הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59561

⸱

10 ביולי 2019

 ,  , 
1Center for Neuroscience and Regenerative Medicine, Uniformed Services University, 2Department of Anatomy, Physiology, and Genetics, Uniformed Services University, 3Graduate Program in Neuroscience, Uniformed Services University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגים מתודולוגיות עבור מודל העכבר של פגיעה במוח הגולגולת טראומה טראומטית השתלת הגוף האנושי המושרה pluripotent שפעה התאים הנגזר לתוך האתר פציעה. מבחנים התנהגותיים והיסטולוגיים של תוצאות מהליכים אלה מתוארים גם בקצרה.

תקציר

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא גורם מוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם. פתולוגיה של מחלות בשל TBI מתקדמת העלבון המכני העיקרי לתהליכי פציעה משניים, כולל אפופטוזיס ודלקת. מידול בעלי חיים היה בעל ערך בחיפוש כדי לפענח את מנגנוני הפציעה ולהעריך טיפולים נוירוהגנה פוטנציאליים. פרוטוקול זה מתאר את מודל ההשפעה הקורטיקלית הנשלטת (CCI) של מוקד, TBI בראש פתוח. במיוחד, הפרמטרים להפקת פציעה בקליפת הגוף קל מתונה מתוארים. השלכות התנהגותיות של CCI מנותח באמצעות מבחן ההסרה של סרט דביק של אינטגרציה דו sensorimotor. בנוגע לטיפול ניסיוני לפתולוגיה TBI, פרוטוקול זה ממחיש גם תהליך לזריעה של תאים מתורבתים במוח. תרביות תאים עצביים נגזר מתאי גזע המושרה על ידי האדם (hiPSCs) נבחרו עבור הפוטנציאל שלהם כדי להראות שיקום פונקציונלי מעולה בחולים TBI האדם. הישרדות כרונית של hiPSCs ברקמת המוח של העכבר המארח מזוהה באמצעות תהליך שונה של הליך אימונוהיסטוכימיה.

מבוא

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא מונח כללי עבור הפגיעה הנרכשת במוח עקב כוחות מכניים עקיפים (האצה בסיבוב/האטה או קונטרה-הפיכה) ממכות לראש או נזק ישיר מחפצים או גלי הדף. Tbi הוערך להיות הגורם בערך 9% ממקרי המוות ברחבי העולם ונצפתה ב 50,000,000 במקרים מוערכים לשנה1,2. 2017 דיווח מהמרכזים לבקרת מחלות ומניעתן שנאמד ב-2013, היו סך של 2,800,000 ביקורים בבתי חולים ומקרי מוות עקב TBI בארצות הברית3. הרבה מאוד מתון. TBI רציני יכול להוביל לפגיעה לכל החיים של הכרה, תפקוד מוטורי, ואיכות העולם הכוללת. ההשלכות של tbi מתון, במיוחד הקשורות לספורט חוזרים tbi, היו רק לאחרונה העריכו את ההשפעות הבריאותיות חתרני שלהם4,5.

מידול קדם-קליני הוא מרכיב חיוני בפיתוח תובנות מכניסטיות חדשות וטיפול משחזרת פוטנציאלי עבור TBI. השפעת הקליפה הנשלטת (CCI) של TBI היא דגם של ראש פתוח של פציעה מכנית של חבלה בקליפת המוח. את פרמטרי ההשפעה ניתן לשנות כדי לייצר פציעות CCI כי נע בין קל עד חמור6. פציעות CCI הן מיקוד ולא מפוזר, כפי שנראה עם דגמי ראש סגורים אחרים של TBI. CCI ניתן לבצע כדי לגרום לפציעה חד צדדית, כך קליפת המוח יכול לשמש המשווה הפנימי. פרוטוקול זה ממחיש את המאפיינים של CCI מתון לחלק של קליפת המוח המקיף את האזורים הראשוניים והמנועים העיקריים. אזור קליפת הגוף הזה נבחר למעורבותו בהתנהגויות sensorimotor שבהן בדיקות התנהגות רבות יכולות לזהותאת החסרונות המושרה בפציעה. שיפורים התנהגותיים בשל התערבויות טיפוליות עבור TBI ניתן לזהות גם.

סימן ההיכר של TBI הוא התפקוד העצבי הנרחב באזור הנפגע. הנוירונים נפצעו עוברים מוות תאים, וקישוריות הרשת העצבית מופרת8,9. TBI משבש את הגיוס של תאי גזע אנדוגני, אשר מוביל התנהגות נוספת במורד הזרם של כדורי10,11.  השתלת תאים גזע עצבי תאים גזע נגזר כבר נחקרו כאפשרות לשחזר את הפונקציה במוח הפצוע. בנוסף לפוטנציאל לשחזר המעגלים העצביים פגום, תאים מושתלים להפעיל אפקטים הפרצינית המעודדים הישרדות עצבית התאוששות פונקציונלית מ TBI12. מגוון סוגי תאים כבר מושתלים מראש כדי להעריך את הפוטנציאל המשחזרת שלהם במודלים של הפרעות נוירולוגיים13,14,15. הפופולריזציה האחרונות של טכנולוגיה תא גזע מושרה pluripotent16 יש הקלה על פיתוח של קווי גזע אנושי רבים לשימוש ניסיוני. בדיקות קדם-קליניות עם תאים שמקורם בהיסק היא צעד ראשון חשוב לאפיון יעילות טיפולית פוטנציאלית של קו התאים נגד מחלות אנושיות. מעבדה זו פיתחה פרוטוקולים להבדיל hiPSCs פנוטיפים עצביים17 במרדף אחר התאים שתילת שולחנות כדי לסייע התאוששות מפציעה טראומטית המוח.

ניסויים בפרוטוקול זה להשתמש CCI חד צדדית כדי לגרום TBI אל הסוחושי השמאלית ואת קליפת המנוע של עכברים מבוגרים. פציעה מתונה של CCI גורמת לגרעון תפקודי מתמשך, אשר משמש למעקב אחר ההשפעות של התא העצבי הנגזר של היפנוסק על התאוששות פונקציונלית. בדיקה מsensorimotor בפרוטוקול זה הותאמה ממתודולוגיה שהוקמה על ידי Bouet ועמיתיו18 והפגינו בעבר על ידי פלמינג ועמיתיו19.  פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מלאה לביצוע פציעה מוחית ניסיונית, השתלת תרפיה של תאי ירכיים, ניתוח התנהגותי והיסטולוגית של צעדי התוצאה הניסיונית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה נבדקו ואושרו על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטה של השירותים במדים.

1. השפעה בקליפת הגולגולת וההשפעה הקורטיקלית

  1. הכנת המכשיר הנשלט ההשפעה בקליפת המין וציוד כירורגי.
    1. טען 1 מ"ל להחליק-טיפ מזרק עם 0.5 mL של תמיסת מלח סטרילי עבור השקיה בפצע. חברו מחט של 25 גרם למזרק כדי לשלוט בהשקיה.
    2. הכינו פתרון מדלל של CsA ב DMSO לריכוז סופי של 1 מ"ג/mL. טען שנייה 1 mL-טיפ מזרק עם 0.5 mL של הפתרון cyclosporine A (CsA) עבור דיכוי חיסוני. לצרף המחט 25 גרם או גדול יותר למזרק CsA.
    3. חברו את ההשפעה הכאולית הנשלטת בוכנה לזרוע על מסגרת סטריאוטקאית ומוגדרת לזווית של 15 °. הצמד בדיקה impactor חקן 3 מ"מ לבוכנה.
    4. הגדר את המהירות של ההשפעה על 1.5 m ו ההשפעה לשכון זמן כדי 0.1 s כדי לייצר פציעה קורטיקלית קלה.
  2. בצע כריתת גולגולת צדדית
    1. למקם את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה מחובר לתוך מאדה isofane עם מקור חמצן דחוס. לגרום הרדמה עם ~ 3% isofהלביאן ב ~ 0.7 L/min חמצן. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה הבוהן צביטה.
    2. לגלח את הקרקפת באמצעות קוצץ חשמלי ולמחוק כל פרווה רופף.
    3. למקם את העכבר בתוך מסגרת סטריאוטקאית עם מצורף משלוח הרדמה האף.
      1. מניחים כרית התחממות עד 37 ° c על מסגרת סטריאוטקאית מתחת לעכבר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף תחת הרדמה. תקן את הראש במקום עם פסי האוזן וחטיף ומכוון את הראש כך העצם הקדמית הגולגולת הוא אופקי. שמור על הרדמה ב-~ 1.5%-2%. במשך הניתוח
    4. כדי לבצע טיפול טרום הניתוח והכנה כירורגית אספטי, החל משחה אופטלמולוגית לעיניים באמצעות ספוגית כותנה סטרילית. החל פתרון יוד מבוסס על אזור הקרקפת מגולח. להסיר את זה עם 70% אתנול. כסו את בעל החיים עם כיסוי כירורגי מדורג כך שראש הראש גלוי אך העיניים מכוסות.
    5. הפוך את החתך בקו האמצע (1.5-2 ס מ) על הקרקפת באמצעות אזמל או מספריים.  השתמשו במדכי כותנה סטרילית כדי לנקות את הפצע כדי לנקות את הfascia השמאלי של קו האמצע בברגמה.
    6. השתמש בגשוש כדי לזהות. את אתר כריתת הגולגולת
      1. הגדר את נקודת ההתייחסות סטריאוטקאית (X = 0, Y = 0) לברגמה.  כוונן את הגשוש לשמאל. חלוקה לרמות 5 מ"מ בקוטר של מעגל סביב הגשוש באמצעות סמן דק טיפ בטוח בניתוח. הגדל וסובב את המדחף. מחוץ לעמדה
    7. השתמש במהירות גבוהה החוגה micromotor ערכת יד הכלי כדי ליצור חור פתוח בגולגולת באמצעות עגול-tip 0.6 מ"מ או 0.8 מ"מ בר מקדחה סיבית ב ~ 70%-80% מהירות מקסימלית. החלת לחץ האור על הגולגולת תוך כדי קידוח לאורך 5 מ"מ המתאר מיתאר כדי רזה גבול זה.
      1. אין להחיל לחץ עודף בזמן הקידוח. זה יכול לגרום לפציעה בקליפת הגוף עקב רטט, דחיסה, או חדירה מקרית. אפשר את המהירות של סיבית התרגול כדי לבצע את העבודה.
      2. אין לקדוח בכל נקודה נתונה במשך זמן רב מדי כדי למנוע חימום החיכוך עודף של הגולגולת. מחממים לעתים את כריתת הגולגולת עם תמיסת מלח סטרילית כדי להסיר פסולת ולהפחית את החימום מהכלי הרוטרי.
      3. לשלם תשומת לב בזמן הקידוח על קו תפר ילתית כמו נקודות אלה פגיעים דימום.
    8. השתמשו בזוג מלקחיים עדינים כדי להסיר את כנף הגולגולת כאשר החלוקה לרמות של כריתת הגולגולת מאוד מספקת. אחוז במדף המדיה והרם בעדינות ומשוך למטה בתנועה מוקדית.
      1. אין לפגוע בקרום השכבה בזמן הרמת הכנף; הדבר עלול לגרום לפציעה חמורה ולדימום.
  3. לבצע פציעה קלה השפעה מבוקרת קליפת הגוף
    1. . עם פד לאלכוהול סטרילי להעביר את המקדח המדחף בחזרה לעמדה מעל קליפת חשוף. הורידו את המקדח עד. שיגע במשטח הדורא סמן מיקום זה כ-Z = 0.
    2. למשוך את הבוכנה ולעבור Z =-1.0 מ"מ. פרוק את הבוכנה. כדי להשפיע על קליפת המוח
    3. במהירות הרם את הבוכנה והזז את הזרוע אל מחוץ למיקום. החלת כמויות נדיבות של תמיסת מלח להשקיית קליפת המוח לאחר הפציעה. לשטוף את האתר ניתוח עם מלוחים לפי הצורך תפר את חתך הקרקפת באמצעות stiches פשוטה הפריעו עם תפר משי 5.0.
  4. בצע טיפול פוסט-פעיל בעכבר
    1. . להפסיק את ההרדמה לספק CsA על ידי הזרקה תת-עורית לתוך מינון 10 מ"ג/ק"ג. הציבו את העכבר בכלוב נקי ומחומם לפני הניתוח.
    2. לספק כאבים פרצטמול במים השתייה ב 1.0 mg/mL.
      הערה: לספק משככי כאבים לפי נוהל ההפעלה הרגיל של IACUC ובהתחשב במשתני התוצאה הניסיונית (לדוגמה, הרגעה, דלקות נוירוסטיות).
    3. לספק מזון הרטיב בכלוב התאוששות מחומם לסייע לחות והתאוששות.
  5. המשך מסעיף 2 לסעיף 4 לעיל בעת ביצוע שליטה באמצעות כריתת גולגולת בלבד (השאם).

2. השתלת סטריאוטקאית של השעיית תאים

  1. התחל השתלת תאים בערך 24 שעות אחרי כריתת גולגולת.
  2. הכן את ציוד השתלת התא וציוד כירורגי
    1. מילוי מזרק של 1 מ ל ממזרק עם תמיסת מלח סטרילית להשקיה בפצעים. חברו מחט של 25 גרם למזרק כדי לשלוט בהשקיה.
    2. מילוי מזרק אחד מ-mL עם פתרון CsA לדיכוי חיסוני. לצרף המחט 25 גרם או גדול יותר למזרק CsA. מלא את מזרק CsA בהתאם לצורך בין ניתוחים.
    3. הכינו מחטי זכוכית מ-1.0 מ"מ ובורוסיליקט מזכוכית מסוג נימי באמצעות שיטות סטנדרטיות.
    4. השתמש בפינצטה עדין כדי לשבור את הטיפים מחט כ 200 יקרומטר קוטר. ודא כי פיר גלילי המחט הוא לא יותר מ 2.5 ס מ.
  3. כיול משאבת המזרק לשימוש עם מזרק 10 μL.  הזן קצב זרימה של 0.2 μL/min כדי לספק נפח כולל של 2.0 μL.
  4. הכנת תא גזע המושרה על ידי בני אדם (iPSC) השעיה.
    1. בצע את כל הטיפול בתאים בתוך מכסה התרבות התאית BSL-2 באמצעות טכניקות סטנדרטיות לטיפול סטרילי.
    2. הכן את תרביות התאים מראש בהתאם לתנאים הסטנדרטיים המוגדרים עבור סוג התא. התייחס לליצ'קה ואח '17 כדוגמה.
      הערה: ניסויים המוצגים בהפגנה זו השתמשו בתאים עצביים שונים שמקורם hiPSCs.
    3. נתק בעדינות את התאים להשעיה של תא יחיד באמצעות פתרון ניתוק תאים, או אמצעים מועדפים או כימיים אחרים.
    4. הרוזן תאים בהשעיה, ולאחר מכן לדלל את ההשעיה 5 x 104 תאים/μl ב מינימלי תרבות התא בינונית (g., Dמאמ) במבחנה 1.7 mL להעיף מבחן העליון.
    5. שים לב לפתקים הבאים עבור השתלת:
      1. שמרו על התאים בהשעיה ב-37 ° c למשך ההליכים.
      2. טען את המזרק רק מייד לפני ביצוע הזרקה מראש (שלב 4.5 למטה).
        הערה: כוח הכבידה יכול לגרום להשעיה של התא להתיישב או להיאחז בצד של המזרק אם שכב על צידו. זה מוביל לאי סדרים. במספר התאים שהוזרקו
      3. להקצות ~ 5 x 105 תאים (10 μl השעיה) לכל עכבר אם ביצוע השתלת תאים מרובים ביום אחד.
  5. בצע ניתוח השתלת סטריאוטקאית
    1. למקם את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה מחובר לתוך מאדה isofane עם מקור חמצן דחוס. לגרום הרדמה עם ~ 3% isofהלביאן ב ~ 0.7 L/min חמצן.
    2. מניחים את העכבר בתוך מסגרת סטריאוטקאית עם מצורף החרוט האף הרדמה.
      1. תקן את הראש במקום עם פסי האוזן וחטיף ומכוון את הראש כך העצם הקדמית הגולגולת הוא אופקי. שמור על הרדמה ב-~ 1.5%-2%. במשך הניתוח
    3. בצע טיפול טרום הניתוח והכנה אספטי
      1. החל משחה אופטלמולוגית לחות המכילה אנטיביוטיקה לעיניים באמצעות ספוגית כותנה.
      2. ששטוף את אתר החתך עם תמיסת מלח סטרילית כדי לנקות את האתר ולשחרר תפרים. בעדינות להחיל 70% אתנול עם משטח כותנה כדי לעקר את אתר החתך.
    4. להסיר תפרים באמצעות פינצטה משובח ומספריים אופטלמולוגי. ניתוח ההשקפה וכריתת גולגולת. עם תמיסת מלח סטרילית שופעת
      1. קחו בחשבון את בעל החיים להדרה אם קליפת המוח מציגה מאפיינים שאינם מתאימים כולל פריצת מוגזם, שינויי צבע, שיבושים בvascularization, או דימום.
    5. טען את מזרק השתלת התא
      1. העבר השעיית תאים מהאינקובטור 37 ° c ועד למכסה בטיחות של תרבות התא. מערבולת בעדינות או להקיש על הצינור כדי להבטיח השעיית תא הומוגנית.
      2. השתמש מיקרו פיפטורים כדי לטעון ~ 7.5 μL תא הבולם לתוך מזרק המילטון דרך הבוכנה.
        1. החזק את המזרק בזווית של ~ 120 ° עם קצה הבוכנה הפונה כלפי מטה. הכנס את הבוכנה, מטפל לא להציג בועת אוויר בין ההשעיה ואת קצה הבוכנה.
      3. חברו את מכלול האטם למחט הפיפטה, ואז חברו את המחט למזרק.
      4. לדחוף את הבוכנה כדי להזיז ההשעיה התא לתוך מחט הפיפטה.  אם יש התנגדות נגד תזרים השעיה, השתמש מלקחיים עדינים לשבור את קצה המחט כדי להגדיל את הקוטר.
    6. חברו את המזרק למשאבת. המזרק הסטריאוטקאית  הקדם את הבוכנה כדי לוודא שהרכבת משאבת המזרק פועלת כהלכה.
    7. . הזיזו את המחט לנקודות הציון לזריקה
      1. יישר את קצה המחט לברגמה. הגדר את הקואורדינטות X ו-Y כ-0. ואז להעביר את קצה המחט מעל כריתת הגולגולת כדי 2.0 מ"מ לרוחב ו-1.0 מ"מ האחורי לברגמה.  גע בקצה המחט למשטח הדורא וקבע את הקואורדינטות הסטריאוטקאיות ל-Z = 0.
      2. לדחוף את הבוכנה כדי להבטיח את ההשעיה התא זורם כראוי לפני הצגת המחט לתוך המוח.
      3. להציג את המחט לתוך המוח עומק של Z =-1.4 mm. הקואורדינטות הסטריאוטקאיות הללו מניחים את השתל בחומר האפור-החומר הלבן של קליפת המוח העמוקה20.
    8. הפעל את משאבת המזרק כדי להחדיר השעיית תאים. הגדר את שעון העצר של ספסל המעבדה ל-15 דקות והתחל את שעון העצר. השתמש במיקרוסקופ מרחק עבודה ארוך כדי לפקח על תזרים ההשעיה של התא.
      1. במהלך ההזרקה כדי. לשמור על מחות רקמות
      2. במהלך 15 דקות, לאט למשוך את מחט ההשתלה.  . ותסגור את החתך בתפרים
    9. בצע טיפול פוסט-פעיל
      1. . להפסיק את ההרדמה לספק CsA על ידי הזרקה תת-עורית לתוך מינון 10 מ"ג/ק"ג. הציבו את העכבר בכלוב נקי ומחומם לפני הניתוח.
      2. לספק כאבים פרצטמול במים השתייה ב 1.0 mg/mL.
        הערה: ספק משככי כאבים לפי פרוטוקול ההפעלה הסטנדרטי של IACUC (SOP) ובהתחשב במשתני התוצאה הניסיונית.
      3. לספק כלוב התאוששות מזון האוכל לסייע מחדש והתאוששות.
  6. המשך יומי זריקות CsA ב 10 מ"ג/ק"ג לאורך משך ההישרדות של העכבר.

3. הסרת סרט דביק מבחן של אינטגרציה sensorimotor

  1. חותכים את הקלטת החשמלית לתוך 3 מ"מ x 5 מ"מ רצועות באמצעות סכין גילוח קטן לפני ביצוע בדיקת ההתנהגות. השתמש משטח זכוכית חלקה לחיתוך רצועות דבק.
    הערה: השתמש בסרט בצבע צהוב ואדום, כאשר העכברים מתקשים להבחין בין צבעים אלה21.
    1. בחר מראה קטנה המתאימה היטב בתוך תיבת פלסטיק ברורה.
      1. תקן את המראה במקום בזווית בערך 45 ° עם חימר מידול או דבק כדי לראות התנהגות בעלי חיים מלמטה.
    2. מניחים את התיבה ואת המראה הרכבה על ספסל בחדר בדיקה שקטה ייעודי התנהגות.  סדר את הצילינדר על קופסת הפלסטיק מעל המראה.
    3. סדר את הבד הטיפול, מלקחיים, ורצועות דבק על הספסל ליד תיבת בדיקת התנהגות.
    4. נקה את תיבת וצילינדר עם 70% אתנול ומגבות נייר.  אפשר למשטחים להתייבש ביסודיות.
    5. הכניסו את העכברים לחדר הבדיקות התנהגותי. אפשר לעכברים לעבור לחדר הבדיקות לפחות 30 דקות לפני בדיקות התנהגות.
    6. מסירים את אספקת המים מהכלובים כדי למזער את אירועי הטלת השתן במהלך הבדיקה, דבר העלול לשבש את ביצועי הבדיקה היעילים.
  2. לבצע את הבדיקה להסרת דבק
    הערה: בדיקת התנהגות זו מבוצעת באופן הטוב ביותר על ידי שניים עד שלושה חוקרים: אחד כדי להפעיל את העצירות, ואחד או שניים להתמודד עם העכברים ולהתבונן בהתנהגות.
    1. השתמש בכל הטוויצר לקלף פס דבק אחד של כל צבע.
      1. לבחור איזה צבע רצועה מתאים לו מקדמי ולהישאר עקבי לאורך כל המשפט.
    2. השתמש בד הטיפול כדי לרסן את העכבר על ידי העורף של הצוואר ובחזרה כך העכבר מחזיק את הכפות הקדמי הרחק מהגוף והראש.
    3. השתמש מלקחיים למקום רצועה דבק על משטח plantar של כל כף רגל. השתמש בלחץ אצבע עדין ועקבי כדי לאבטח את הרצועות אל הכפות.
    4. למקם במהירות את העכבר לתוך גליל פלסטיק. התחל את שתי עצירות שעונים כאשר העכבר יש את כל ארבע כפות הידיים על תיבת פלסטיק.
    5. השתמש בעצירות שתי שעונים כדי להקליט את השהיות עבור ארבעת האירועים הבאים: כפה שמאל, הסרת כפה שמאל, יד ימין הודעה, כפה ימין ההסרה.
      1. להקליט אירוע הודעה כאשר החיה עושה הכרה חד משמעית של רצועת דבק על ידי טלטול או להירתע את הכף או לנשוך את הרצועה.
      2. הקלטת אירוע הסרה כאשר בעל החיים מסיר ביעילות את הרצועה ממשטח plantar מקדמי כף היד.
        הערה: אירוע ההסרה אינו נפסל על-ידי הוצאת הרצועה או אם הרצועה נאחזת במשטח הרוחב של כף הרגל.
      3. עצור את שעון העצר ב 120 s אם הרצועה המתאימה לא הוסרה.
      4. רשום את המועדים שחלפו עבור ארבעת האירועים בגליון הנתונים.
    6. בצע ניסיון שני על כל אחד מהעכברים
      1. אפשר למינימום של 5 דקות לחלוף בין מבחנים עבור עכבר בודד כדי להפחית את הלחץ, אשר יכול להפריע ביצועים יעילים במבחן.
      2. נקה את המנגנון עם מגבות נייר בין עכברים בדיקה כדי להסיר פסולת בעת בדיקת עכברים מרובים מכלוב אחד.
        1. נקה את המנגנון ביסודיות עם 70% אתנול ומגבות נייר בעת בדיקת עכברים ממספר כלובים.
      3. הפוך את סדר המיקום של הצבע כפה עבור המשפט השני של ההפעלה לאקראי כל אפקט של צבע.
    7. חשב את ההשהיה הממוצעת של כל אירוע בין שני מבחנים להפעלה יומית לכל חיה.
  3. נקו את המנגנון והטיפול בבדים היטב במים, החליפו את אספקת המים בכלוב והחזר את העכברים למתקן ההחזקה שלהם.
  4. חזור על שלבים 3.1-3.2 על-פני זמן ניסיוני מספר פעולות חוזרות ונשנות.
    הערה: חזור על שלבים 3.2.1-3.2.5.3 מדי יום למשך 5 ימים לפני איסוף נתונים כלשהו כדי למזג את החיות למשימה. מומלץ לרכוש בסיס נתונים לפני הניתוח.

4. הניתוח האימונוהיבאנפיטין (הדזול) של השתלת השתל והפגיעה בפתולוגיה

  1. המתת חסד בעלי החיים וביצוע הפרזיה.
    1. הכנת פתרונות של מתמיסת מלח באגירה 0.1 מ ז (PBS) ו-4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) ב PBS. מאזן את ה-pH של שני הפתרונות ל-7.4.
    2. הציבו את שני הפתרונות על הקרח בתוך מכסה המנוע. מניחים משאבה פריסטטית במנוע, ולהפעיל את המשאבה כדי למלא את האבובים עם PBS. קבע את קצב זרימת המשאבה ל ~ 7 מ ל/דקה.  חבר מחט של 25 גרם לצינור הזרימה של המשאבה.
    3. מניחים מגש ניקוז עם מצע רך במכסה המנוע. העלה קצה אחד של המגש בזווית קטנה כך שנוזלי ההיתוך מרוקנים את הצינור לקצה התחתון.
    4. מניחים עכבר בתא אינדוקציה הרדמה. למלא את החדר עם 4% isof, משתמש דחוס 100% גז הרכב חמצן.
    5. תזיז את העכבר המורד מהתא. לקונוס האף של ההרדמה . הפחת את האיזושל 2%
    6. בצעו כריתת אונה. כדי לחשוף את הלב להפסיק את ההרדמה, כאשר. כריתת האונה גורמת למתת חסד
    7. בזהירות מניחים את המחט של משאבת ההיתוך בחדר השמאלי לאורך הציר הארוך של הלב. אל נקב את מחיצת הלב, משום שזה יגרום לפרזיה דלה.
    8. השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך את האטריום הימני, ולאחר מכן הפעל מיד את המשאבה הפריסטלטית.
    9. המשיכו את זרימת ה-PBS עד שהנוזל העוזב את האטריום הימני יהיה נקי מדם.
      1. . תכבה את המשאבה הזיזו את צינור צריכת המשאבה למכולה של למעלה. . הפעל מחדש את המשאבה המשך לקיים את הירי עד שבעל החיים יהיה נוקשה מספיק או עד שנשאב נפח של 20 מ ל.
      2. . תכבה את המשאבה הסר את המחט יוצאת הלב. הזיזו את צינור הקליטה מה "לערוץ ה-PBS, ושוטפים את התחתית באופן יסודי מהאבובים.
  2. להסיר את המוח מהגולגולת על ידי ניתוח זהיר. מניחים את המוח במיכל קטן ממולא ב-4% פאראפורמלדהיד, ומאפשרים למוח לאחר התיקון ב -4 ° c.
  3. ביום לאחר קיבוע הפוסט, להחליף את P עם PBS ו 0.1% נתרן azide. אחסן את המוחות בפתרון זה עד להכנה להכניית היסטולוגית.
  4. לאסוף 40-50 יקרומטר סעיפים של רקמת המוח קבוע פורמלדהיד באמצעות מיקרוטומה הקפאה או טמפרטורת החדר הרטט atome.
  5. לטפל רקמות מראש ב 0.3% חמצן מימן במים כדי להשבית peroxidases אנדודוגני, אשר יכול לייצר כתמים לא ספציפיים.
  6. לבצע אחזור אנטיגן באמצעות מאגר חומצת לימון (10 מ"מ נתרן ציטראט, 0.05% polysorbate-20, pH 6.0) ב 60 ° c עבור 30 דקות.
  7. לבצע תיוג נוגדנים על ידי שיטות סטנדרטיות.  פנה אל Lundell ואח '. של דוח22 מהמעבדה לפרטים נוספים.
    1. השתמש בערכת נטרול העכבר (ראה טבלת חומרים) כדי להפחית את הפעילות הצולבת עם נוגדנים אנדוגני. מארג הרקמות ב-IgG ניטרול מאגר לפחות 1 h בטמפרטורת החדר (RT), בעקבות כיווני היצרן.
    2. השתמש העכבר אנטי האדם נוגדן העיקרי אנטיגן (חנה; 1:500 דילול) כאשר שתילת תאים האדם iPSC-נגזר לאתר את התאים המושתלים. הרקמות הממגרות עם הנוגדן העיקרי ב 4 ° c עבור 48-72 h באמצעות עצבנות עדינה.
    3. לאחר שטיפה את פתרון הנוגדן העיקרי, רקמות הדגירה עם HRP-מצועם אנטי עכבר נוגדן משני ב 1:250 דילול עבור 2 h ב RT.
    4. לבצע תגובת כרומוגן על ידי שיטות סטנדרטיות כדי לחשוף את האימונוולאבילינג. אפשר תגובת הטיפה להתפתח 5 כדי 10 דקות ב RT.
  8. צרף רקמות ויטראז ' לשקופיות והחל כיסוי באמצעות שיטות סטנדרטיות.
  9. ככמת מספרים של תאים המסומנים באמצעות סטריאולוגיה משוחדת כפי שמתואר בעבר23,24. בצע ניתוח באמצעות מקטעים אופטיים של 20 יקרומטר ומרווח בין מקטע של שלושה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח קרטומיה מקלה על פגיעה במוח הנסיוני והשתלת התא התרפויטי: מודל ההשפעה הקורטיקלית הנשלטת של פגיעה במוח וטיפול השתלת התא הבאים דורשים הסרה זהירה של הגולגולת המועלת. ניתן לבצע את כריתת הגולגולת על פני כל משטח של הגולגולת כדי לאפשר מניפולציות לאזור המוח של העניין. התרשים באיור 1 מתאר שרטוט של כריתת גולגולת בקוטר 5 מ"מ, כדי לחשוף את המגע הראשוני והמנועים המוטוריים (איור 1א). במשך 24 שעות לאחר כריתת גולגולת, הניתוח השני בוצע כדי ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מתון CCI כמערכת מודל לבדיקת טיפול התחדשות ניסיוני
מודל CCI הוא כלי רב ערך לחקירת מנגנונים של חוסר תפקוד רקמות לאחר פגיעה מכנית בקליפת המוח. היכולת של פרמטרי הפציעה היא תכונה אטרקטיבית של דגם זה. לשנות את עומק Z של ההשפעה, את המהירות, או להתעכב זמן יכול להגדיל או להקטין את חומרת הפציעה כפי שנדרש על ידי החוקר10,25. מודל CCI מתון של פגיעה מוחית contusive, כאשר ביצע נכון, צריך לגרום צנוע מוות בקליפת המוח ומינימלי. כריתת גולגולת והסרת מתלה לגולגלות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהמרכז לרפואת מוח ומשובי (CNRM, גרנט מספר G170244014). אנו מעריכים את הסיוע של מאהלו Dewan ו קלרה Selbrede בלימודי פיילוט הסרת דבק. . וניתוחי השתלת תאים אמנדה פו ולורה טאקר של המעבדה הקדם-רפואית של CNRM מחקר הליבה סיפק ייעוץ יקר על ניתוחי בעלי חיים ובדיקות התנהגות, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרקים 1 מ"לבקטון דיקינסון (BD) 
מבחנות 1.7 מ"ל היפוך עליוןדנווילC2170
מזרק 10 מיקרוליטרהמילטון7635-01
25G מחטי מזרק Precision Glideבקטון דיקינסון (BD) 
70% אתנולמוצר לבחירה; משתנה לפי אזור
פרצטמול תרחיף אוראליטיילנול (לילדים)יש לדלל ל-1 מ"ג/מ"ל במים
וופורייזר הרדמהVetland521-11-22
בדבבעלי חיים רכישה מחנות הכלבו
BetadinePurdue ProductsNDC-67618-151-32
חמצןמוצר לבחירה; משתנה לפי אזור
ציקלוספורין Aסיגמא-אולדריץ'30024-100 מ"ג
DABמעבדות וקטורSK-4100
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D8418-500 מ"ל
DMEMInvitrogen (ThermoFisher)A14430-01
נוגדן IgG נגד עכבר חמור, HRP מצומדJackson ImmunoResearch715-035-151
סרט חשמלי3M Corporationרכישה מחנות כלבו
פינצטה משובחתFine Science Tools11254-20
מלקחייםFine Science Tools91106-12
פיפטות נימיות מזכוכית, 1 מ"מ OD, 0.58 מ"מ קוטר פנימיWorld Precision Instruments1B100F-3
ערכת מיקרו-מנוע סיבובי במהירות גבוההForedom Electric Co. K.1070 - K.107018
סט מיקרו מקדחה אידיאלי של 5נקודות תא מדעי 60-1000
אימפקטור סטריאוטקסי אחד עבור CCI Leica Biosystems39463920
איזופלורןבקסטרNDC-10019-360-60
טיימרים לספסל מעבדהFisher Scientific14-649-17
חולץ מיקרופיפטותMicroData Instruments, Inc.PMP-102כל חולץ יספיק
להחלקות כיסוי מיקרוסקופפישרברנד12-545-E
הרכבה שקופיות מיקרוסקופמוצר לבחירה
מראהרכישה מחנות כלבו
עכבר אנטיגן אנטיגן גרעיני אנטי אנושיMilliporeMAB1281
ערכת חסימת עכבר על עכברוקטור מעבדותBMK-2202
מחזיק מחט hemostatFine Science Tools12002-12
משחת עינייםFalcon PharmaceuticalsNDC-61314-631-36
מספריים קפיציים עינייםFine Science Tools15018-10
קופסתלרכישה מחנות כלבו
גלילרכישה מחנות כלבו
משאבת מזרק ממונעת QSIStoelting53311
התאמת דחיסת מחט נשלפתהמילטון55750-01
מסגרת סטריאוטקסית קטנה למכרסמיםStoelting51925
מספריים קטניםFine Science Tools14060-09
StemPro AccutaseInvitrogen (ThermoFisher)
רפידות הכנה לאלכוהול סטריליותפישרברנד06-669-62
ספוגיות צמר גפן סטריליות/קנדל Q-tipsTyco Healthcare540500
מי מלח סטרילייםHospiraNDC-0409-1966-07
שעוני עצר (2)פישר סיינטיפיק06-662-56
שקופיות מיקרוסקופ זהב סופרפרוסט פלוספישרברנד15-188-48
תפרים - 5.0 משי עם מחט מעוקלתאואזיסMV-682
309659305122 במים לטיפול דחוס ערכת צביעה מדיום פלסטיק פלסטיקA1110501

מקורות

  1. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
  2. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
  3. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
  4. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
  5. Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
  6. Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781(2014).
  7. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  8. Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280(2014).
  9. Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury - a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
  10. Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142(2013).
  11. Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
  12. Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
  13. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
  14. Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
  15. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  17. Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
  18. Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
  19. Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303(2013).
  20. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , Elsevier Academic Press. (2004).
  21. Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
  22. Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
  23. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
  24. Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
  25. Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
  26. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
  27. Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
  28. Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232(2014).
  29. Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, Suppl 4 34-49 (2014).
  30. Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
  31. Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
  32. Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
  33. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7, 825-826 (2010).
  34. Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
  35. Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
  36. Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
  37. Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.