראדרנלין, אצטילכולין, היסטמין, חומצה דאוקסיכופילית ו-4-אתיל סולפט. הדבר מתרחש בעיקר באמצעות הניצול של פלקסים מטבולית פנימית בתוך נישה חיידק מארח, אשר תורמת בכמה תהליכי הגוף, פונקציות מטבולית ושינויים אפיגנטיים¹^,⁸^,⁹^,. בסדר, ^עשר עם זאת, ההשפעות של התערבויות שונות על מוצרים מסוג זה להישאר אירעה או לא ברור בשל היעדר קל, יעיל ומהווה פרוטוקולים להיות ברורים. הרכב מיקרוביוטה של הבטן האנושית הוא מערכת אקולוגית מורכבת ומגוונת ביותר, ולכן, שאלות רבות לגבי תפקידה בבריאות האדם ובמחלות המחלה עדיין נשארות ללא מענה. ההשפעות של הרבה במעי המשותף מודולטורים הנפוצים (למשל, פרוביוטיקה, prebiotics, אנטיביוטיקה, השתלת צואה וזיהומים) על הרכב פונקציות מטבולית של microbiome המעי להישאר חמקמק במידה רבה. בנוסף, הבדיקה והאימות של תופעות אלה ב vivo הוא קשה, במיוחד משום שרוב החומרים המזינים ומטבוליטים המיוצרים על ידי מיקרוביוטה המעיים נספגים או נפטרים של בו זמנית ובמהירות בבטן; לכן, מדידת הייצור, כמות ועיבוד של מטבוליטים אלה (g., SCFAs) ב vivo עדיין נשאר אתגר מעשי. אכן, מודלים פיזיולוגיים כגון בעלי חיים ונושאים אנושיים הם קריטיים לקביעת התפקיד של מיקרובידום המעיים והאפנון שלה על בריאות מארח, אבל אלה לא יכול להיות מתאים הקרנת בקנה מידה גדול של סוגים שונים של מודולים microbiome בשל אילוצי מוסר, כספיים או זמן. לשם כך, ב-vivo מבחנה ו/או לשעבר מודלים, כגון culturing של מיקרוביוטה במבחנה ולאחר מכן להתערב עם מודולים microbiota שונים, יכול להציע זמן וכסף הזדמנויות ומכאן יכול לאפשר הקרנה ראשונית או בקנה מידה גדול של מרכיבים שונים (כגון פרוביוטיקה, prebiotics, ותרכובות התערבותית אחרים) כדי לבחון/לנבא את ההשפעות שלהם על הגיוון microbiota צואה, קומפוזיציה ופרופילים מטבוליים. מחקרים באמצעות כגון מערכות מחוץ לvivo לשעבר של מיקרובידום הבטן עשוי להקל על הבנה נוספת של המארחים-microbiome מארח שתורמים לארח בריאות ומחלות, והוא יכול גם להוביל למציאת טיפולים חדשניים המטרה מיקרובידום ל שפר בריאות המארחת ולמנוע ולטפל במחלות שונות¹.

למרות שמערכות התרבות של מיקרוביוטה בבטן החוץ לא יכולות לשכפל באמת את תנאי המעיים הממשיים, מספר מעבדות השתדלו לפתח מודלים כאלה, שחלקם נמצאו מעשי במידה מסוימת והשתמשו בהם בהצלחה ל מטרות שונות. אחד מדגמי הבטן האחרונים הוא סימולטור של המערכת האקולוגית של מעיים אנושיים, אשר מחקה את מערכת העיכול האנושית כולה, כולל הקיבה, המעי הדק, ואזורים שונים של המעי הגס. עם זאת, מודלים מורכבים מבחינה טכנית לא יהיו נגישים למתקני מחקר אחרים ברחבי העולם. לכן, יש עדיין צורך קריטי לפיתוח דגמים חלופיים חדשים, כי הם פשוטים יחסית, במחיר סביר ומעשי עבור מעבדות לימוד מודולים microbiome ואת ההשפעות שלהם על המעיים microbiome ובריאות מארח. מכאן, השימוש של מבחנה (או ex vivo) מערכת התרבות מיקרוביוטה הצואה יהיה שימושי ללמוד את ההשפעות של התערבויות כאלה¹¹^,¹². באופן ספציפי, את ההשפעה של prebiotics שונים על קיבולת תסיסה microbiota מבחינת שינויים תקופתיים מגוון מיקרוביוטה הבטן והרכב, ה-pH צואה, ואת רמות של מטבוליטים מיקרוביאלית כולל SCFAs ו לקטט ניתן ללמוד ¹³. בזאת, באמצעות אינולין (אחד הרכיבים הנפוצים ביותר לחקור prebiotic יוטי) כדוגמה של מודול microbiome, הפרוטוקול צעד אחר צעד של מערכת האצווה vivo microbiome פשוטה זו לשעבר מתוארים כדי להדגים את השימוש בה כדי להעריך את ה שינויים במיקרוביוטה הצואה ומיקרוטבוליטים בעקבות התערבות עם מודולים מיקרובידום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התראה: עיין בגיליונות הנתונים של בטיחות החומרים המתאימים ופעל לפי ההנחיות וההנחיות להכשרה מתאימה ברמת בטיחות ברמה 2 (BSL-2). בצע את כל השלבים culturing לפי כללי אבטחה טיחות סטנדרטי להשתמש בקבינט bsl-2 בתנאים אספטי. יתר על כן, דגימות צואה מדגמים שונים ונושאים אנושיים עשויים להיות סיכון פוטנציאלי להפצת מחלות המועברות בחיידקים. פנו מיד לעזרה רפואית בהתרחשות כל פציעה וזיהום. בנוסף, יש לקבל את השימוש בדגימות הצואה של בני אדם ובעלי חיים באמצעות ועדות אתיות מוסדית ולהיות מתאימות לפרוטוקולים לשימוש בדגימות ובמידע על הנושא.

1. הכנת המדיה התרבותית

הכנת מדיית התרבות, הכנת תשעה סוגים של פתרונות מניות
1. פתרון A (1,000 mL): התמוססות 5.4 g של נתרן כלוריד (היום), 2.7 גרם של אשלגן דו-חמצני ימן פוספט (KH₂PO₄), 0.16 g של סידן כלוריד דו-חמצני ידרוקסיד (cacl₂· 2h₂O), 0.12 g של מגנזיום כלוריד הקסאומיים (mgcl .2· 6h₂o), 0.06 גרם של מנגן כלוריד הטטרמים (mncl 2 · 4h₂o), 0.06 g של הקסאואוס כלוריד (cocl₂· 6h₂o), ו 5.4 g של אמוניום סולפט (NH₄)₂כל כך₄, במים מפוהים כדי להפוך את הנפח הכולל ל 1,000 mL.
2. פתרון B (1,000 mL): התמוססות 2.7 g אשלגן מימן פוספט (K2HPO4) במים מוכי להפוך נפח כולל ל 1000 mL.
3. מעקב פתרון מינרלי (1,000 mL): התמוססות 500 mg של ניתרן ethylenediamine-טטראצטט ניתרן ידרוקסיד (Na₂edta), 200 מ"ג של סולפט ברזלי הפטבמים (feso₄· 7h₂O), 10 מ ג של אבץ סולפט הפטבמים (לייפוסו₄ · 7H₂o), 3 מ ג של מנגן (II) כלוריד (MnCl₂· 4h₂O), 30 מ ג של חומצה זרחתית (H₃PO₄), 20 מ"ג שלcocl 2 · 6h₂O, 1 מ ג של cupric כלוריד dihydrate ידרוקסיד (cucl₂ · 2H₂o), 2 מ ג ניקל (II) כלוריד הקסהמים (nicl₂· 6h₂o) ו 3 מ"ג של נתרן molybdate dihydrate (Na₂MoO₄· 2h₂o) במים מאוהים כדי להפוך נפח כולל ל 1,000 mL.
  הערה: פתרון זה הוא רגיש באור, ולכן להבטיח להיות מאוחסן בצינורות כהים/שחור או אלומיניום עטוף/בקבוקים.
4. פתרון ויטמין מסיס מים (1,000 mL): התמוססות 100 מ"ג של תיאמין הידרוכלוריד (תיאמין-HCl), 100 מ"ג של D-פנטטאז חומצה, 100 mg של ניאצין, 100 mg של pyridoxine, 5 מ"ג של P-האמיזואיקון חומצה ו-0.25 mg של ויטמין B12 במים מוכי להפוך את הנפח 1,000 מ ל.
5. חומצה פולית: הפתרון ביוטין (1,000 mL): התמוססות 10 מ"ג של חומצה פולית, 2 מ ג של D-ביוטין ו 100 מ"ג של אמוניום ביקרבונט (NH₄hco₃) במים מיועמים כדי להפוך נפח כולל ל 1,000 mL.
6. הריבופלאווין פתרון (1,000 mL): לפזר 10 מ"ג של ריבופלאווין ב 5 מ"מ HEPES (1.19 g/L) פתרון כדי להפוך את הנפח הכולל ל 1,000 mL.
7. הפתרון hemin (10 מ ל): לפזר 5,000 מ"ג של Hemin ב 10 מ"מ נתרן הידרוקסיד (NaOH) (0.4 g/L) פתרון כדי להפוך את הנפח הכולל ל 10 mL.
8. שרשרת נמוכה חומצת שומן ערבוב (10 מ ל): לשלב 2.5 mL של N-valerate 2.5 מ ל של isovalerate 2.5 mL של שיעור איזובוטיש ו2.5 mL: DL-α-מתילבוטיש.
  הערה: פתרון זה מומלץ להשתמש בתוך מאדים כדי למנוע ריח ואדים.
9. Resazurin (1,000 mL): לפזר 1 גרם של resazurin מים מוכי להפוך את הנפח הכולל ל 1,000 mL.
מדיום משמש לתסיסה אנאירובית מחוץ לגוף
1. כדי להכין מדיה זו, לערבב 330 mL של פתרון A, 330 mL של פתרון B, 10 מ ל של פתרון מינרלים עקבות, 20 מ ל של פתרון ויטמין מסיס מים, 5 מ ל חומצה פולית: ביוטין פתרון, 5 מ ל של פתרון הריבופלאווין; 2.5 מ ל של הפתרון Hemin, 0.4 mL של שרשרת שומן קצר לערבב חומצת, 1 מ ל של Resazurin, 0.5 g של תמצית שמרים, 4 גרם של נתרן פחמתי (Na₂CO₃), 0.5 g של cysteine HCl-H₂O, ו-0.5 g של טריטיקרה, ולהוסיף 296.1 mL של מים מזוקקים.
2. בדוק את ה-pH ולוודא שזה בסביבות 7.0, אם לא, להתאים את ה-pH עם 1 N HCl או N NaOH. עיקור על ידי ואקום סינון התקשורת באמצעות מסנן בקבוק תחת תחנת העבודה אספטי.
3. לחילופין, מערבבים את כל הרכיבים (למעט הויטמין והפתרונות המין) ומ121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ומצננים את טמפרטורת החדר. במקביל, מסננים לחטא ויטמין ופתרונות המין באמצעות מסננים 0.22 יקרומטר ממברנה ולהוסיף אותם לתוך מדיה אוטומטית ומקורר לפני החילוק.

2. הכנת חדר אנאירובי וחומר נדרש

שמור את כל החומרים, הפתרונות והכלים הדרושים לניסוי התסיסה בתוך החדר האנאירובי לפחות 48 h לפני תחילת הניסוי, כדי להבטיח כי כל שרידי חמצן הקשורים כלים וחמצן מסיסים במאגרים/פתרונות הוא להסיר את כל החומרים הם ההסתגלות לתנאים אנאירובית להגדיר.
הערה: חומרים הדרושים בתוך קאמרית אנאירובית (48 h מוקדם יותר של ניסוי להתחיל): (i) מדיה תסיסה; (ii) פתרון אנאירובי (מוכן לפי סעיף 4.1), (iii) vortexer, (iv) איזון במשקל, (v) מולין גבינה בגדים, (vi) מספריים, (vii) משפך, (viii) 1.5, 2.0, 15, 50 מ"ל צינורות, (ix) הפיפטורים (2, 20, 200 ו-1,000 μL) ולקבל טיפים תואמים pipet, (x) אקדח pipet ו pipet מחמד (5 ו 10 mL), (xi) נייר רקמות, (xii) סמנים, (xiii) הצינור עומד על צינורות שונים, (xiii) פסולת תיבת, (15) O₂ אינדיקטור ו (השישה עשר) 70% אתנול בקבוק תרסיס (חיטוי).

3. הכנת צינורות וסיבים

משקל 300 מ ג של אינולין והעברה לצינור 50 mL ואחריו בתוספת הספטטית של 26 מ ל של מדיית תסיסה כבר מוכן ומאוחסן בחדר אנאירובית. הכינו צינורית אחת ריקה לכל סוג דגימת צואה ושפופרת ניסוי (של) (על פי מספר התרכובות שנבדקו), בטרילקאט.
השאירו את הצינורות האלה בתוך החדר האנאירובי למשך כ -24 שעות כדי לאפשר לחות של דגימות לפני תחילת ניסוי התסיסה. ודא שטמפרטורת הצינור היא 37 ° c בזמן החיסונים, ולכן הביאו את הצינורות בחממה התחומה בתוך התא האנאירובי.

4. הכנת הרשת

תמיסת דילול אנאירובית (לפחות 48 h לפני ניסוי תסיסה): התמוססות 5 גרם של הנרוג, 2 גר' גלוקוז ו-0.3 g של Cysteine-HCl במים ממוהים והפוך נפח כולל ל 1,000 mL. אוטוקלב ולאחסן אותו בתוך התא אנאירובי לפחות 48 h לפני השימוש.
הכנת הצואה (ביום הניסוי התסיסה): שוקל 5 גרם של דגימת צואה טרייה בצינור ה50 mL, להוסיף תמיסת דילול אנאירובית עבור נפח סופי של 50 mL (1:10 w/v) ו מערבולת עבור 15 דקות או עד הומוגניים לחלוטין. מסננים את התערובת הומוגניים באמצעות 4 שכבות של גזה סטרילי (אוטוקלבד) ולהשתמש בו מיד לחיסון הצינורות המכילים מדיה.
הערה: דגימות צואה מתוך קבוצה של נושאים יכול להיות ממאגר אם המטרה הניסיונית היא להשוות את ההשפעה של תרכובת נתונה/המרכיב על בריא כללי לעומת הצואה החולה microbiota בכלל.

5. תסיסה ודיגום

הכינו צינורות בהתאם לסעיף 4.2 ו-האיחסן ריק/בקרה וצינורות ניסיוני עם 4 מ ל של בצואה מדולל ומסוננים. דגירה את הצינורות מחוסן ב 37 ° c בתוך התא אנאירובי. לנער את הצינורות פעם בשעה על ידי היפוך בעדינות כדי להשעות מחדש את הסיבים והאינואוטים.
לאסוף דגימות לעתים קרובות לפי הצורך, למשל, מדי שעה כדי 0, 3, 6, 9 ו 24 h במהלך התסיסה על ידי לקיחת 2 מ ל המדגם לתוך שפופרת 2 mL מצינורות המתאימים ההתאמה.
למדוד את ה-pH של האליבורטים באמצעות מד pH מעבדה (על ידי הכנסת ישירות את האלקטרודה pH במדגם); צנטריפוגה את המדגם הנותר ב 14,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. הקפא מיד את הסופרנטאנט ואת הגלולה בחנקן נוזלי, ולאחר הקפאת ההקפאה, אחסן את הסופרנטנט לניתוח SCFAs וכלי הגלולה לניתוח microbiome ב-80 ° c.

6. חומצות שומן קצרות (SCFAs) ולקטט קוונפיקציה

הערה: Scfas ולקטט ב-supernatant של תרבות microbiome ניתן למדוד בדיוק על פי השיטות המפורטות במקום אחר¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶.

בקצרה, להפשיר את הצמד הקפואים supernatants שהתקבלו בסעיף 5 מתוך שליטה דגימות הטיפול על קרח ולבצע את כל הצעדים לעיבוד נוסף על הקרח. לסנן את supernatant באמצעות מסנן ממברנה 0.45 יקרומטר ולהשתמש בדגימות ללא תא כדי למדוד את ריכוזי scfas ו לקטט באמצעות מערכת המדידה עם גלאי אבא ב 210 nm, מצויד בטור hpx-87. השתמש בנפח ההכנסה של 10 μL לכל דוגמה והשתמש ב-H₂SO₄ (0.005 N) כדי לבצע העמודה בקצב הזרימה של 0.6 mL/Min ב-35 ° c.

7. ניתוח מיקרובידום בצואה

הערה: בצע ניתוח microbiome בעקבות שיטות וצינור מפורט במקומות אחרים⁷^,¹³^,¹⁴^,¹⁷.

בקצרה, לחלץ דנ א גנומית מתוך כ 200 מ"ג של כדורי להשתהות בצואה באמצעות ערכת ה-DNA בצואה החילוץ ערכה¹³.
להגביר את האזור hypervariable שתנה של הגן החיידקי של 16S rRNA באמצעות התחל מקודד לפי השיטה המתוארת במקום אחר¹³, באמצעות רצפים פריימר כפי שמתואר בתוך האדמה Microbiome פרויקט בפרוטוקול¹⁸.
לטהר את הגברה וכתוצאה מכך עם חרוזי טיהור מגנטיים ומכמת על ידי Picogreen או שיטה מקבילה. מאגר מוצרי ה-PCR המטוהרים בריכוז מולרי שווה וברצף על מערך¹³.
לעבד את הרצפים הנובעים עבור דה-ריבוב, סינון איכות וקיבוץ באשכולות, הקצאת מיסים, ואקום, וניתוח במורד הזרם באמצעות תובנות כמותיים לתוך מיקרוביאלית (QIIME) תוכנה לפי השיטות המתוארות על ידי קאוראסו ואח '¹⁹.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול משמש כדי להדגים את ההשפעה של ביוביוטיקה ספציפית (כלומר, אינולין על הרכב microbiota ופעילויות מטבוליות במונחים של שינויים ב-pH צואה ואת הריכוז של לקטט ו scprea בצואה של נושאים אנושיים בריאים על נקודות זמן שונות לאחר הטיפול עם אינולין). ה-pH צואה, רמות צואה של לקטט ו SCFAs (איור 1), ואת הרכב microbiota (איור 2 ואיור 3) נמדדים ב 0 (בסיס), 9 ו-24 שעות של דגירה עם או בלי אינולין. התוצאות להפגין ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל תסיסה בצואה מבחנה מוצג כאן הוא מודל פשוט אצווה יחיד לקירוב ההשפעות של מצעים שונים וזנים מיקרוביאלית (למשל, prebiotics ו פרוביוטיקה) על ההרכב של האדם microbiota בצואה, כמו גם ה פעילות מטבולית במונחים של הצואה pH ו SCFAs רמות. התוצאות המוצגות בזאת להפגין כי החיסונים של אינולין מקטין את ה-pH בצואה ומגדיל באופן משמעותי את רמות scfas ו לקטט בדגימה בצואה מטופלים אינולין לעומת התרבות המיקרוביוטה בצואה שאינם מטופלים (איור 1). בנוסף, חתימת המעיים מיקרוביוטה מופיעה גם כשונה מדגימות שאינן מטופלות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים בהכרת תודה את תמיכתם של המרכז לסוכרת, השמנת יתר ומטבוליזם ומרכז המדע הקליני והטרנסלtional, בית הספר לרפואה של יער ההתעוררות, מחלקת מימון ההגנה (מספר מענק: W81XWH-18-1-0118), הכיסא השני של קרמיט גלן פיליפס ב רפואת לב וכלי דם; המכון הלאומי לבריאות במימון קלוד ד. פפר מבוגרים אמריקאים מרכז (ממומן על ידי P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 ומרכז המדע הקליני וטרנסלtional (יחידת המחקר הקליני, ממומן על ידי UL1TR001420), מודה גם למרבה המזל. אנו מודים גם למתנדבים שסיפקו דגימות צואה, וחברי המעבדה האחרים שלנו לעזרה טכנית במהלך ניסוי זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אמוניום ביקרבונט (NH<תת>4HCO₃)	סיגמא-אולדריץ	217255
אמוניום סולפט (NH₄)₂SO₄	TGI	C2388
סידן כלוריד דיהידרט רעיל (CaCl₂• 2H₂O)	Sigma-Aldrich	C3306	מגרה
קובלטוס כלוריד הקסהידרט (CoCl₂• 6H₂O)	Sigma-Aldrich	255599
קופרי כלוריד דיהידראט (CuCl₂& bull; 2H₂O)	Acros אורגניים	2063450000
ציסטאין-הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	C121800
D-ביוטין	סיגמא-אולדריץ'	B4501
D-חומצה פנטותנית	Alfa Aesar	A16609
דיסודיום אתילנדיאמין-טטראצטט דיהידרט (Na₂EDTA)	Biorad	1610729
DL-α-methylbutyrate	Sigma-Aldrich	W271918
ברזל סולפט Heptahydrate (FeSO₄• 7H₂O)	Sigma-Aldrich	F8263
חומצה פולית	Alfa Aesar	J62937
גלוקוז	Sigma-Aldrich	G8270
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039
Hepes	Alfa Aesar	A14777
Isobutyrate	Alfa Aesar	L04038
Isovalerate	Alfa Aesar	A18642
מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl₂• 6H₂O)	Sigma-Aldrich	M8266
מנגן כלוריד טטרהידרט (MnCl₂• 4 שעות<תת>2O)	סיגמא-אולדריץ	221279
ניאצין (חומצה ניקוטינית)	סיגמא-אולדריץ	N4126
ניקל(ii) כלוריד הקסהידרט (NiCl₂• 6H₂O)	Alfa Aesar	A14366	Toxic
N-valerate	Sigma-Aldrich	240370
P-aminobenzoic acid	MP סין	102569	חומצה זרחתית רעילה ומגרה
(H₃PO₄)	Sigma-Aldrich	P5811
אשלגן דימימן פוספט (KH₂PO< תת>4)	סיגמא-אולדריץ'	P5504
אשלגן מימן פוספט (K₂HPO₄)	סיגמא-אולדריץ'	1551128
פירידוקסין	אלפא Aesar	A12041
רזזורין	סיגמא-אולדריץ'	R7017
ריבופלבין	אלפא	Aesar A11764
נתרן פחמתי (Na₂CO₃)	Sigma-Aldrich	1613757
נתרן כלורי (NaCl)	Fisher BioReagents	7647-14-5
נתרן הידרוקסיד (NaOH)	Fisher Chemicals	S320
נתרן מוליבדט דיהידראט (Na₂MoO₄& bull; 2H₂O)	Acros אורגניים	206375000
תיאמין הידרוכלוריד (Thiamin-HCl)	Acros אורגניים	148991000
Trypticase	, BD Biosciences	211921
ויטמין B12	Sigma-Aldrich	V2876
	Sigma-Aldrich	70161
אבץ גופרתי הפטהידראט (ZnSO₄& 7H₂O)	Sigma-Aldrich	Z0251
0.22 & m ממברנה מסנן
AMPure חרוזי טיהור מגנטי	Agencourt
תא אנאירובי עם חממה	Forma מערכת אנאירובית, Thermo Scientific, ארה"ב
בקבוק מסנן	Corning
Cheesecloth
Illumina MiSeq רצף	Miseq ערכת ריאגנט v3
מד
Qiagen PowerFecal ערכת	Qiagen
תובנות כמותיות לאקולוגיה מיקרוביאלית (QIIME) תוכנה
Qubit-3 פלואורמטר	InVitrogen
Vortex	Thermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC system	Waters Corporation

' רעיל, מגרה רעילה ' ' , תמצית שמרים ,pH

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112(2015).
O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649(2018).
Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897(2018).
Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474(2018).
Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28(2018).
Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
Chen, M. -H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), e44 41-53 (2018).
Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

באצווה מחוץ לגופית-מודל תרבות להעריך את ההשפעות של משטרי התערבותית על האדם מיקרוביוטה בצואה

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים