מאמר שיטה

לומדת אורגל דינמיקה ב-B תאים במהלך היווצרות סינפסה החיסונית

8.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59621

⸱

1 ביוני 2019

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים שתי גישות כדי לאפיין את האירועים הקיטוב התא ב לימפוציטים B במהלך היווצרות של IS. הראשון, כולל כימות של גיוס והשלד של ארגון מחדש על הקרום סינפטית. השני הוא גישה ביוכימית, כדי לאפיין שינויים בקומפוזיציה של הסנטרוחלק, אשר עובר קיטוב לסינפסה החיסונית.

תקציר

הכרה של משטח קשור אנטיגנים על ידי קולטן התא B (BCR) מפעיל את היווצרות סינפסה החיסונית (IS), שבו הן ספיגת איתות ו אנטיגן מתואמים. היא היווצרות כולל שיפוץ דינאמי אקטין מלווה גיוס מקוטב לקרום סינפטית של הסנטרוחלק והקשורים לאורגולאים תאיים כגון ליסוזומים ומערכת golgi. בשלבים הראשוניים של שיפוץ אקטין לאפשר לתאי B להגדיל את משטח התא שלהם ולמקסם את כמות אנטיגן-bcr מכלולי התאספו בסינפסה. בתנאים מסוימים, כאשר B תאים מזהים אנטיגנים הקשורים משטחים נוקשים, תהליך זה משולב לגיוס המקומי הפרשה של lysosomes, אשר יכול להקל על החילוץ אנטיגן. אנטיגנים uptaken הם הפנימו לתוך המקצועית ליסוכמה תאים לעיבוד לתוך פפטידים, אשר נטענים על הגדול ביותר היסטוליםקומפלקס מורכבים II (MHC-II) מולקולות עבור מצגת נוספת תאים מסייע T. לכן, לימוד דינמיקה של ארגון הקשור להיווצרות IS הוא חיוני כדי להבין כיצד התאים B מופעלים. במאמר הנוכחי נדון הן בהדמיה והן בטכניקה ביוכימית המשמשת לחקר שינויים במיקום של מיצוב מאורגני ובשלד ציטותאי המשויכים להיווצרות הנמצא בתאי B.

מבוא

לימפוציטים B הם חלק חיוני של המערכת החיסונית אדפטיבית אחראי להפקת נוגדנים נגד איומים שונים והפולשים פתוגנים. היעילות של ייצור נוגדנים נקבעת על ידי היכולת של B תאים כדי לרכוש, התהליך והנוכחי אנטיגנים נתקל או בטופס מסיסים או קשור למשטח1,2. הכרה של אנטיגנים המחוברים אל פני השטח של תא מציג, על ידי bcr, מוביל היווצרות של מגע התרבות קרוב שנקרא הוא3,4. בתוך פלטפורמת דינמי זה הן BCR תלוי במורד הזרם איתות הפנמה של אנטיגנים לתוך אנדו-lysosome תאים מתרחש. אנטיגנים uptaken מעובדים והתאספו על מולקולות MHC-II ולאחר מכן הציגו לימפוציטים T. אינטראקציות ה-B-T פרודוקטיבי, כינה את שיתוף הפעולה של תא B-T, לאפשר B לימפוציטים לקבל את האותות המתאימים, אשר לקדם את הבידול שלהם לתוך מייצרת נוגדנים תאי פלזמה או תאים זיכרון8.

שני מנגנונים היו מעורבים בהפקת אנטיגן על ידי תאי B. הראשון מסתמך על הפרשת הפרוטסים שמקורם ליסוזומים העוברים גיוס והיתוך ב סינפטית שסועה5,6. השני, תלוי ברירן IIA-תיווך מושך כוחות שמפעיל את הפולשים של אנטיגן המכיל ממברנות אשר הפנימו לתוך בורות מצופה clathrin7. המצב של הפקת אנטיגן מסתמך על המאפיינים הפיזיים של קרום שבו אנטיגנים מצויים. אף על פי כן, בשני המקרים, תאי B עוברים שני אירועי שיפוץ עיקריים: התארגנות מארגון השלד הציטומה ופולריזציה של אורגלים ל-IS. השלד הפנימי של actin שיפוצים כרוך שלב התפשטות ראשונית, שם actin תלוי בליטות בקרום סינפטית להגדיל את פני השטח במגע עם האנטיגן. הדבר מלווה בשלב התכווצות, שבו BCRs בשילוב עם אנטיגנים מרוכזים במרכז של זה על ידי פעולה מתואמת של מנועים מולקולריים אקטין שלד מעצב שיפוץ8,9,10, 11. פולריזציה של אורגלים מסתמך גם על שיפוץ של שלד ציטוטין. למשל, הסנטרוחלק הופך להיות בלתי משולב מן הגרעין, על ידי הדפלוניזציה המקומית של actin הקשורים, אשר מאפשר את מיקום מחדש של האורגאל הזה הוא5,12. ב-B תאים, מיקום מחדש של הסנטרוחלק לקוטב תא אחד (IS) מדריכים לגיוס לקרום סינפטית, אשר על הפרשה יכול להקל על החילוץ ו/או עיבוד של אנטיגנים הקשור למשטח6. ליסוזומים שגויס ב IS מועשר עם MHC-II, אשר מעדיף היווצרות של פפטיד-MHC-II מכלולי בתאי אנדוזומבית להיות מוצגים T תאים13. בנוסף, מערכת Golgi נצפתה גם להיות מגויס היטב ל-IS14, הרומז כי golgi נגזר שלפוחיות מן השביל הסוד יכול להיות מעורב בהפקת אנטיגן ו/או עיבוד.

בסך הכל, מארגני התאיים והשלד הציטותאים בתאי B במהלך היווצרות סינפסה הם הצעדים העיקריים המאפשרים רכישת אנטיגן יעיל עיבוד נדרש עבור הפעלה נוספת שלהם. בעבודה זו אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים על איך לבצע הדמיה וניתוח ביוכימיים בתאי B ללמוד שיפוץ תאיים של אורגלים הקשורים היווצרות של IS. טכניקות אלה כוללות: (i) Immunofluorescence ניתוח תמונה של תאי B המופעל עם מחרוזת אנטיגן מצופה, על הכיסויים אנטיגן מצופה, אשר מאפשר הדמיה וכימות של רכיבים תאיים המגייסו ל IS ו (ii ) בידוד של מספר שברים מועשר ב-B בתאי על ידי הסתבכות על מעברי הצבע של סוכרוז, המאפשר זיהוי של חלבונים הקשורים ל-centrosome העלולים להיות מעורבים בוויסות קוטביות התא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: השלבים הבאים בוצעו באמצעות IIA 1.6 B תאים.

1. B הפעלת תא עם חרוזים מצופי אנטיגן

  1. הכנת חרוזים מצופי אנטיגן
    1. כדי להפעיל תאים B, השתמש ב-NH2חרוזים מצופה בשמן עם אנטיגן (מצופה Ag), אשר מוכנים באמצעות 50 μl (~ 20 x 106 חרוזים) של 3 יקרומטר NH2חרוזים עם הפעלת (bcr-ligand +) או לא הפעלה (bcr-ligand-) אנטיגנים.
    2. עבור IIA 1.6 B תאים להשתמש anti-IgG-F (ab ')2 קטע כמו bcr-ligand + ו Anti-igg-F (ab ')2 או סרום שור אלבומין (BCR) כמו bcr-ligand-. כדי להפעיל את התאים B הראשי או IgM+ B קו התא להשתמש אנטי-igm-F (ab ')2 כמו bcr-ligand + ו-BCR כמו bcr-ligand-.
      הערה: כדי למנוע את הכריכה של ליגשים לקולטן Fc, השתמש ב-F (ab) או F (ab)2 שברי נוגדנים במקום נוגדנים באורך מלא.
    3. כדי להמשיך עם הכנת חרוזים מצופה Ag, מניחים את החרוזים בצינורות חלבון נמוך כריכת מיקרוצנטריפוגה כדי למקסם את הטיפול חרוזים במהלך מניפולציה לדוגמה. הוסף 1 מ ל של מתמיסת מלח 1x פוספט באגירה (PBS) כדי לשטוף חרוזים וצנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 5 דקות.. ולאכול את הסופרנטאנט
    4. השהה מחדש את החרוזים עם 500 μL של 8% גלוטארלדהיד כדי להפעיל את NH2 קבוצות ולסובב עבור 4 h בטמפרטורת החדר (RT).
      התראה: יש להשתמש בתמיסה הגלוטרלדהיד רק בתוך מכסה כימי. בצע את ההוראות שבגליון הנתונים של בטיחות החומרים (MSDS).
    5. חרוזי צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 5 דקות, להסיר את glutarאלדהיד ולשטוף את החרוזים שלוש פעמים יותר עם 1 מ ל של 1X PBS.
      התראה: פתרון הגלוטרלדהיד צריך להיות מושלך כפסולת כימית מסוכנת.
    6. השהה מחדש את החרוזים שהופעלו ב-100 μL של 1x PBS. המדגם יכול להיות מחולק לשני צינורות חלבון מיקרוצנטריפוגה נמוך כריכה: 50 μL עבור BCR-ligand + ו 50 μL עבור BCR-ligand-.
    7. כדי להכין את הפתרון אנטיגן להשתמש two 2 מ"ל חלבון נמוך כריכה מיקרוצנטריפוגה צינורות המכילים 100 μg/mL של פתרון אנטיגן ב 150 μL של PBS: צינור אחד עם BCR-ligand + אחרים עם BCR-ligand-.
    8. הוסף 50 μL של הפתרון חרוזים שהופעלו כל צינור המכיל 150 μL של פתרון אנטיגן, מערבולת ולסובב לילה ב 4 ° c.
    9. הוסף 500 μL של 10 מ"ג/mL BSA כדי לחסום את הנותרים התגובתית NH2 קבוצות על החרוזים ולסובב עבור 1 h ב 4 ° c.
    10. צנטריפוגה את החרוזים ב 16,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' ולהסיר את supernatant. שטוף את החרוזים עם הקור הקר 1x עוד 3 פעמים.
    11. השהה מחדש את החרוזים שהופעלו ב-70 μL של 1x PBS.
    12. כדי לקבוע את הריכוז הסופי של חרוזי Ag מצופים, יש לדלל נפח קטן של חרוזים ב-PBS (1:200) ולספור באמצעות המעי. לאחר מכן החנות ב-4 ° צ' עד השימוש.
      הערה: אין לאחסן חרוזים מצופי Ag במשך יותר מחודש אחד.
  2. הכנת שמיכות פולי-אל-ליזין
    1. לפני הפעלת התא B באמצעות חרוזים מצופה Ag, להכין את פולי-L-ליזין מצופה כיסוי (PLL-coverslips). השתמש בצינור 50 mL המכיל 40 mL של 0.01% w/v של פתרון PLL ולטבול את 12 מילימטר בקוטר שמיכות לתוך הפתרון. סובב את הלילה בשעה RT.
    2. לשטוף את שמיכות עם 1x PBS ולעזוב להתייבש על מכסה צלחת 24 מכוסה בסרט פרפין. המשך בהפעלת תא B.
  3. B הפעלת תא
    1. כדי להתחיל ב-B הפעלת תא עם חרוזים, תחילה לדלל את IIA 1.6 B התא כדי 1.5 x 106 תאים/mL במדיום לחץ (RPMI-1640 בתוספת 2 מ"מ L-Alanine-l-גלוטמין + 55 μm ביתא-mercaptoethanol + 1 מ"מ פירובט + 100 U/מ"ל פניצילין + 100 μg/ml סטרפטומיצין) + 5% סרום בלתי מופעל לפני החום של העובר [FBS]).
    2. לשלב 100 μL (150,000 תאים) של IIA 1.6 B תאים עם חרוזים Ag מצופה ביחס 1:1 בצינורות 0.6 mL. מערבבים בעדינות באמצעות מערבולת וזרע על כיסוי PLL. דגירה של נקודות זמן שונות בחממה תרבות התא (37 ° צ'/5% CO2). נקודות זמן ההפעלה אופייני הן 0, 30, 60 ו 120 דקות. במשך הזמן 0, מניחים את המכסה. לתוך מכסה הצלחת 24 שעות בקרח הוסף את התערובת של תאים Ag מצופה ומודטה עבור 5 דקות על הקרח.
      הערה: חשוב לערבב על ידי מערבולת במקום ללטף למעלה ולמטה, כי זה יכול להפחית את מספר החרוזים במדגם, בשל הצטברות שלהם בקצה פלסטיק של הפיפטה. השתמש בחרוזים מצופים ב-BCR-ligand-כפקד שלילי עבור כל שיטת התשובה. מומלץ להפעיל תחילה את זמן הדגירה הארוך ביותר ולאחר מכן את נקודות הזמן הבאות. חשב מרווחי הפעלה עבור דגימות כגון שהן מוכנות לקיבוע בו.
    3. הוסף 100 μL של הקרה 1x PBS לכל שמיכות כדי לעצור את ההפעלה ולהמשיך עם פרוטוקול מimmunofluorescence. ראה נוהל מדור 3.

2. B תא הפעלה על שמיכות אנטיגן מצופה

  1. הכנת שמיכות מצופי אנטיגן
    1. לפני ההפעלה, להכין את הפתרון אנטיגן (1x PBS המכיל 10 μg/mL BCR-ligand + ו 0.5 μg/mL עכבר נגד CD45R/B220).
      הערה: שקול להכין את הכיסויים ביום שלפני השיטת הדעת. B220 משפר את B הדבקה בתא, עם זאת, BCR-Ligand + מספיק כדי ליצור את תגובת ההתפשטות.
    2. מקום שמיכות 12 מ"מ על מכסה צלחת 24 היטב מכוסה בסרט פרפין, להוסיף 40 μL של פתרון אנטיגן על כל coverslip ו-מודטה ב 4 ° c לילה. חותם את הצלחת כדי למנוע אידוי של פתרון אנטיגן.
    3. שטפו את הכיסויים בערוץ 1 x PBS והאוויר יבש.
  2. B הפעלת תא
    1. כדי להתחיל את ההפעלה, לדלל IIA 1.6 B תאים כדי 1.5 x 106 תאים/mL באמצעי לחץ + 5% fbs.
    2. הוסף 100 μL של תאים אל כיסוי מצופה אנטיגן (Ag-coverslip) ולהפעיל עבור נקודות זמן שונות בחממה תא ב 37 ° צ'/5% CO2. נקודות זמן ההפעלה האופייניות הן 0, 30 ו-60 דקות.
      הערה: כמו בסעיף 1, מומלץ להתחיל בנקודת זמן ההפעלה הארוכה ביותר כדי לתקן את כל הדגימות בו.
    3. במשך הזמן 0, המקום מכסה את הצלחת 24-היטב המכיל את שמיכות Ag על הקרח ולהוסיף את התאים. מודקון למשך 5 דקות על הקרח.
    4. בזהירות לחלק את התקשורת על כל Ag-כיסוי ולאחר מכן להוסיף 100 μL של קר 1x PBS להפסיק את ההפעלה. . המשיכי בפרוטוקול האימונולואוורנציה ראה סעיף 3.

3. אימונולואורנציה

הערה: כדי למנוע הצלבה של הנוגדן המשני עם BCR של IIA 1.6 B תאים, לא להשתמש בנוגדנים הראשי הנגזר העכבר.

  1. הסר את ה-PBS 1x והמשך עם הקיבעון של כל הכיסויים.
    הערה: כדי להחליט באיזה קיבוע בינונית להשתמש, בדוק את הנוגדן/דף נתוני הצבע. לדוגמה, עבור תיוג אקטין על ידי phalloidin להשתמש במדיום הקיבעון (מדיום) קיבוע בינוני, ועל מערך התיוג של הסנטרוכמה על ידי קרום הלב בשימוש מתנול קיבוע.
    1. הוסף 50 μL של PBS 1x שיושלם עם 4% בתחתית ו דגירה של 10 דקות ב RT.
      זהירות: פורמלדהיד רעיל. אנא קרא את MSDS לפני העבודה עם הכימיקל הזה. הפתרונות ההכבושים צריכים להתבצע רק תחת כיסוי כימי שלובש כפפות ומשקפי בטיחות. יש לסלק את הפתרון ההכדורגלן כפסולת כימית מסוכנת.
    2. לחילופין, להוסיף 50 μL של מתנול קר ו דגירה עבור 20 דקות.
  2. לרחוץ שלוש פעמים עם 1x PBS.
    הערה: כיסוי יכול להיות מאוחסן ב 4 ° c בשלב זה למקסימום שלושה ימים ב-1x PBS.
  3. הסר 1x PBS ולהוסיף 50 μL של חסימת מאגר (2% BSA + 0.3 M גליצין ב 1x PBS) על כל שמיכות. דגירה ב RT עבור 10 דקות.
  4. מנושף בעדינות ומוסיף 50 μl של מאגר החדירות (PB) (0.2% bsa + 0.05% סאפונין 1x PBS). דגירה ב RT עבור 20 דקות.
  5. הכן את הנוגדנים או הצבעים ב-PB (שימוש 30 μL לכל coverslip) ו-דגירה ב RT עבור 1 h או לילה ב 4 ° c. לפרטים נוספים , עיין ברשימת החומרים.
    1. כדי לתייג את מרכז ההתארגנות המיקרוכדורית (MTOC) או סנטרוכמה להשתמש בנוגדנים הבאים: anti-γ-טובולין (1:500), אנטי-Cep55 (1:500), anti-α-טובולין (1:500), נגד כניסות (1:1000).
      הערה: עבור centrosome תיוג תאים B ניתן לעגל עם ביטוי מרכזי-GFP ביטויים פלביניים.
    2. עבור תיוג מנגנון Golgi להשתמש anti-Rab6a (1:500).
      הערה: ניתן להשתמש גם בנוגדנים או בצבעים אחרים.
    3. עבור תיוג lysosomes, השתמש anti-Lamp1 (1:200).
      הערה: anti-H2-DM ו anti-mhc-II גם ניתן להשתמש בתווית תאים לעיבוד אנטיגן15,16.
    4. לתיוג באמצעות השימוש ב-anti-Sec61a (1:500).
    5. עבור השלד ציטוטין לשקול את הפעולות הבאות: הפלטין אקטין יכול להיות מדמיין על ידי phalloidin מצובעם צבעי פלורסנט.
      הערה: התאים הנמצאים בשימוש בעזרת מפעל החיים-GFP/RFP ביטוי פלמיד יכול לשמש גם לתווית actin.
  6. תשטוף את הכיסויים. שלוש פעמים בערוץ ההתרמה
  7. לדלל את הנוגדן או הצבעים המשני ב-PBS (להשתמש 30 μL לכל coverslip) ו-מודטה 1 h ב RT.
    הערה: הימנע מחשיפת הדגימות לאור ישיר כדי לשמר את איכות האות הפלואורסצנטית.
  8. תשטוף את הכיסויים. שלוש פעמים בערוץ ההתרמה
  9. הסר את פתרון ה-PBS מתוך שוברי כיסוי.
  10. הוסף 4 μL של הרכבה מגיב לשקופית מיקרוסקופ. הר את הכיסויים לתוך השקופית כאשר הצד התא פונה כלפי מטה. הניחו לשקופיות להתייבש במשך 30 דקות ב-37 ° c או ב-RT בלילה.
    הערה: שקול להשתמש בחומרי הרכבה "אנטי-לדעוך" (עיין בטבלת החומרים).
  11. לרכוש תמונות פלואורסצנטית על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד או אפידלנטית עם מטרת טבילה 60x או 100x שמן. עבור כל רכישה לשקול את האור המשודר או שדה בהיר כדי לזהות בקלות תאים B אינטראקציה עם חרוזים.
    הערה: לקחת תמונות תלת ממדיות (3D), כיסוי התא כולו באמצעות מחסניות z. אנו ממליצים לקחת 0.5 יקרומטר ערימות עבות, אולם זה תלוי במיקרוסקופ.

4. ניתוח תמונה

הערה: האלגוריתמים הבאים מתוארים עבור תוכנת ImageJ. עם זאת, ניתן לבצע זאת באמצעות תוכנה מקבילה. כמו כן, לשקול כי עבור כל מדידות אינטנסיביות הקרינה אנו משתמשים בצפיפות הפלואורסצנטית משולבת ("RawIntDen" ב-ImageJ), משום שפרמטר זה רואה את הכמות הכוללת של הזריחה בכל פיקסל של התמונה, לוקח את השטח לחשבון.

  1. ניתוח הפצת האורגלים בתאי B המופעל בחרוזים מצופי Ag
    הערה: כדי לכמת את הקיטוב של רכיבי התא ל-IS, אנו מגדירים ערך שרירותי כאמצעי קירבה ל-IS. האינדקס נע בין -1 (אנטי מקוטב) ו-1 (מקוטב מלא, אובייקט על חרוז), כפי שהוצג בעבר על ידי התהודה ואח '.12.
    1. העריכו את אינדקס הקוטביות של מערכת הסנטרוחלק ומערכת גולג'י (איור 1B).
      הערה: ניתן להשתמש באלגוריתם זה עבור אורגלים המוגבלת לנקודה אחת.
      1. ראשית להגדיר את אזורי חרוז ותאים כדי לנתח באמצעות בחירת הכלי מעגל כדי להפריד את גבולות של שניהם, ולאחר מכן לשמור אותם כאזורי עניין (ROI). ראו איור 1, איור 2, איור 3ואיור 4.
      2. קבע את מרכז התא (CC) ואת מרכז החרוזים (BC) על-ידי הפעלת לנתח | מדידה באזורי תא וחרוזים בהתאמה. ערכי X ו-Y שהתקבלו מחלון התוצאות קובעים את קואורדינטות המרכז.
      3. באופן ידני לקבוע את מרכז הסנטרוחלק או מכשיר Golgi (אורגאל) באמצעות בחירת הכלי נקודה ב imagej ולהפעיל לנתח | . מידה מדידה ערכי X ו-Y שהתקבלו מחלון התוצאות קובעים את נקודות הציון.
      4. לאחר מכן, צייר זווית מ-CC לארגונית (a) ו-CC to BC (ב) באמצעות בחירת הכלי זווית והפעל את הניתוח | . מידה מדידה ערך הזווית בחלון התוצאות מציג את הזווית (α) בין שני הווקטורים (a ו- b).
      5. חשב את אינדקס הקוטביות באמצעות הנוסחה הבאה:
        figure-protocol-1
    2. הערכת אינדקס הקוטביות עבור ליסוזומים (איור 1F).
      הערה: אנו משתמשים באלגוריתם זה כדי לנתח את קוטביות האורגלים המציגות הפצה מפוזרת יותר, כגון ליזוזומים.
      1. הגדירו את שטחי החרוז והתאים כדי לנתח, באמצעות בחירת הכלי עיגול כדי להפריד את גבולות השניהם, ולשמור אותם כ-ROI. ברגע שאזורי החרוז והתאים מוגדרים, הגדר את ערוץ הזריחה והעבר את התמונה לערימה אחת של z (תמונה | ערימות | Z-Project [סיכום פרוסות]) ולאחר מכן הפעל את הניתוח | מדוד וחלץ את קואורדינטות מרכז המסה (ה-MX ו-MY) מהחלונות בתוצאות.
      2. החל את אותו אלגוריתם שהוזכר לפני שינוי ארגונית עבור MC. לפיכך, הזווית (α) מוגדרת על ידי CC-MC (a) ו-cc-BC (ב).
      3. חשב את הקוטביות באמצעות הנוסחה הבאה:
        figure-protocol-2
    3. הערכת ליזוזום גיוס לאזור סינפטית (איור 2b).
      הערה: אלגוריתם זה משמש לכמת ארגונית הסמוכה ל-IS.
      1. לאחר קביעת אזורי החרוז והתאים, קבעו את זווית הווקטור בין CC ו-BC ולאחר מכן סובבו את התמונה כדי להשיג זווית של 0 °.
      2. הגדר את ערוץ הפלורסנט והכה את התמונה לערימת z אחת (תמונה | ערימות | Z-Project [Sum slices]), לחסל את כל הזריחה הנופל מחוץ לאזור התא וחרוזים יחד (להפעיל לערוך | נקה בחוץ ב-imagej).
      3. בעזרת הכלי מלבן , ציירו מלבן הסמוך לחרוז ומדדו את האזור הסינפנטית (מוסף). מלבן זה הוא רבע מרוחב התא.
      4. בחר את כל התמונה והפעל את הניתוח | מדידה כדי להשיג את הזריחה השלמה של התא (WCF).
      5. חשב את אחוז הזריחה הארגונית הסמוכה ל-IS באמצעות הנוסחה הבאה:
        figure-protocol-3
    4. מכמת הגיוס של רכיבים סלולריים לסנטרוחלק.
      הערה: אלגוריתם זה, המותאם מ-Obino et al.5, משמש לכמת את העשרת האורגלים באזור הסנטרואין. בקצרה, אנו מחשיבים את אזור הסנטרוכמה כתחום שבו הקרינה הפלואורסצנטית משויכת של הסנטרוחלק נותרת קבועה או מעל 70% בחלקה של הזריחה/רדיוס. הכרחי להגדיר פרמטר זה בתנאי מנוחה מאחר שרדיוס זה עלול להשתנות בעת ההפעלה.
      1. לאחר קביעת שטחי החרוז והתאים, הגדר את הלוקליזציה של הסנטרוחלק באמצעות הבחירה בכלי הנקודה (איור 3b).
      2. ראשית, לקבוע את האזור המקסימלי סביב הסנטרוכמה כי ניתן לכמת, על ידי ציור 3 μm-רדיוס מעגל סביב הסנטרוכמה.
      3. השתמש בפרופיל ה -imagej plugin של התוסף, המודד את הקרינה הפלואורסצנטית בעיגולים קונצנטריים ומציג מזימה של זריחה/רדיוס.
      4. זיהוי הרדיוס המקסימלי שבתוכו נשמר לפחות 70% מעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית.
      5. חשב את יחס צפיפות הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות הנוסחה הבאה:
        figure-protocol-4=figure-protocol-5
        הערה: יחס הצפיפות הפלואורסצנטית מציין את הריכוז של ארגון מסוים ב-centrosome בהשוואה לתפוצתה בתא כולו.
  2. ניתוח הפצת תאים והפצה של אורגלים בתאי B המופעל באמצעות כיסוי Ag
    1. הערכת התפלגות ארגונית ב-IS (איור 4B).
      הערה: אלגוריתם זה מאפשר את הכמת של התפלגות XY של אורגלים והריכוז שלהם במרכז IS. אנו מגדירים יחס של צפיפות הזריחה בין המרכז לבין האזור הסינפטית הכולל. הערכים שהושגו יכולים להשתנות מנגטיב לחיובי, המציינים התפלגות היקפית או הפצה מרכזית של הארגון, בהתאמה.
      1. קבע את הפרוסה שבה התא נמצא בקשר עם המכסה.
        הערה: כדי להפריד את גבולות התא ניתן לתייג את קרום הפלזמה או אקטין אשר מועשר בפריפריה של is.
      2. שינוי סוג הפרוסה ל-8 סיביות, לאחר מכן binarize (תהליך | בינארי | הפוך לבינארי) וחבר את הנקודות האחרות הקרובות ביותר תהליך | בינארי | חלוקה לרמות. מפריד את גבולות אזור התא (CA) באמצעות בחירת הכלי מצולע .
        הערה: שלב זה שימושי כדי להגביר את הניגודיות של גבולות התא ולהקל על זיהויך. בנוסף, בשלב זה, ניתן להחיל את התוסף לניתוח חלקיקים של imagej כדי לקבוע את ה-CA באופן אוטומטי. עם זאת, תאים אחרים באותו שדה עלולים להפריע לתוצאות.
      3. קח פרמטרים של CA (גובה ורוחב) ומפריד אזור מרכזי מעוגל, המופרד מגבולות הגבול ברבע מערכי הגובה והרוחב, שקול לאזור זה כאזור מרכז התאים (אמנות עכשווית).
      4. חשב את התפלגות צפיפות הזריחה במרכז ה-IS באמצעות הנוסחה הבאה:
        figure-protocol-6
    2. מדידת התפלגות ארגונית במטוסי Z (איור 4C).
      הערה: ניתוח זה קובע את ההתפלגות הכללית של הזריחה הארגונית על פני מישורי Z של תאי B המופעל על Ag-כיסוי, מראה את אחוז הזריחה לכל Z שבר.
      1. כדי לכמת את התפלגות הזריחה Z, תחילה לקבוע את המישור של זה שבו התא נמצא במגע עם Ag-כיסוי ולאחר מכן המטוס המתאים לגבול העליון של התא.
      2. צייר קו על-פני מרכז התא.
      3. פורסים מחדש את התמונה Z (תמונה | ערימות | Reslice), כדי לקבל תמונת XZ.
      4. מדוד את הגובה וחלק את תמונת XZ לתוך 10 מלבנים רצופים באותו גובה (שבר Z) מלמטה (ממשק IS) לחלק העליון (בצד העליון של התא) ולכמת את האות הפלואורסצנטית בכל אחד.
      5. לנרמל את העוצמה הפלואורסצנטית של כל שבר Z על ידי סכום של הזריחה הכוללת של 10 שברים.
      6. התווה את אחוז העוצמה הפלואורסצנטית לכל חלק Z של התא.

5. בידוד שבריר מועשר מתאי B במנוחה והפעלה

הערה: יש לשמור על כל הפתרונות ב -4 ° c במהלך הניסוי כדי למנוע השפלה בחלבון. פרוטוקול זה הותאם מהעבודה הקודמת17,18.

  1. הפעל 2 x 107 B תאים עם חרוזי Ag מצופה ב 2 מ ל של מדיום לחץ + 2% חום מופעל fbs (יחס 1:1). שקול תאים B שאינם מופעלים כתאי מנוחה B.
  2. הוסף ציטוצ'סין D (2 μM) ו nocodazole (0.2 μM) ו-דגירה עבור 1 h ב 37 ° c.
    הערה: תרופות אלה משמשות כדי לנתק בעדינות את הסנטורים מתוך הגרעין, על ידי משתמשים בשלד ציטוטין ומיקרוטובוקלס, בהתאמה, כדי למנוע זיהום גרעיני.
  3. לשטוף כל מדגם עם 5 מ ל קר 1x TBS (50 mM טריס-HCl, pH 7.6, 150 mM הנאל) ולאחר מכן עם 1 מ ל של 0.1 x TBS שיושלם עם 8% סוכרוז.
  4. השהה מחדש את התאים עם 150 μL של מאגר פירוק המאלף (1 מ"מ HEPES, pH 7.2, 0.5% NP-40, 0.5 mM MgCl2, 0.1% ביתא-Mercaptoethanol, 1 מ"מ פנילימתיט פלוולוניל (PMSF) או קוקטייל פרוטאז מעכבי) ו פיפטה עד צמיגות פוחתת, המציינת שליזה התאים מזוהה במדגם. . שים את הדגימה בשפופרת 1.5 מ ל
  5. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, כדי להפריד את האורגלים מן הגרעין.
  6. בזהירות לשחזר את supernatant ומניחים אותו על גבי שפופרת 1.5 mL עם 300 μL של מאגר הדרגתי (GB) (10 מ"מ צינורות pH 7.2, 0.1% טריטון X-100, 0.1% בטא-mercaptoethanol) המכיל 60% סוכרוז.
  7. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° צ' כדי לרכז את הסנטרוזומים ב 60% שבריר השבר.
  8. בינתיים, להכין מעבר מתמשך בלתי רציף 2 mL ultracentrifuge צינורות ידי כיסה 450 μl של gb + 70% סוכרוז עם 270 μl של gb + 50% סוכרוז ולאחר מכן 270 μl של gb + 40% סוכרוז.
  9. לאחר הצנטריפוגה הראשונה (החלק המרוכז מרוכז), מחק את השבר העליון (חלק צפוף פחות) עד שתגיע לממשק ומערבולת את הדגימה הנותרת בשפופרת. לאחר מכן, שכבת-על מעל מעבר הצבע הרצוף שהוכן קודם לכן עם הדגם העשיר של הסנטרוכמה.
    הערה: היזהר שלא לשבש את מעבר הצבע, יש לבצע בזהירות את כל נוהלי הליטוף.
  10. צנטריפוגה ב 40,000 x g עבור 1 h ב 4 ° c עם האצה מינימלית עם בלם הצנטריפוגה מוגדר לבטל, כדי למנוע שיבוש הדרגתי.
  11. לאסוף 12 שברים של 100 μL לתוך צינורות נפרדים החל מלמעלה.
  12. לזהות את הסנטרוכמה שברים מועשר על ידי כתמי חיסוני באמצעות γ-טובולין כסמן centrosome סוימים.
    הערה: אנו מוצאים בדרך כלל תמצית מועשרת בין שברים 6 ו-8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המאמר הנוכחי מראה כיצד התאים B יכול להיות מופעל באמצעות אנטיגן קיבוע על חרוזים או coverslips כדי לגרום להיווצרות של IS. אנו מספקים מידע על כיצד לזהות ולכמת את הקיטוב של מארגני שונים על ידי מערכת חיסונית וכיצד לאפיין חלבונים העוברים שינויים דינמיים בהתאגדות שלהם לסנטרוחלק, אשר מקטזים ל-IS, באמצעות גישה ביוכימית.

הדמיה של תאי B על ידי immunofluorescence מאפשר לנו לעקוב אחר הדינמיקה של אורגלים כגון centrosome מכשיר Golgi ו lysosome...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מתארים שיטה מקיפה ללמוד כיצד B לימפוציטים לארגן מחדש את הארכיטקטורה תאיים שלהם כדי לקדם את היווצרות של IS. מחקר זה כולל את השימוש בטכניקות הדמיה כדי לכמת את התפלגות תאיים של אורגלים, כגון centrosome מכשירים Golgi ו-lysosomes במהלך הפעלת התא B, וכיצד הם הקיטוב כדי IS. בנוסף, אנו מתארים גישה ביוכימית ללימוד שינויים בקומפוזיציה המרכזית על גבי הפעלת תא B.

כדי לקדם את היווצרות הוא ב-B תאים, השתמשנו אנטיגנים בלתי מקובלים (מצופה אנטיגן חרוזים) במקום מסיסים החיסונית-תסביכים כי לשעבר מפעילה את הקמת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

M.-I.Y. נתמך על ידי מענק מחקר מ FONDECYT1180900. J.I., D.F ו J.L. היו נתמכים על ידי מלגות מתוך האינטרנציונל הלאומי. אנו מודים לדוד אוסוריו מאוניברסיצ קאנוקיה דה צ'ילה להקלטת וידאו ולעריכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי לימפומה מסוג B מעכבר IIA1.6 (וריאנט A20)ATCCTIB-208לימפומה מסוג B מוריני ממוצא Balb/c המבטא BCR המכיל IgG על פניו ללא FcγIIR
מתנול 100%Fisher ScientificA412-4
זכוכית כיסוי בקוטר 10 מ"מ עובי מס' 1 עגולהMarienfield-Superior111500
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Alexa 488 fluor- חמור נגד-ארנב IgG LifeTech A21206מלצה על דילול 1:500 אך יש לייעל
Alexa Fluor 546 עז נגד-ארנב IgGThermo Fisher Scientific A-11071מלצה על דילול 1:500 אך יש לייעל
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidinThermo Fisher Scientific A21238מלצה על דילול 1:500 אך יש לייעל
ערכת Amaxa Nucleofection kit VLonzaVCA-1003יש לעקוב אחר הוראות היצרן לערבוב חומרי התעתוק עם ה-DNA
דגם Amaxa Nucleofector 2bLonzaAAB-1001נעשה שימוש בתוכנית L-013
Amino- DynabeadsThermoFisher14307D
נגד-pericentrin Abcamab4448 מלצה על דילול 1:200 אך יש לייעל
נגד-rab6Abcamab95954מלצה על דילול 1:200 אך יש לייעל
נגד-sec61Abcamab15575מלצה על דילול 1:200 אך יש לייעל
BSA Winkler BM-0150
CaCl2WinklerCA-0520
צלחת תרבות T25BD353014
תוכנת FijiFiji col.
Fluoromount GElectron Microscopy Science17984-25
גלוטמיןThermo Fisher Scientific35050061
GlutaraldehydeSigma G7651 
GlycineWinkler BM-0820
נוגדן עז נגד-עכבר IgGJackson ImmunoResearch315-005-003ליגנד חיובי IIA1.6
נוגדן עז נגד-עכבר IgMThermo Fisher Scientific31186ליגנד שלילי IIA1.6
סרום עוברי פרה HyCloneThermo Fisher ScientificSH30071.03להפוך ללא פעיל מבחינה תרבותית ב-56 oC למשך 30 דקות
KClWinklerPO-1260
מיקרוסקופ Leica SP8 TCSLeica
NaClWinklerSO-1455
מיקרוסקופ אפיפלואורוס Nikon Eclipse Ti-E Nikon
ParafilmMP1150-2
פרפורמלדהידMerck30525-89-4יש לדלל ל-4% עם PBS בארון בטיחות, יש להשתמש ברגע
פניצילין-סטרפטומיציןThermo Fisher Scientific15140122נוזלי
חרוזי Polybead Amino 3.00μmPolyscience17145-5
Poly-L-LysineSigmaP8920יש לדלל עם מים סטריליים
נוגדן ארנב נגד אלפא טובולייןAbcamab6160מלצה על דילול 1:1000 אך יש לייעל
נוגדן ארנב נגד חלבון lamp1 של עכברCell signaling3243מלצה על דילול 1:200 אך יש לייעל
נוגדן ארנב נגד-cep55 Abcamab170414מלצה על דילול 1:500 אך יש לייעל
נוגדן עכבר נגד חלבון גמא טובוליין Abcamab16504 1:1000 ל-Western Blot
RPMI-1640Biological Industries01-104-1A
ספונין Merck558255
נתרן פירובטThermo Fisher Scientific11360070
סוכרוזWinkler SA-1390 
Triton X-100 Merck9036-19-5
צינור 50 מ"לCorning353043

מקורות

  1. Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
  2. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  5. Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
  6. Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  7. Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
  8. Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
  9. Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
  10. Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
  11. Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
  12. Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
  13. Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
  14. Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
  15. Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
  16. Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
  17. Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
  18. Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
  19. Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
  20. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
  21. Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BWestern Blot

מאמרים קשורים