מאמר שיטה

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

DOI:

10.3791/59580

⸱

23 באוגוסט 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nutritional Sciences, Cornell University, 2Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים טכניקות עבור בידוד, culturing, אפיון, וההבחנה תאים האדם העיקרי שריר השריר (hMPCs) המתקבל רקמת שריר השלד ביופסיה. hmpcs התקבל ומאופיין באמצעות שיטות אלה ניתן להשתמש לאחר מכן לכתובת מחקר שאלות הקשורות מיוגנזה האדם התחדשות השלד שריר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש ברקמות ובתאים האנושיים העיקריים הוא אידיאלי לחקירת תהליכים ביולוגיים ופיזיולוגיים כגון תהליך ההתחדשות של שריר השלד. ישנם אתגרים מזוהים לעבוד עם בתאי גזע האדם העיקרי בוגרים, במיוחד בתאי שריר האדם בתאים (hMPCs) נגזר ביופסיות שריר השלד, כולל התשואה התא נמוך מרקמות שנאספו ומידה גדולה של התורם טרוגניות של מערכי צמיחה ומוות בקרב תרבויות. בעוד שילוב טרוגניות לתוך העיצוב הניסיוני דורש גודל מדגם גדול יותר כדי לזהות אפקטים משמעותיים, זה גם מאפשר לנו לזהות מנגנונים כי השונות ושתתות קיבולת הרחבת hmpc, ובכך מאפשר לנו להבין טוב יותר טרוגניות שרירים התחדשות השלד. מנגנונים חדשניים המבדילים את יכולת ההתרחבות של תרבויות יש את הפוטנציאל להוביל לפיתוח של טיפולים כדי לשפר את התחדשות שריר השלד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שריר השלד הוא מערכת האיברים הגדולה ביותר בגוף האדם, חשבונאות עבור 30-40% של מסת הגוף כולו1. בנוסף התפקיד שלה מזוהה היטב תנועה, שריר השלד שומרת על טמפרטורת הגוף ויציבה, וממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס מזינים הגוף כולו. מחקרים הקשורים למשתתפים אנושיים, בעלי חיים ומודלים של תרבות התא הם כולם יקרי ערך לטפל בשאלות הנוגעות לביולוגיה שריר השלד והתחדשות. בידוד ותרבות של תאים אנושיים שרירים ראשוניים (hMPCs) מספק מודל חזק המאפשר לטכניקות תרבות התא ומניפולציות להיות מיושם על דגימות אנושיות. היתרון של שימוש hmpcs הוא שהם שומרים את מושגים גנטיים ומטבולית מכל תורם2,3. תחזוקת פנוטיפ התורם מאפשרת לחוקרים לבחון וריאציה בין-אישית בתהליך היוגניים. לדוגמה, העסקנו את שיטת האפיון hMPC שלנו כדי לזהות הבדלים בין הגילאים והמין בקיבולת הרחבת אוכלוסיית hMPC4.

מטרת פרוטוקול זה היא לפרט טכניקות כדי לבודד, תרבות, לאפיין, ולהבדיל hMPCs מרקמת ביופסיה שריר השלד. בניין על עבודה קודמת שתיאר hmpcs וזיהה מקבלי הפנים הפוטנציאליים תאים עבור בידוד hmpcs5,6, פרוטוקול זה ממלא פער קריטי בידע על ידי קישור בידוד לאפיון של hmpcs. עוד, הוראות צעד אחר צעד המפורטים בפרוטוקול זה להפוך את הבידוד hMPC ואפיון נגיש לקהל מדעי רחב, כולל אלה עם ניסיון קודם מוגבל עם Hmpc. הפרוטוקול שלנו הוא בין הראשונים לתאר שימוש בציטוטומטר הדמיה כדי לעקוב אחר אוכלוסיות תאים. ציטוטומטרים מעוצבים לאחרונה הם מדינה-של-האמנות, תפוקה גבוהה ומיקרופלייט, המאפשרת הדמיה של תא חי, ספירת תאים וניתוח של קרינה פלואורסצנטית רב-ערוצית של כל התאים בכל באר של כלי תרבות בתוך דקות. מערכת זו מאפשרת כימות מהירה של שינויים דינמיים בהתפשטות ובכדאיות של אוכלוסיית תאים שלמה עם הפרעה מינימלית בלבד לתרבות. לדוגמה, אנו מסוגלים לבצע פעולות אובייקטיביות של המפגש בימים רצופים בחוץ כדי לקבוע את קינטיקה הגדילה של כל תרבות הנגזרת מתורמים שונים. פרוטוקולים רבים בספרות, במיוחד אלה הקשורים הבידול של MPCs, דורשים תאים כדי להגיע לרמה מוגדרת של המפגש לפני התחלת בידול או טיפול7. השיטה שלנו מאפשרת קביעה אובייקטיבית של הזרימה של כל באר בכלי תרבות המאפשר לחוקרים ליזום טיפול באופן לא משוחד ולא סובייקטיבי.

בעבר, מגבלה עיקרית של שימוש hMPCs הראשי היה תשואה נמוכה המגבילות את מספר התאים הזמינים עבור ניסויים. אנחנו ואחרים הראו את התשואה של MPCs מן רקמת ביופסיה שריר השלד הוא 1-15 MPCs לכל מיליגרם של רקמה (איור 1)8. בגלל הפרוטוקול שלנו מאפשר ארבעה קטעים של התאים לפני טיהור עם מיון התא המופעל על ידי הזריחה (FACS), שלנו היבול hMPC שלנו, נגזר כמויות קטנות של רקמת ביופסיה (50-100 מ ג), הם מספיק כדי לטפל במטרות מחקר שבו יש צורך בניסויים מרובים. פרוטוקול ה-FACS שלנו מפיק אוכלוסיית MPC טהורה של ~ 80% (Pax7 חיוביים), ולכן הפרוטוקול שלנו ממוטב לתשואה ולטוהר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה אושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית באוניברסיטת קורנל. כל המשתתפים הוקרן לתנאי הבריאות הבסיסיים והעניקו הסכמה מושכלת.

1. קבלת רקמת שריר האדם דרך ביופסיה שריר השלד

  1. לזהות את השריר הווסטוס באמצעות מישוש, ציוני דרך אנטומיים, וכיווץ פעיל של השריר.
  2. באמצעות המשתתף להדק את שריר הירך הראשי שלהם ולמצוא את הבטן של השריר, על 1/3 של הדרך מן הפאטלה אל הירך, ופשוט לרוחב לעצם הירך.
  3. השתמש בסרט מדידה נייר כדי לסמן אזור עם סמן כירורגי כ-4-6 סנטימטרים מראש הפאטלה המייצג את בטן השריר.
  4. לגלח כל שיער ליד האזור המסומן ולאחר מכן לטהר עם חיטוי כיתה כירורגית המשמש לפני הליכים רפואיים (למשל: 2% כלורהקאינין אדל (chg)/70% אלכוהול איזופרופיל (IPA)).
  5. לעבור על אתר הביופסיה. עם 1% לידוקאין
    הערה: הימנע מהזרקת הלידוקאין לשריר השלד.
  6. הפוך מסלול חתך של 4-5 מ"מ באתר המסומן.
  7. לאחר האזור מורדם, לדחוף מחט ברגסטרום עם נקז דרך fascia לתוך הבטן של השריר (כ 2-3 ס מ).
  8. לצייר רקמת שריר לתוך המחט ברגסטרום על ידי נסיגה מכונית חיתוך 2-3 ס מ בזמן עוזר מתחיל יניקה על ידי נסיגה 60 מצורף מזרק מוצמד mL.
  9. . תסגור את תא החיתוך
  10. לסובב את הבסיס של מחט ביופסיה רבע להפוך ולחזור על רצף של פתיחת המחט, החלת יניקה, וסגירת המחט.
    הערה: בכל פעם המחט סגורה, נתח של רקמת השריר צריך להיות מושגת בתוך המחט Bergstrom. במהלך איסוף לדוגמה, המחט יישאר בירך באותו מיקום אנכי בזמן שהוא סובב longitudinally דרך 360 ° כדי להשיג כל מדגם. רצף זה יכול לחזור 3-4 פעמים.
  11. לגרש את רקמת הביופסיה שנאסף מן המחט לתוך משטח ההלבשה ללא מחסיד סטרילי.
  12. בדקו את הרקמה והסירו את כל רקמות השומן הגלויות והפיברוטיות בעזרת להבי אזמל או מלקחיים סטריליים.
  13. מניחים חלק (50-100 מ ג) של רקמות לתוך צינור סטרילי המכיל שיתוף בינונית2-עצמאיים מדיום (למשל, שינה a).
    הערה: משקל הרקמה נקבע כדלקמן. מקום ראשון הצינור הכתיר המכיל את המדיום התזונתי בקנה מידה וטרה. הבא את הרקמה לתוך הצינור, לסכם את הצינור, ולאחר מכן שוקלים את הצינור המכיל את הרקמה במדיום התזונתי.
  14. אחסן את השפופרת המכילה את הרקמה ואת המדיום התזונתי ב-4 ° צ' עד לעיבוד.
    הערה: רקמת ביופסיה צריך להיות מעובד בתוך 48 h של אוסף.

2. בידוד שריר האדם בתאי מחולל מרקמת ביופסיה

  1. האוהב רקמת ביופסיה.
    1. להעביר את רקמת השריר מן המדיום התזונתי לתוך צלחת פטרי סטרילי בארון בטיחות ביולוגי או במקום עבודה סטרילי דומה.
    2. השתמש להבי אזמל סטרילי לרקמת הבשר לתוך ~ 1 מ"מ3 חתיכות.
  2. רוחצים את רקמת הביופסיה הקצוצה כדי להסיר פסולת שיורית.
    1. להעביר את רקמת השריר לתוך 15 מ"ל שפופרת חרוטי המכיל 10 מ ל של מלוחים מאגור פוספט (PBS) ולאפשר לרקמות להתיישב באמצעות כוח הכבידה.
    2. . לא להפריע לרקמת השריר
    3. הוסף 10 מ ל של PBS אל הרקמה שטף ולאפשר את רקמת השריר ליישב מחדש דרך כוח הכבידה.
    4. . לא להפריע לרקמת השריר
    5. הוסף 10 מ ל של גלוקוז נמוך בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ולאפשר לרקמות להתיישב מחדש דרך כוח הכבידה.
    6. . לא להפריע לרקמת השריר
  3. מודטת את הרקמה. בתקשורת לעיכול
    1. להשעות מחדש את רקמת השריר 3 מ ל של מדיה תקציר (2 מ"ג/mL כולגיראז D ב גלוקוז נמוכה Dמאמ).
      הערה: שימוש בפתרונות מלאי באמצעות מוצרים בעלי מניות של 20 מ"ג/mL בגלוקוז נמוך, ומאוחסן ב-80 ° c, אז מדולל 1:10 ב-DMEM גלוקוז נמוכה בזמן השימוש.
    2. דגירה הצינור המכיל את רקמת השריר באמבט מים ב 37 ° c עבור 30 דקות.
    3. Triturate הבולם רקמת השריר כל 10 דקות באמצעות הצינורות הסרואולוגיים 10 מ"ל או מנשא.
    4. הוסף 83 μL של מדיית תקציר נוספת ו-24 μL של הפתרון dispase (0.76 mM אצטט סידן, 1.39 mM אצטט נתרן, 13.91 mg/mL dispase II ב-DMEM גלוקוז נמוך). החזר את ההשעיה לאמבט מים ב37 ° c.
    5. Triturate מתלה רקמת השריר כל 5 כ 10 דקות עם טיפ רחב משעמם.
    6. המשך במהלך העיבור עד להשגת שאיפה אחידה, וללא יותר מ 1.5 h כדי למנוע את העיכול.
      הערה: שיפור מספיק של הרקמה ואת הפעילות האנזימטית של הקולגן ומאפשר להשפיע על העיכול לדוגמה. שאיפה אחידה צריך להיות מסוגל לעבור את הקצה הרגיל של הצנרת עם סגר מינימלי לאחר 1.5 h. אם מ2.1.2 מדים לא מושגת לאחר 1.5 h, כפול לבדוק כי הרקמה המממנת הוא מספיק, ורקמות הוא טחון בגודל המתאים (שלב). בנוסף, הפעילות של האנזימים יש לבדוק כמו הרבה וריאציה הרבה בפעילות אנזימטית מתרחשת.
  4. גלולה התאים להקפיא במדיה התאוששות.
    1. הוסף 6 מ ל של מדיית הצמיחה (GM; 79% של האם F12, 20% סרום בפרה העובר, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 5 ng/mL בסיסי מקדם הצמיחה של הגידול [bfgf], pH 7.4, עבר דרך מסנן ה0.22 יקרומטר) אל השריר שריר.
    2. פיפטה את ההשעיה באמצעות מסננת תא 70 יקרומטר לתוך צינורית חרוט 50 mL. לשטוף את מסננת עם תוספת 4 מ ל של GM.
      הערה: ניתן להעביר דגימה בחזרה לצינור מדגם של 15 מ ל בקלות ולהמחיש את הגלולה. נפח כביסה גדול יותר ניתן להשתמש אם התשואות התאים העוקבים הם נמוכים.
    3. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    4. . לא לשבש את הגלולה קפיצי את הצינורית כדי להשעות את הגלולה במדיה הנותרת. אם תאים לא הולכים להיות מתורבתים מיד להמשיך שלב 2.4.5 להוראות על אחסון לטווח ארוך, אחרת המשך צעד 3.1.6.
      הערה: אם התרבות המיידית היא הרצויה, GM בלוחות תרבות התא צריך להיות מראש מ3.1.1 (שלבים ו3.1.2) לפני עיבוד ביופסיה מתחיל.
    5. הוסף 1.5 mL של התרבות תא ההתאוששות הקפאת מדיה (טבלת חומרים) אל הגלולה המשוחזרת.
    6. . להעביר את ההקפאה לתוך בקבוקון מניחים את הקריובקבוקון בקצב מבוקר, שנשלט על ידי לילה ב-80 ° c. החנות קריובקבוקון ב-80 ° c עד מוכן לתרבות.
      הערה: קריוצלוחיות המכילות שאיפה ניתן לשמור בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך (גדול מחודש אחד). שימוש בקצב מבוקר איזופנול מאפשר לתאים להיות מוקפאים בקצב של 1 ° צ'/דקה וכתוצאה מכך שיעורי התאוששות מיטביים של תאים כפי שמעידים על הכדאיות לאחר הקפאת הסבירות המוגברת של ההחזקה לכלי תרבות התא9. לחילופין, גביע המכיל RT איזופנול, הממוקם במקפיא של 80 ° c עשוי לשמש.

3. שרירי האדם מחולל שרירים תאים

  1. . להפשיר את שריר השריר
    1. לפני הפכנף וזריעה hMPCs, לוחיות הרישוי של התאים הקדם-ביוקלוניים ב-GM. הוסף 250 μL של GM ל 4 בארות של קולגן מצופה (קולגן I), 24-היטב לוחית התרבות התא. למלא את הבארות הנותרות עם 500 μL של מדיית בסיס סטרילית (כלומר, F12) כדי למנוע אידוי במהלך התרבות לטווח ארוך.
      הערה: עבור ביופסיות בין 50 g ו 100 g, ארבע בארות של צלחת 24-באר מתאימים. אם רקמת הביופסיה היא פחות מ 50 גרם, שתי בארות עשויות להיות מתאימות יותר. שרידי פסולת ומספר תא נמוך מונעים שימוש בטכניקת ספירת תאים בשלב זה; לכן, צפיפות הזריעה המדויקת אינה נקבעת ומשתנה מעט מביופסיה לביופסיה.
    2. מכשיר התרבות של התאים הכליליים עם GM ב 37 ° c ב 5% CO2 עבור 1 h לפני זריעה.
    3. הסרת קריובקבוקונים ממקפיא-80 ° c ומקום באמבט מים בעלות של 37 ° c; הנוזל בצינור צריך להיות שקוע לחלוטין במים.
    4. כאשר הפשרה היא כמעט מלאה (~ 5 דקות), להעביר את הקריובקבוקון לתוך כיסוי סטרילי למינארי זרימה. העבר את שריר השריר מתוך שפופרת קריובקבוקון ולהוסיף 15 מ"ל צינור חרוט המכיל 6 מ ל של הקדם מחומם GM בקצב של 1 mL/min.
    5. צנטריפוגה את השריר שריר ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.
      הערה: צנטריפוגה דלי מנופף יכול להקל על הדמיה של כדורי קטן בשלב זה אבל הוא לא חיוני.
    6. . לא לשבש את הגלולה קפיצי את הצינור כדי להשעות את הגלולה במדיה הנותרים ולהשעות מחדש 1 מ ל של GM.
    7. העברת 250 μL של הגלולה מחדש (נחשב כיום השעיית hMPC) לכל אחת מ -4 בארות של לוחית טרום התרבות 24-היטב של התאים.
  2. תרבות ומעבר של hMPCs.
    1. לשמור על תרבויות hMPC ב-GM ב 37 ° c ב 5% CO2.
      הערה: מלאי של GM ללא bFGF (כלומר, F12, אנטיביוטיקה, FBS) מוכנים בקבוצות ושמרו ב 4 ° צ' עבור עד 2 שבועות. bFGF נוסף ל-GM ביום השימוש. ניתן לאחסן מדיה המכילה bFGF עבור 48 h ב-4 ° c.
    2. עשרים וארבע שעות לאחר בידוד, מותחת את GM, לשטוף בעדינות את כלי התרבות 2x עם GM מחומם מראש, ולהוסיף GM טרי.
      הערה: 24 שעות צריך לספק hMPCs זמן מספיק כדי לצרף; לא צריך hMPCs להסרה לאחר שטיפת. שלב זה יהיה גם להסיר את הפסולת הנותרים שנוצר במהלך הקציר התא, מה שהופך את כלי הקיבול יותר קלה סריקת המפגש מדויק באמצעות cytometer הדמיה (סעיף 5 להלן). לאחר שינוי המדיה הראשוני, GM משתנה כל 48 h.
    3. המעבר hMPCs כאשר 70% המפגש מושג או כאשר הם נשארו על אותה צלחת תרבות עבור 10 ימים, המתרחש הראשון.
      הערה: 70% המפגש הוא כ 55,000 תאים/cm2.
    4. כדי מעבר, להוסיף 250 μL של הקדם מחומם ביותר לכל הטוב של הלוח 24-היטב התרבות התא ו הדגירה עבור ~ 5 דקות.
    5. הקש על כלי התרבות של התאים במשטח מוצק כדי לנתק את hMPCs. ניתן להשתמש במיקרוסקופ קל כדי לוודא ש-hMPCs מנותקת.
    6. העבר את השטריפסין/hMPC ל-5 מ ל של GM בשפופרת חרוט של 15 מ ל.
    7. צנטריפוגה את ההשעיה hMPC ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    8. הסירו את השבולים של hMPC מהצנטריפוגה והניחו על הקרח במכסה הזרימה הסטרילי.
      הערה: שמירת hMPCs בקרח במהלך העברת תוצאות בצבירת תאים פחות.
    9. ומשהה מחדש בעדינות את הגלולה. ב-1 מ ג של ג'נרל מוטורס
    10. ספירת תאים באמצעות הטציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
      הערה: דילול 1:5 של השעיית תא למאגר ספירת תאים מתאים בדרך כלל.
    11. הזרע hMPCs על מאכלי התרבות מצופה קולגן המכיל טרום מחומם GM בצפיפות של 3,500 תאים לכל ס מ2. שילוב של 10 ס מ לוחות וצלחות 24-טוב הוא אידיאלי. הצלחות 24-היטב ניתן לסרוק מדי יום על cytometer הדמיה לפקח על הצמיחה.
    12. בצע את אותו ההליך (החל בשלב 3.2.4.) למעברים הבאים.
      הערה: תא בריאות וטוהר ניתן לפקח על פני מעברים באמצעות סמן של הזדקנות הסלולר (למשל, β-גלטוסידאז) וכתמים חיסוני עבור Pax7.
  3. הקפאת המלאי של hMPCs.
    1. Cryopreserve תאים עודפים לשימוש מאוחר יותר כדי להפוך את עוצמת התרבות יותר לניהול.
    2. לצורך הקפאת ההזמנה, עקבו אחר תהליך הטריציוניזציה המתואר בצעדים 3.2.4.-3.2.9.
    3. בעוד ההשעיה התא הוא להיות centrifuged, להכין תערובת של 20% (למשל, 200 μL) diמתיל סולפוקסיד (DMSO) ו 80% (g., 800 μL) GM. פיפטה למעלה ולמטה 20x כדי להבטיח ערבוב הולם. להשאיר את התערובת לנוח על הקרח.
    4. מבוסס על ספירת תאים, לדלל את השעיית hMPC 2 x 106/ML ב GM.
    5. לשלב את ההשעיה hMPC ואת 20% סטרילי DMSO/80% GM תערובת 50/50. המדיה האחרונה הקריוגנית היא שילוב של DMSO (10%) ו-GM (90%) מכיל 1 x 106 hmpcs/mL.
    6. מקום 1 מ ל של ההשעיה hMPC מוכן בשלב 3.3.5 לתוך מבחנות קריומות רבים כמו ספירת התא הראשונית מאפשר. לאחר מכן מניחים את hMPCs בקצב מבוקר במחיר איזופרופיל ב-80 ° c במקפיא ללילה.
      הערה: בשלב זה, בדרך כלל בין 5 ו 15,000,000 תאים מתקבלים, 30 על 60% מהם מזוהים כמו hMPCs על ידי FACS.

4. בידוד Pax7+ שריר האדם בתאים מחולל באמצעות הcy, הזרמת זרימה

  1. כדי להכין hMPCs מתרבויות חיים (שלב 3.2.11), טריסיזציה מספיק כלי התרבות עבור 1 x 106על 2 x 106 התאים הכולל. הכינו שתלים סלולאריים כמתואר בצעדים 3.2.4-3.2.9.
  2. הכינו את hMPCs מתרבויות הקפאת שמורות (שלב 2.4.6 או 3.3.6).
    1. בחר 1-2 צינורות המכילים ~ 1 x 106 מעבר ארבע hMPCs עבור כל תורם.
      הערה: באמצעות מעבר ארבע hMPCs מאפשר תשואה תאים מספקת תוך שמירה על פוטנציאל מתרבים עד מעבר שש (איור 2).
    2. הפשרת תאים במהירות על-ידי הסרתם מ-80 ° c מקפיא והצבת אותם באמבט המים 37 ° c עם הנוזל בצינור שקוע לחלוטין.
    3. כאשר הפשרה היא כמעט מלאה (~ 5 דקות), העברת hMPCs לתוך כיסוי סטרילי למינארי זרימה ולהעביר את התוכן של השעיית התא ל 6 מ ל של הקדם מחומם GM ב 15 מ ל צינור חרוט בקצב של 1 mL/min.
    4. הכינו שתלים סלולאריים כמתואר בצעדים 3.2.7-3.2.9.
    5. השהה מחדש את כל הגלולה ב 3 מ ל של מאגר facs (500 מ"ל PBS, 12.5 ml סרום עז רגיל, 2 מ"ל 0.5 M edta, pH 7.4, עבר דרך מסנן ב0.22 יקרומטר).
    6. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    7. משקם supernatant מ hMPCs ובעדינות להשהות את הגלולה ב 250 μL של מאגר FACS; מקום על הקרח
    8. מקום 100 μL של תאים בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.7 mL ולעזוב על הקרח כדי לשמש כפקדים חיים/מתים (שלב 4.5.1).
      הערה: 100 ul של תאים לשמש עבור שולטת חי/מת יכול לבוא לקחת נפח קטן (~ 20 ul) של תאים מושעה מחדש מכל תורם להיות ממוין או מתאים הפקדה.
      הערה: חשוב לא לקחת יותר מ 20 עד של תאים מושעה מתורם יחיד. להביא נפח עד 100 ul עם מאגר FACS אם < 100 ul של תאים זמין.
  3. הכתם hMPCs עבור סמני פני השטח של התא.
    1. הכן את קוקטייל הנוגדן הבא (כמויות המוצגות הן עבור כל תרבות, היקף כראוי): 5 μL CD56 (מולקולת הדבקה של תא עצבי [NCAM]; PE-Cy7 מצומנת) ו-5 μL CD29 (β1-אינטאין; AlexFluor488). . דילול הנוגדן האחרון הוא 1:50
    2. הוסף 10 μL של קוקטייל הנוגדן לכל השעיה hMPC ו-דגירה על הקרח 30 דקות בחושך.
    3. הוסף 10 מ ל של מאגר FACS כדי כל ההשעיה/הנוגדן תערובת קוקטייל.
    4. צנטריפוגה כל צינור ב 300 x g עבור 5 דקות ב RT.
    5. השהה מחדש את הגלולה ב-300 μL של מאגר FACS והעבר לצינור פוליסטירן מוקצף באורך 5 מ ל.
    6. שמור על ההשעיה על קרח ומוגן מפני אור.
  4. . הכן את חרוזי הפיצויים
    הערה:     יש להכין בקרות חיוביות לכל נוגדן ולשליטה שלילית (חרוזים בלתי מוכתמים) באמצעות חרוזי פיצוי. בקרת חרוז פיצוי צריך להיות מופעל על cytometer הזרימה לפני הדגימות כדי להיות מיון. פקדים אלה מאפשרים נחישות של כמה fluorochrome מכל נוגדן ניתן לזהות בערוץ של האחר, כך ניתן להחיל פיצוי.
    1. . חרוזי פיצוי מערבולת
    2. בשלוש 1.7 מ"ל מיקרוצנטריפוגה צינורות, להוסיף טיפה אחת (50 μL) של חרוזי פיצוי.
    3. הוסף 1 μL של כל נוגדן לשפופרת המתאימה, או לאף אחד לפקד השלילי.
    4. מודקון בחשכה במשך 15 דקות.
    5. הוסף 1.5 mL של מאגר FACS לכל צינור ומערבולת.
    6. צנטריפוגה כל צינור ב 300 x g ב צנטריפוגה העליון שחקן עבור 5 דקות ב RT.
    7. ולהשעות את הגלולה ב 200 μL של מאגר FACS.
      הערה: הגלולה עשויה להיות קשה מאוד לדמיין; הטיפול צריך להילקח כאשר מיי, את הסופרנטאנט.
    8. מניחים את ההשעיה בתוך 5 מ ל קלקר בתחתית הצינור ולאחר מכן לשמור על הצינור על הקרח מוגן מפני אור.
  5. . הכינו שולטת בחיים ומתים
    1. לחלק את ה100 μL של hMPCs משלב 4.2.8 לתוך שני 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות (אחד עבור שליטה חיה אחד עבור שליטה מתים).
    2. מניחים את צינור הבקרה מת בבלוק חימום מראש מחומם עד 70 ° c עבור > 10 דקות. במהלך הזמן הזה, לשמור על שליטה חיה על קרח.
    3. צנטריפוגה כל צינור ב 300 x g ב צנטריפוגה העליון שחקן עבור 5 דקות ב RT.
    4. ולהשעות את הגלולה ב 150 μL של מאגר FACS.
    5. לשלב את הבקרות חי/מת לתוך בודד 5 מ ל בתוך הצינור התחתון קלקר.
  6. לבצע כתמים הכדאיות.
    1. הוסף 1 μL של 7-aminoactinomycin D (7-עמ ') לכל הצינורות המכילים תאים להיות ממוינים ואת שליטה חי/מת.
    2. הוסף GM כדי קולגן מצופה 24-טוב (250 μL/ובכן) ו 10 ס מ (8 מ"ל/טוב) צלחות ולאפשר שיווי משקל בחממה תרבות התא ב 37 ° צ' ב 5% CO2.
  7. מיין hMPCs באמצעות זרם cy, לנסות.
    1. מיין hmpcs על הזרם cytometer עם 100 יקרומטר זרבובית בלחץ של 20 psi. קבע hMPCS חי מבוסס על פיזור צד וקדימה כמו גם 7-עמ מ שליליות (מיון פרמטרים ומיון נציג ניתן לראות באיור 3).
    2. תאים חיוביים עבור PE-Cy7 (780/60 nm) ו-AlexFluor488 (530/30 nm) מייצגים CD56+/cd29+ תאים ולכן הם Pax7 תאים חיוביים (hmpcs). מיון תאים חיוביים כפולים לצינורות אוסף המכילים כרית 300 μL של מאגר FACS.
      הערה: הטוהר של תרבויות מיון ניתן לקבוע על ידי מכתים חיסוני עבור Pax7 ואחריו זרימת הזרם cy try ניתוח (איור 4).
    3. למחוק את כל התאים האחרים.
    4. העבר את התאים הממוינים לשפופרת חרוט בעלת 15 מ"ל.
    5. ספין the hMPC ההשעיה ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    6. . ומשהה מחדש ב -1 מ ג של ג'נרל מוטורס
    7. ספירת תאים באמצעות הטציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
      הערה: בעוד שמספר התאים ניתן להסיק כמספר האירועים הממוינים באופן חיובי, מספר זה נמצא באופן מיותר ביחס למספר התאים ב-10 ש-40% לעומת שיטות ספירת התאים המסורתיות.
    8. הזרע את hMPCs כפי שמתואר בשלב 3.2.11.
      הערה: אימות של הטוהר של אוכלוסיית hMPC עשוי להיקבע על ידי הPax7 וניתוח באמצעות הזרימה cy, לנסות.

5. אפיון מחולל שריר אנושי (hMPC) תרבויות באמצעות הדמיה של מכשיר להדמיה

  1. השתמש cytometer הדמיה (טבלה של חומרים) לבצע סריקות המפגש.
    1. בחר באפשרות ' צור סריקה חדשה ' ולאחר מכן הזן/בחר את קטגוריית הלוח, פרופיל הלוח ומזהה הלוח. Cytometer ההדמיה יכול להכיל 96, 24, ו 6 צלחות היטב.
    2. תחת יישום, בחר באפשרות ' זרימה ' > מפגש 1.
    3. בחר היטב כדי להציג את השימוש בנווט שבצד המסך.
    4. מצא מטוס של מיקוד שבו התאים מופיעים לבנים לעומת הרקע ובחר לרשום ידני או לאפשר cytometer הדמיה כדי לבחור את מישור המיקוד על ידי בחירת הרשמה אוטומטית.
      הערה: עבור 96 לוחות היטב המוצעים בטבלת חומרים, מיקום משוער הוא 4.3 יחידות.
    5. השתמש בעכבר כדי להדגיש את כל הבארות שיש צורך לסרוק. כל האזור היטב ייסרק באופן אוטומטי. בחר באפשרות ' התחל סריקה'.
    6. בחר הגדרות ניתוח אופטימליות לצלחת ולסוג תא.
      הערה: עבור hMPCs, ההגדרות הבאות מיטביות: עוצמה = 6, אינטנסיביות רוויה = 0, קוטר = 8, עובי מינימלי = 3, גודל אשכול מזערי = 500, ודיוק = גבוה.
    7. בחר באפשרות ' התחל ניתוח'.
      הערה: בדוק באופן חזותי תמונות כדי להבטיח כי cytometer המשתמש וההדמיה מסכימים לגבי היקף התאים. אם קיימת אי-התאמה גדולה, סרוק מחדש את הצלחת באמצעות מישור אחר של מיקוד או הגדרות ניתוח שונות. סריקת המפגש יכולה לשמש להשוואת הצמיחה בין התרבויות, הזמן לניהול הטיפול, או לניטור התאים ולהחליט מתי ליזום בידול. במידה ובידול רצוי, הפרטים מסופקים בסעיף 6.
  2. השתמש בציטומטר ההדמיה כדי לספור תאים.
    1. הכינו פתרון מכתים המכיל 12 מ ל של בשר חזיר, 6 μL של Hoechst 33342 ו 24 μL של propidium יודיד.
    2. מתיף מדיה ולהחליף עם פתרון הצביעת, מודטה ב 37 ° צ' עבור 15 דקות.
    3. מכתים את פתרון הצביעת ומחליפים באמצעות F12 של Ham.
      הערה: חשוב להשתמש במדיה עם רמות נמוכות של פנול אדום כדי לקבל תמונות ברורות. לחילופין, ניתן להשתמש ב-PBS.
    4. לטעון את הצלחת על cytometer הדמיה ותחת יישום, בחר הכדאיות תא > Live + מתים + סך הכל. הערוץ החי יהיה תמונת שדה בהירה, הערוץ המת יהיה propidium יודיד, והערוץ הכולל יהיה הואכסט 33342.
    5. הגדר את הערוץ החי לשדה בהיר ולחץ על רישום אוטומטי תחת הגדרת המוקד.
    6. מתחת לערוץ הכולל, הגדר את הערוץ לכחול. השתמש במוקד חיפוש כדי להכניס את הגרעינים למוקד או להשתמש בחיצים למעלה ולמטה כדי להגדיר ידנית את המוקד. לחצו על ' קבע היסט ' לבחירת המוקד.
    7. , מתחת לערוץ המתים . הגדר את הערוץ לאדום השתמש במוקד חיפוש כדי להביא את התאים המתים לפוקוס או להשתמש בחיצים למעלה ולמטה כדי להגדיר ידנית את המוקד. לחצו על ' קבע היסט ' לבחירת המוקד.
    8. בחר ' התחל סריקה ' כדי להתחיל בסריקה.
    9. בחר בפרמטרי ניתוח המתאימים ללוח ולסוג התא. בחר ' התחל ניתוח ' כדי להתחיל בניתוח. לאחר השלמת הניתוח, יש לוודא באופן חזותי כי הניתוח הוא כראוי ספירת תאים (למשל, עבור הערוץ הכולל לבדוק כי כל גרעין מוכר כגרעין וכי cytometer הדמיה לא סופר כתמים ברקע כמו גרעינים). אם הסריקה והניתוח משביעות רצון, החזר את הצלחת לאינקובטור, אחרת בצע סריקה חוזרת או שינוי של פרמטרי ניתוח.

6. הבחנה בתאי שריר האדם (hMPCs) כדי מיופופרות

  1. קבע את המפגש של hMPC באמצעות הפרוטוקול בסעיף 5.1. כדי להבדיל בין hMPCs לבין מיופים, הוא אידיאלי עבור תאים להיות 80-85% confluent כפי שנקבע על ידי פונקציית המפגש על cytometer הדמיה (ראה סעיף 5). אם משתמשים ב-hMPCs מיותר מתורם ייחודי אחד, הסריקה של המפגש מאפשרת לתאים מתורמים שונים להתחיל בבידול בזמן שיגיעו למפגש.
    הערה: ב 80% זרימה, ישנם כ 66,000 תאים/cm2.
  2. לשטוף את התאים 2x עם בידול מדיה (97% Ham ' s F12, 2% סרום הסוסים, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, pH 7.4, עבר דרך מסנן 0.22 יקרומטר).
  3. לשמור על התאים בחומרי הבחנה כל עוד הניסוי מכתיב במהלך החלפת מדיה מדי יום.
  4. הערכת ישירות היווצרות מיושפופרת על ידי מכתים חיסוני עבור שרשרת כבדה רירן, אשר בדרך כלל לזיהוי לאחר 7-10 ימים של בידול.
    הערה: הזמן הנדרש ליצירת מיופופרות עשוי להשתנות מעט בהתאם לתורם ולמספר התאים בעת התחלת הבידול; לפיכך, מומלץ לעקוב אחר תרבויות מכל תורם בנפרד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת הנציג cy, התוצאות של בידוד hMPC מרקמת השריר האנושי ניתן לראות באיור 1. hMPCs יכול להיות מזוהה על ידי הראשון האירועים מבוסס על פיזור בצד ופיזור קדימה כדי לחסל תאים מתים או פסולת, ואחריו בחירת רק תאים אשר שליליים עבור 7 עמ מ ולכן הם קיימא. בחירת תאים חיובית הן עבור סמני משטח התא CD56 ו-CD29 מייצגת את אוכלוסיית hMPC. ביופסיה של 60 מ ג רק מספק כ 75 ל-250 hMPCs.

סריקת זרימה ייצוגית מוצגת באיור

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הראשי hMPCs הם מודל מחקר חשוב המשמש להבנת ביולוגיה שריר השלד ואת תהליך ההתחדשות. בנוסף, hMPCs יש את הפוטנציאל לשמש טיפול. עם זאת, ישנם אתגרים מזוהים באמצעות hMPCs הראשי עבור מחקר וטיפול, כולל הבנה מוגבלת של תאים הנגזרים מבני אדם10. יש גם מידה גדולה של וריאציה בקיבולת הרחבה בין תרבויות התורמים, אשר מגביל את הפוטנציאל לשימוש hMPCs והוא יכול להשפיע על תוצאות המחקר11. לדוגמה, הוא הוכח לאחרונה כי hMPCs מבודדת באמצעות השיטה המתוארת בפרוטוקול זה הפיק תאים שונים בקיבולת הרחבה וזה ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לאוניברסיטת קורנל, ביוטכנולוגיה מרכז משאבים הדמיה עבור עזרתם עם מיון תא המופעל הקרינה. אנו מודים גם מולי Gheller על עזרתה עם גיוס משתתף ואריקה בנדר על ניהול ביופסיות שריר השלד. לבסוף, אנו מודים למשתתפים על זמנם והשתתפותו במחקר. עבודה זו היתה נתמכת על ידי המכון הלאומי על הזדקנות המוסדות הלאומיים לבריאות תחת הפרס מספר R01AG058630 (כדי B.D.C. ו A.E.T.), על ידי קרן גלן למחקר רפואי הפדרציה האמריקנית למענק מחקר הזדקנות עבור הפקולטה זוטר (ב . Dc), ועל ידי מועצת הנשיא לנשות קורנל (לA.E.T.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין, 2.21 מ"מ EDTACorning25-053-Clטריפסין המשמש להסרת hMPCs דבקים מכלי תרבית תאים
צלחת תרבית תאים 10 ס"מVWR664160צלחות המשמשות לתרבית hMPCs
15 מ"ל שפופרת פלקוןפלקון 352196צינורות חרוטיים של 15 מ"ל המשמשים בכל פרוטוקולי הבידוד והתרבות hMPC
צלחת תרבית תאים 24 בארGrenier Bio-One662 160צלחות המשמשות לתרבית hMPCs
7-AAD תמיסת צביעת כדאיותeBioscience00-6993-50כתם כדאיות לזיהוי תאים חיים במהלך מיון FACS
Alexa Fluor 488 CD29 אנטי אנושי, שיבוט: TS2/16BioLegend303016נוגדן מצומד עבור FACS 
צלחת תרבית תאים שחורה עם 96 בארותGrenier Bio-One655079צלחת תרבית תאים עם 96 בארות אידיאלית להדמיה פלואורסצנטית באמצעות
S Celigo SNexcelcom Bioscienceהמשמש למעקב אחר תרביות hMPC
מסננת תאיםVWR352350מסננת תאים לסילוק חתיכות גדולות של פסולת במהלך עיבוד ביופסיית שריר
קולגן מסוג I (חולדה זנב)קורנינג354236קולגן לציפוי צלחות תרבית תאים 
קולגנאז DRoche11 088 882 001משמש לפירוק קולגן ורקמות חיבור אחרות ברקמת הביופסיה של שרירי השלד
דימתיל סולפוקסידVWRWN182משמש לשימור בהקפאה של hMPCs
Dispase IISigma Life SciencesD4693פרוטאז המשמש לעיכול אנזימטי של רקמת
ביופסיה של שרירי השלדאבקת גלוקוז בינונית נמוכה של Dulbecco Modified EagleGibco31600-034DMEM דל גלוקוז לעיבוד ביופסיית שרירים
Dulbecco's Phosphate BufferedSa Salt Gibco21600-010PBS לעיבוד ביופסיית שרירים
EDTA דיסודיום מלח דיהידרטJ.T. Baker4040-01 נדרש עבור מאגר FACS
סרום בקר עובריVWR89510-186 סרום בקר עוברי המשמש למדיית גידול hMPC
F12Gibco21700-026מדיית בסיס של Ham עבור hMPCs
סרום סוסים מומת בחוםGibco26-050-070סרום סוסים המשמש לייצור hMPC מדיה התמיינות
המוציטומטרiNCytoDHC-N0105משמש לספירת
תאים Hibernate AGibcoA1247501Media לשימור ביופסיית שרירי השלד רקמות
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrateLife TechnologiesH21492כתם DNA לזיהוי כל התאים באמצעות Celigo S
IsopropanolFisher ScientificA416P-4משמש להקפאת קצב מבוקר של hMPCs
מאגר מוקסיOrfloMXA006מאגר למונה תאים אוטומטי
קלטות MoxiOrfloMXC002Cassesttes עבור מונה תאים אוטומטי
Moxi z מיני מונה תאים אוטומטיOrfloמונה תאים אוטומטי
מר מיכל הקפאה קפואתרמו פישר מדעי5100-0001זמין מסחרית מיכל הקפאת תאים בקצב מבוקר
סרום עיזים רגיל (10%)Thermo Fisher Scientific50062Zסרום עיזים המשמש במאגר
FACSPE-CY7 עכבר אנטי אנושי CD56 , שיבוט: B159BD Pharmingen557747נוגדן מצומד עבור FACS 
פניצילין/סטרפטומיצין 100x תמיסתקורנינג30-002-CIאנטיביוטיקה נוספה למצע התרבות
Propidium iodideThermo Fisher ScientificP3566כתם DNA לזיהוי תאים מתים באמצעות Celigo S
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth FactorPromegaG5071תוסף באמצעי גידול hMPC למניעת התמיינות
ספונטניתמדיום הקפאת תרבית תאי התאוששות Gibco12648-010מדיה המשמשת להקפאת תמיסות ביופסיית שרירים
נתרן ביקרבונטפישר סיינטיפיקS233-3נוסף לצינורות F12
סטריליים תחתונים עגולים 5 מ"לVWR60818-565צינורות המשמשים ל-FACS
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42חרוזי פיצוי פורט כיול זרימה הגדרות FACS
ציטומטר הדמיה של Celigo

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. D'Souza, D. M., et al. Decreased satellite cell number and function in humans and mice with type 1 diabetes is the result of altered notch signaling. Diabetes. 65 (10), 3053-3061 (2016).
  3. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from Obese humans with type 2 diabetes and differentiated into Myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657(2012).
  4. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. E. Expansion capacity of human muscle progenitor cells differs by age, sex, and metabolic fuel preference. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 315 (5), C643-C652 (2018).
  5. Charville, G. W., et al. Ex vivo expansion and in vivo self-renewal of human muscle stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
  6. Alexander, M. S., et al. CD82 Is a Marker for Prospective Isolation of Human Muscle Satellite Cells and Is Linked to Muscular Dystrophies. Cell Stem Cell. 19 (6), 800-807 (2016).
  7. Thalacker-Mercer, A., et al. Cluster analysis reveals differential transcript profiles associated with resistance training-induced human skeletal muscle hypertrophy. Physiological Genomics. 45 (12), 499-507 (2013).
  8. Garcia, S. M., et al. High-Yield Purification, Preservation, and Serial Transplantation of Human Satellite Cells. Stem Cell Reports. 10 (3), 1160-1174 (2018).
  9. Yokoyama, W. M., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Cryopreservation and thawing of cells. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3, 3G (2012).
  10. Bareja, A., Billin, A. N. Satellite cell therapy - from mice to men. Skeletal Muscle. 3 (1), 2(2013).
  11. Riddle, E. S., Bender, E. L., Thalacker-Mercer, A. Transcript profile distinguishes variability in human myogenic progenitor cell expansion capacity. Physiological Genomics. 50 (10), 817-827 (2018).
  12. Xu, X., et al. Human Satellite Cell Transplantation and Regeneration from Diverse Skeletal Muscles. Stem Cell Reports. 5 (3), 419-434 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Pax7CD56 CD29

מאמרים קשורים