עיצוב אוטומטי, תפוקה גבוהה, ניסויים בגידול תאים רציפים באמצעות הפיתוח

סיכום

מסגרת החברה מאפשרת תרבות רציפה ומיקרוביאלית של תפוקה גבוהה עם רזולוציה גבוהה ושליטה דינמית על פרמטרים ניסיוניים. פרוטוקול זה מדגים כיצד להחיל את המערכת על מנת לבצע ניסוי כושר מורכב, המנחה את המשתמשים בתיכנות אוטומטי של שליטה על תרבויות בודדות, מדידת, איסוף ואינטראקציה עם נתונים ניסיוניים בזמן אמת.

תקציר

שיטות התרבות המתמדת מאפשרות לגדל תאים בתנאים סביבתיים מבוקרים, ולכן שימושיים באופן נרחב למדידת פנוטיפים לכושר ולשיפור ההבנה שלנו כיצד מעוצבים על ידי בחירה. מאמצים רבים לאחרונה לפתח וליישם נישה התקנים מתמשך התרבות חשפו את היתרונות של ניהול צורות חדשות של בקרת תרבות התא. זה כולל הגדרת לחצים בחירה מותאמים אישית ותפוקה גוברת עבור מחקרים החל האבולוציה לטווח ארוך לבחירות הגנום הרחב בחירות והגדרת מעגל גנטי סינתטי. פלטפורמת הפיתוח פותחה לאחרונה כדי לענות על הביקוש הגובר הזה: פלטפורמת תרבות רציפה עם רמה גבוהה של מדרגיות, גמישות ואוטומציה. ההתפתחות מספקת פלטפורמה יחידה היכולה להיות (re)-מוגדרת ומקנה מידה מינימלי לביצוע סוגים רבים ושונים של ניסויים בבחירת תפוקה גבוהה או רב-מימדי. כאן מוצג פרוטוקול שיספק למשתמשים את המסגרת תיאור לקביעת התצורה של המערכת לניהול ניסוי מותאם אישית של צמיחה רציפה בקנה מידה גדול. באופן ספציפי, הפרוטוקול מנחה את המשתמשים כיצד לתכנת את המערכת למגה-בתים של שתי לחצים – טמפרטורה ומססמנים-על -פני מבחנות רבות של המרכז, כדי לכמת את נופי הכושר של המוטציות הצאביסים בסדר רזולוציה. אנו מציגים כיצד ניתן להגדיר את תצורת ההתקן הן באופן תוכניתי, באמצעות התוכנה הפתוחה-מבוססת-האינטרנט שלה, ופיזית, על-ידי סידור של פלואידיג ופריסות חומרה. התהליך של הקמת המכשיר באופן פיזי, תכנות שגרת התרבות, ניטור ואינטראקציה עם הניסוי בזמן אמת באמצעות האינטרנט, דיגום דגימות לניתוח לא מקוון אחר, וניתוח נתונים לאחר ניסוי מפורטים. זה אמור לשמש נקודת התחלה עבור חוקרים ברחבי דיסציפלינות מגוונות כדי ליישם את הפיתוח בתכנון של ניסויים מורכבים שלהם צמיחה תאים התפוקה הגבוהה כדי ללמוד ולטפל במערכות ביולוגיות.

מבוא

טכניקות מתמשך של תרבות התא, שפותחה לראשונה כמעט 70 שנים לפני^1,2, הם נהנים התחייה האחרונה^3,4. הדבר נובע מזרימה של גורמים. ראשית, הפיתוח של טכניקות תפוקה גבוהה-omics, אשר אפשרו לקרוא וליצור מספר גדול של גנוטיפים^5,6, יצרה דרישה במקביל עבור טכניקות ניסיוני המאפשרים צמיחת תאים מבוקרת היטב ופנוטיפים. לשם כך, התרבות הרציפה מייצגת גישה ניסיונית רבת עוצמה כדי לנצל את ההתקדמות הגנומית של מתהווה. על ידי הקלה על בחירות צמיחה/ניסויים על אוכלוסיות הסלולר בשליטה מדויקת (דינמי) תנאים סביבתיים, התרבות הרציפה מספק אמצעי למפות בקפדנות מיפוי כדי פנוטיפים^7,8, לכימות אפיון זנים ואורגניזמים מהונדסים⁹, ומעקב אחר שינויים גנטיים גמישים במחקרים אבולוציה מעבדה^10,11,12.

שנית, הופעתה האחרונה של שיטות אבי-טיפוס נגישים, כגון הייצור התוסף ורכיבי החומרה והתוכנה של הקוד הפתוח, אפשרה לקבוצה רחבה יותר של משתמשים לעצב ולבנות צורות חסכוניות משלהם של מערכות תרבות רציפות. ישירות במעבדה. כל זה הוביל למערך מלהיב של התקני עשה זאת בעצמך (DIY) המבצעים פונקציונליות רציפה של התרבות, כגון הכימוסטט¹³, turbidostat¹⁴, או morbidostat¹⁵. למרבה הצער, למרות שהצליחו לטפל בבעיות ספציפיות (נישה) שעבורן הן עוצבו, פתרונות אד-הוק אלה חסרי בדרך כלל את היכולת לשנות את התפוקה ו/או מורכבות התכנון הניסיוני.

מערכת התכנון תוכננה במטרה ליצור פלטפורמה אחת שיכולה להכיל את הצרכים הניסיוניים הגוברת של התרבות הרציפה ולהתאים את המהירות וההיקף של טכניקות גנומית של מתהווה¹⁶ (איור 1a). עיצוב הפיתוח מיישם אמונות נפוצות המשמשות לטכנולוגיות מדרגיות מאוד מדיסציפלינות אחרות¹⁷, כולל עקבות מתוקננת, רכיבים מודולריים ועקרונות עיצוב בעלי קוד פתוח. לפיכך, פתרונות ליישומי נישה חדשים יכולים להיות מתוכננים ללא שינויים משמעותיים במערכת. מורכב מאוד מודולרי ומקור פתוח, חומרה, אלקטרוניקה ותוכנה מבוססת-אינטרנט, החברה היא מערכת התרבות הרציפה האוטומטית הראשונה שיכולה להיות חסכונית ומוגדרת מחדש לבצע כמעט כל סוג של ניסוי צמיחה בתפוקה גבוהה. באמצעות שרוולים חכמים מודולריים וניתנים לתכנות, אשר מפעילים את כל החיישנים והמפעילים הדרושים כדי לשלוט בתרבויות בודדות, מאפשר באופן ייחודי שינוי גודל התפוקה והשליטה האישית בתנאי התרבות. כמו-כן, כפלטפורמה מבוססת-אינטרנט, מחליף נתונים ומידע עם מחשבים מרוחקים בזמן אמת, ומאפשר ניטור סימולטני של מאות תרבויות בודדות ותרבות אוטומטית רטבאליות באמצעות שליטה מוגדרת באופן שרירותי אלגוריתמים.

בעבודה הקודמת הפגינו הביצועים החזקים של המפעל בניסויים ארוכי טווח במאות שעות פעילות, וביכולתה לטפח אורגניזמים שונים, מ -E. coli ו- s. cerevisiae ס לבלתי מבויתים חיידקים. סדרה של ניסויים בבחירת גדילה ברורים בוצעו, שבו הוגדרו באופן תוכניתי מעברי בחירה רב-ממדי מוגדרים על פני מערך של תנאי תרבות בודדים, ואת נופי הכושר הסלולריים הנובעים היו כמת. כאן, המטרה היא לספק למשתמשי התוכנית תיאור של אופן השימוש במערכת לעיצוב וסוגים אלה של ניסויים. כדוגמה, שיטות לכמת את הנוף של מוטציות S. cerevisiae ס על פני מעבר משני מימדי הסביבה מורכב הטמפרטורה ואת הלחץ אוסמוטי מוצגים. הפרוטוקול מנחה את המשתמשים באמצעות קביעת התצורה של מסגרת התכנית לניסוי זה הן באופן תוכניתי, באמצעות התוכנה לקביעת שגרות מותאמות אישית של שגרת הטמפרטורה ובקרת הטמפרטורות עבור כל אחת מתוך 16 תרבויות רציפות מקבילות, ומבחינה פיזית, דרך הפריסה פלואידיקה לתוואי כראוי דיות של ריכוזי מלח שונים. פרוטוקול זה אמור לשמש כטבלת להערכת הישגים כללית לקביעת התצורה של התוכנית לביצוע מגוון רחב של ניסויים מתמשכים בתרבות הרציפה עבור מחקרים ודיסציפלינות שונות.

פרוטוקול

1. הכנת המדיה, הבקבוקונים והאינוות

הערה: פרוטוקול זה מניח שמשתמשים כבר כיילו את מערכת הניהול ומשתמשים בתצורה של שרוול חכם המתואר בעבודה קודמת¹⁶. שרוולים חכמים מחדש בקלות או משתנים, אך פרטי ההתקנה של פרמטרי העוצמה והבקרה עשויים להיות שונים עבור תצורות חלופיות.

1. יום לפני הניסוי, להכין 2 mL בתרבויות נוזלי לילה של S. cerevisiae ס BY4741 התייחסות זן וזנים variant במדיה YPD (Peptone שמרים דקסטרוז) ב 30 ° c בחממה רועדת לפחות 300 r.p.m.
2. העברת מדיה סטרילית YPD לתוך נקי, בקבוקים אוטוקלבד מצויד אבובים. לחילופין, התקשורת עשויה להיות אוטומטית ישירות בבקבוקים מראש מצויד אבובים.
   הערה: בקבוקים הם להתאים עם אבובים על ידי קידוח חור לתוך כובע ולהפעיל אבובים דרכו עם מחברים כדי לאבטח אותו במקום. ראה טבלת חומרים.
3. הוסף מהומה בר לכל בקבוקון ובורג על מכסה בקבוקון מצויד זרם ו-לוקס קשיות. ודא שכל הרכיבים נקיים באמצעות בדיקה חזותית.
4. מניחים את הבקבוקונים בארון תקשורת אוטוקלאני, מכסים בנייר כסף, ומובחנות על מחזור כבידה או ואקום עם צעד 20 דקות של עיקור.

2. הקמת ניסוי

1. בשלושה כוסות גדולות, להכין 500 mL של 10% אקונומיקה, 200 mL של 10% אקונומיקה, ו 300 mL של 70% אתנול.
2. באמצעות המתגים בהתקן הכלי, הפעל את 5 מספק הכוח של ה-V בדרך, המתן 5 שנים, ולאחר מכן הפעל את מספק הכוח החמישי.
3. אם הפעלת מספר מבחנות מאותו בקבוק מדיה, חבר קווי קלט מדיה מרובים עם מפצלי צינורות. ניתן לבנות מפצלי צינורות מותאמים אישית עם רכיבי Luer.
4. הכנס את קווי הקלט של המדיה בגביע האקונומיקה הראשון, והמדיה מתחילה להיות בתוך גביע האקונומיקה השני. הניחו את קצה הזרם של קווי הכניסה למדיה בגביע השני עם קווי האפלוקס. . הציבו את קווי הפסולת בזבל
5. הוסף 1-2 L של אקונומיקה לתוך carboy גדול ריק אשפה, אשר לעקר פסולת שנוצר במהלך הניסוי. התייעץ עם מתאם בטיחות כדי להבטיח סילוק נאות של פסולת.
6. באמצעות מסך המגע על התוכנית, לנווט אל מקטע ההתקנה, ולהפעיל את כל המשאבות עבור 20 s כדי למלא את קווי הנוזלים עם 10% אקונומיקה. בזמן הריצה, להבטיח על ידי בדיקה חזותית כי כל הקווים מולאו והמשאבות פועלים כרגיל. אפשר אקונומיקה לשבת בקווים עבור לפחות 30 דקות כדי לחטא.
7. הפעל משאבות שוב באמצעות יישום מסך מגע עד שהשורות כבר לא מתחת למים, דוחף אוויר דרך הקווים כדי לקבל כמה מלבין החוצה ככל האפשר.
8. מניחים קווי קלט מדיה בגביע האתנול וחוזרים כמו למעלה, ממלאים את הקווים באתנול ושטיפה באוויר.
   הערה: כמו אתנול הורג מהר, אין צורך לחכות 30 דקות עבור עיקור.
9. הצמד קווי קלט מדיה לבקבוקי המדיה עם מחברי Luer והפעל את המשאבות עד שהתקשורת תפעל באופן מלא דרך הקווים, ורוקן את כל האתנול שיורית.
10. הכנס באופן חלקי את הבקבוקונים לתוך השרוולים החכמים וחבר את הקווים לעמדות המתאימות, בהתאם לקידוד הצבע בקווים. התחל על-ידי הצמדת קווי קלט למקש הזרימה הקצר, ולאחר מכן פסולת קווים לקשית הארוכה.
    זהירות: קריטי לבדוק אם יש חיבורים רופפים או קווים שנותבו באופן שגוי. כישלון לעשות זאת יגרום מגולשת ועלולים לגרום נזק השרוול חכם.
11. הפעל את כל המשאבות במרווחים של 10 s כדי למלא את הבקבוקונים במדיה. להבטיח על ידי משאבות בדיקה חזותית להסיר ביעילות הסרת מדיה דרך הקשיות, כדי למנוע גולשת. אם הקשיות מופיע לא לתפקד ביעילות, לבדוק את החיבורים קו פלואידיc ואת המשאבה הפריסטלטית. תקן או החלף חלקים לפי הצורך.
12. דחפו את הבקבוקונים למטה עד. שהוא עטוף לגמרי בשרוול החכם
13. הגדר את התנאים ההתחלתיים עבור פרמטרים ניסיוניים באמצעות מסך המגע של התוכנית בעמוד ההגדרה האינטראקטיבית. עבור כל הבקבוקונים, הגדר את הטמפרטורה ל -30 ° c ומערבבים ל -10. ניתן לעשות זאת עבור כל הבקבוקונים בבת אחת על ידי גרירת אצבע על פני מסך המגע כדי לבחור את כל הבקבוקונים.

3. קביעת התצורה של תוכנת הפיתוח ושגרת התרבות האלגוריתמית

1. בלוח המחוונים של המחשב, נווט אל הדף של מנהל הניסוי. בחרו בניסוי הבסיסי בחלונית ' נווט הניסוי ' או בניסוי קיים כנקודת התחלה ולחצו על ' שיבוט חדש '.
   הערה: ניתן להשתמש בניסויים מקבוצות אחרות על ידי הדבקת הקישור GitHub לריפו שבו ההגדרה הניסיונית נשמרת לתוך מנהל הניסוי.
2. ציין את שם הניסוי ואת התקן הניהול שהניסוי יפעל עליו. ודא שהגדרות הכיול הרצויות נבחרו על-ידי שינוי שדות אלה בעמוד.
3. השתמש בבורר המבחנה ובחלוניות הגדרת הפרמטרים כדי לקבוע תנאים ניסיוניים. לדוגמה, כדי להגדיר את הטמפרטורה עבור מבחנות 0-4 עד 30 ° צ', בחר את הבקבוקונים בבורר הבקבוקון, הגדר את הגדרת הפרמטר ל-30 ולחץ על set. חזור על פעולה זו כדי להגדיר סף עליון ותחתון עבור כל בקבוקון.
4. לאחר השלמת הגדרות פרמטרים ניסיוניים, שמור את הניסוי על-ידי לחיצה על שמור ולחץ על התחל לפעול.

4. ייזום ניסוי וניטור בזמן אמת

1. לאחר שהניסוי מתנהל, נווט ללוח הנתונים בזמן אמת בלוח המחוונים האינטראקטיבי. עבור כל בקבוקון, בדוק שערכי ה-OD מחזיקים באפס, והטמפרטורות נמצאות או מתקדמות לעבר רמות מתוכנתים על-ידי עיון בגרפים.
2. כדי להכין את האירשת, למדוד את ה-OD של תרבויות לילה, לחשב את הדילול קיפול הרצוי בהנחה נפח בקבוקון של 25 מ ל, ואת הנפח המחושב מחושב של לתוך מבחנות דרך יציאת הדגימה. לדוגמה, כדי להגיע למטרה ההתחלתית הרצויה של כ 0.05 בבקבוקון התרבות מתרבויות לילה כי הם ב-OD 2.0, 625 μL של תאים יש להוסיף לכל בקבוקון.
3. בדוק את הגרפים בלוח המחוונים כדי לראות שתרשימי ה-OD עודכנו בהתאם. יש לראות בגרפים את העליה הקרובה להתחלת ההתחלה הרצויה.
4. מעקב אחר סוגי נתונים שונים (כגון OD, טמפרטורה, קצב צמיחה, דורות וצריכת מדיה) במהלך הניסוי על-ידי עיון בגרפים המתאימים בלוח המחוונים. ערכים אלה עשויים ליידע את ההחלטות הנסיוניות על-ידי המשתמש (למשל, לתזמן נקודות זמן) או אפילו להשתמש בפונקציות לביצוע משוב אוטומטי.
5. כדי להחליף בקבוקי מדיה באמצע ניסוי, השהה את הניסוי בלוח מנהל הניסוי כדי למנוע התרחשות של אירועי משאבה. להתיר במהירות את קו המדיה מהבקבוק הריק ולחבר אותו לבקבוק החדש. להימנע מלגעת בקצוות של אבובים כדי למנוע זיהום. . לחדש את הניסוי במנהל הניסוי

5. דגימת תאים שמרים מתוך הבבחנות

1. הכינו פתרון cycloheximide כדי לעכב את סינתזה החלבון ולתקן תאים שמרים עבור הניתוח cy, מנסה לזרום. בצינור 15 מ"ל, הוסף 12 מ ל של PBS ו 12 μL של 20 מ"ג/mL cycloheximide ומערבולת עבור 5 s.
2. באמצעות הצנרת רב-ערוצי, סדרת מחלקים 100 μl לתוך כל טוב של הצלחת 96-היטב עגול התחתון.
3. לעטוף את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי לחסום את האור ולשמור על 4 ° צ' עד הצורך.
4. כדי לדגום, פיפטה דרך יציאת הדגימה על מכסה הבקבוקון באמצעות אורך מורחב 200 μL טיפים.
5. פיפטה 100 μL ממבחנה לתוך באר בצלחת הקיבעון, ערבוב 2-3x על ידי ליטוף למעלה ולמטה, לאחר מכן להתאושש בנייר כסף ולהחזיר את הצלחת 4 ° c.

6. הניסוי לשבור ולנקות

1. הכינו 1 L של 10% אקונומיקה ו 2 500 mL די פתרונות מים בספלים גדולים.
2. עצור את הניסוי על-ידי שליחת הפקודה stop בלוח מנהל הניסוי. הנתונים עדיין מאוחסנים במסד הנתונים המותאם לענן הצמתים, וניתן עדיין להציגם בהמשך בלוח הנתונים בזמן אמת שבלוח המחוונים, או להוריד אותם לניתוח לא מקוון.
3. הסירו מבחנות משרוולים חכמים והניחו אותם במדף החיטוי כדי להימנע מגולשת בצעדים הבאים.
4. להתיר את קווי הקלט של התקשורת מבקבוקי המדיה ולמקם אותם בגביע של 10% אקונומיקה. הפעל משאבות מממשק המשתמש של התוכנית כמו בהתקנה כדי לעקר קווים ומבחנות.
5. נתק קווים מבקבוקונים ושורות במים של די. הפעל משאבות לשטוף את כל האקונומיקה מתוך המערכת הראשונה עם מים DI, ואז עם האוויר.
6. בטל את הדרך על-ידי החלפת הספק החשמלי של 12 המבקרים, המתנה 5 s ולאחר מכן כיבוי ה-5 מספק הכוח החמישי.
7. משרים ברים מערבבים וכובעים ב -10% אקונומיקה, ולאחר מכן לשטוף עם מים DI. להיות בטוח לשטוף את הקשיות של זרם ו-לוקס של כל כובע על ידי הפעלת מים DI דרכם. קרצוף בדיקות שימוש במברשת שפופרת בדיקה אם הסרט נוצר על קירות.
8. להיפטר פסולת כראוי ולשטוף מיכלי פסולת ביסודיות.
   זהירות: מיכלי פסולת יכיל תערובת של 10% אקונומיקה, התרבות תא מעוקר פסולת וכמויות מעקב של אתנול. התייעצו עם מתאם בטיחות לטיפול וסילוק נאות.

7. כולל כושר באמצעות זרימה Cyהתנסה לנתח אוכלוסיות חלקיות

1. לנתח דגימות שנאספו מסעיף 5 באמצעות cytometer זרימה מצויד ערוץ הזריחה המתאים גלאים¹⁶.
2. לרכוש לפחות 10,000 אירועים לכל מדגם, ושער עבור תאים שלמים באמצעות נתוני פיזור הקדמי והצד.
3. שער המבוסס על ערוץ הזריחה המתאים (g. GFP) כדי לקבוע את התפלגות השבר של כל אוכלוסיה.
4. במחשב, שמור נתונים למיקום הרצוי מהעמוד ' מנהל הניסויים ' על-ידי לחיצה על לחצן "ייצוא".
5. מקבצי הנתונים של הקובץ, קבע את מספר הדורות שהושלמו בכל נקודת זמן עבור כל בקבוקון. בקוד ההתפתחות, הדורות מחושבים באופן ראשוני את נתוני ה-OD בין כל אירוע דילול, ולאחר מכן כל פלח מתאים למעריך בסיסי של הטופס לכל פלח, מניב r, שיעור הצמיחה¹⁶. לאחר מכן, מספר הדורות במהלך תקופת זמן מחושב באמצעות הנוסחה הבאה:
   
6. מתווה את יחס היומן של האוכלוסיות המסומנות בתוויות ובלתי מסומנות מתוך הזרימה cy, try data vs מספר הדור מתוך החישובים הנ ל בדגימות הזמן נלקחו. זהה את האזור הליניארי והתאם את השיפוע בהתאם למשוואה הבאה. מדרון זה מוגדר בדרך כלל ככושר תחרותי^18,19.
   

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן שימש כדי לבנות מפות כושר עבור גרסאות גנטיות של S. cerevisiae ס על פני מעבר לחץ דו מימדי של טמפרטורה ומליחות. באופן ספציפי, עבור כל זן משתנה, השתמשנו באפשרות הארגון לבצע ניסויים זיווגים התחרות נגד מאמץ התייחסותfluorescsiae (שBY4741 מאמץ משולב עם כתב מסוים בחוקה כתבת ירוק) ב 16 שונים צירופים של מלחצים אלה (איור 1). עבור משתנים, שני זנים הנוקאאוט נבחרו כל ניבא להיות רגיש לאחד צירי מצב הלחץ: ΔPRX1 אשר דווח כי יש פגמים כושר בטמפרטורות גבוהות²⁰ ו ΔPBS2 עם מומים כושר ברמה גבוהה ריכוזי מלח²¹. כמשתנה בקרה, נעשה שימוש בנבג BY4741 מסוג פראי ללא תווית, שצפוי להופיע באופן דומה לנבג הייחוס. בסך הכל, ניסויים אלה ב3 72 בשעות היום נערכו בו ב-48 בבקבוקונים על פני שלושה מתקני הרובר (16 בקבוקון) הפועלים ממחשב יחיד.

לוח המחוונים האינטראקטיבי של התהליך משמש לניווט בכמות הנתונים הגדולה שנוצרת במהלך כל ניסוי (איור 2A). באיור 2Bמופיעים עקבות מייצגים של כל 16 הבקבוקונים של מכשיר מעבר אחד. כל מעקב מציג תבנית מסורבית אופיינית מאלגוריתם הבקרה turbidostat, אשר משתמש משוב על OD כדי להפעיל מדלל ולשמור על תרבויות בטווח צפיפות צרה (0.2-0.3 במקרה זה). נתוני ה-OD והטמפרטורה נמדדים באופן רציף, מוזרמים למסד הנתונים המותאם לענן צמתים ומעודכן בזמן אמת בלוח המחוונים האינטראקטיבי של האתר. החל מזרם נתונים, מדדים בסדר גבוה יותר (למשל, שיעור צמיחה, דורות מצטברים) ניתן לחשב ולהתוות בלוח המחוונים (איור 2C) ואפילו לשמש כפרמטרי משוב בערכות בחירה שונות (למשל, morbidostat).

כדי ליצור מפות כושר, אנו מודדים את הקצב בו המתח התייחסות מתחרה את הזן משתנה על ידי שילוב שתי מדידות cy, לנסות הזרימה ונתונים הצמיחה התפתחות. באופן ספציפי, שברים באוכלוסיה מחושבים כיחס היומן של מאמץ משתנה על פני מאמץ התייחסות באמצעות cy, הזרמת נתונים מכל מדגם של נקודת זמן. עבור כל תרבות ונקודת זמן, מספר הדורות שחלף מגיע לאינטרפולציה מנתוני קצב הצמיחה של התפתחות בכל תקופת דילול. התוויית יחסי היומן על הדורות, הבדלים איכותניים בין התנאים מתחילים לצוץ (איור 3A). כדי לחשב את הכושר, מדרון מתאים לחלק הליניארי של כל חלקה^18,19, מניב ערך כמותי (עם השלט והתעריף) המתאר כיצד הנבג זן מתחרה נגד זן הייחוס ( איור 3 ב). בניסוי זה, ערכי כושר שליליים עולה כי הזן משתנה מתחרה על ידי מאמץ ההפניה. בניית מפות החום מכל חישובי הכושר מאפשרת ויזואליזציה של נוף דו מימדי כושר, חשיפת הבדלים כמותיים עדינים בביצועים בין זנים ומצבים (איור 3C).

מתוך מפות הכושר, אנו רואים שכל אחד מהזנים מציג פגמים בכושר המניפסט בדרכים שונות. ΔPRX1 הוא רגיש בעיקר לטמפרטורות גבוהות, אבל הלחץ מלח נראה השפעה מתוסף, הגדלת מום הכושר. לעומת זאת, ΔPBS2 מראה פגמים בכושר בעיקר בתגובה לריכוזים גבוהים של מלח, עם הבדלים מינימליים לאורך ציר הטמפרטורה. תוצאות אלה מדגישות את השירות של ניסויים בבחירה ברזולוציה גבוהה במיוחד לפענוח אינטראקציות של מספר מחצים סביבתיים, אשר יכול להיות תוסף, סינגיסטי או אפקטים אפיסטטיים.

לבסוף, חשוב לציין כי במקרים מסוימים, במיוחד למצבי לחץ חמורים, חישובי כושר עלולים להוביל לתוצאות מוגזמות או מוטות. לדוגמה, ΔPBS2 נראה להראות מדרון חיובי תלול במצב 39 ° c/1 M היום ביחס למתח ההפניה (איור 3a). זה מיוחס לצמיחה ירודה של שני זנים, אשר משתקף בנתונים סוג פראי ומגביל את השירות של מדד מסוים זה במצב זה. מספר מספיק של דורות תוצאות 1) הפרדה עלובה של נקודות זמן אשר מפריעה עם התאמת מדרון, ו 2) רגישות להשפעות סטוכסטיים שמקורם שלב השהיה. בעוד לא בחרו לעשות זאת במחקר זה, הנתונים הצמיחה בזמן אמת שנאספו על ידי התפתחות במהלך הניסוי היה יכול לשמש כדי ליידע את ההחלטה להאריך את הניסוי ולאסוף נקודות זמן נוספות עבור מצב זה עם מעט מאמץ. בניסויי מעקב, יחסי התחלתי יכולים גם להיות מאופנן כדי להאריך את אורך האזור הליניארי לפני שהרוויה מתרחשת.

איור 1: מבט כולל על מסגרת הפיתוח והתכנון הניסיוני. (א) הינה פלטפורמה אוטומטית ורציפה לתרבות המאפשרת שליטה מרובת פרמטרים בתנאי התרבות. הפלטפורמה כוללת שרוולים חכמים, אשר הבית החיישנים ומפעילים לשליטה בתנאי התרבות, מערך משאבה פריסטלטי עבור מדיה זורמת ופסולת של התרבויות, מסך מגע לאינטראקציה ידנית עם המכשיר, ומחשב שמשת לאינטראקציה עם תשתית הענן שבה נתונים מהפלטפורמה מוזרמים. (ב) ניתן לקבוע את התצורה בדרכים מרובות: פיזית, באמצעות כניסות תאים ומדיה, ובאופן תוכניתי על-ידי התאמת האלגוריתמים השולטים במודולים של בקבוקון תרבותי שרוול חכם. זה יכול להיות מנוצל לתוכנית בחירה רב מימדית/סביבתי מעברי ברזולוציה גבוהה, עם תפוקות המורכב תאים שנאספו פיזית בנקודות זמן מוגדרות בזמן אמת הזרמה של נתוני התרבות. (ג) הגדרת ההתפתחות לערוך ניסוי כושר גדילה על פני הדרגתי בחירה דו מימדית, המורכב מטמפרטורה ומאוסמוטי לחץ. מבחנות התרבות של החברה הופרה בפרופורציות שוות של התייחסות ושמרים משתנה. שגרת turbidostat תוכננה לשמור את כל התרבויות בשלב מעריכי בחלון OD מוגדר (OD 0.2-0.3). הטמפרטורה ותנאי התקשורת היו מגוונים לאורך המערך שרוול חכם כדי ליצור שני מעברי לחץ עצמאיים. מדיית הבסיס הייתה מורכבת מ-YPD (2% גלוקוז) + 100 μg/mL carbenicillin + 25 μg/mL כלורמפנול כאמצעי זהירות כנגד זיהום חיידקי. קומפוזיציות מדיה היו מגוונות על ידי הוספת משלים משלימים ל -0 מ ', 0.6 M, 0.8 M, או 1.0 M. בבקבוקון הטמפרטורות תוכנתו לאחד מארבעה ערכים: 30 ° c, 35 ° c, 37 ° c, או 39 ° c. (ד) דוגמאות לתפוקה גולמית עבור התרבות OD ושברי האוכלוסיה משלושה תנאים שנבדקו. ניסוי התחרות נשמר ל72 h, הדגימה 24 שעות ולאחר מכן כל 12 שעות עד לסיום הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: לוח מחוונים לניתוח נתונים בזמן אמת. (א) נתוני היישום מעובדים ומוזרמים בזמן אמת באמצעות תוכנה המבוססת על ענן צמתים ללוח מחוונים אינטראקטיבי. באמצעות לוח המחוונים, משתמשים יכולים להגדיר וליזום שגרת התרבות שלהם על מערכת הפעלה מחוברת, לנטר את הניסויים הפועלים כעת על פני כל יחידות המעבר, ולשנות את התנאים הניסיוניים באופן ידני על בקבוקון בודד או קבוצה של מבחנות במידת הצורך. (ב) עקבות עבור כל בקבוקון על פני מטריצת התנאים שנבדקו למשך הניסוי כולו. ניתן להציג רשמים בזמן אמת כדי לוודא שהניסוי פועל כנדרש ובשימוש לאחר ניסוי לצורך ניתוח נוסף. (ג) קצבי הצמיחה והדורות הסלולריים יכולים להיות מחושבים מעקבות ה-OD בטיסה כדי לעקוב אחר התקדמות הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: בניית משטחי כושר. (A) שברים של האוכלוסייה הטבעיתיומן הרישום (זן משתנה/הפניה זן) מותווים נגד דורות התאים. ' צבע ' מציין את טמפרטורת הבחירה בזמן שמקפים מבדילים בין ריכוזי המלח. (ב) לכמת את הכושר היחסי של המשתנה למתח ההתייחסות, מדד כושר נגזר מקצב שבו שבר האוכלוסייה התאית משתנה לאורך דורות. מדד זה מחושב מתוך האזור הליניארי של מגרשים השבר הסלולרי באמצעות מינימום של שלוש נקודות. (ג) מדדי הכושר היחסיים מוצגים במפת החום כדי לבנות משטח כושר על מעברי הלחץ הסביבתיים. מצב הפינה הימנית העליונה (39 ° צ'/1.0 M) עבור סוג פראי ו ΔPBS2 אינם כלולים בניתוח זה כאשר התרבויות עברו מספיק דורות (ראה תוצאות מייצגים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

בחירת גדילה היא כלי הכרחי בביולוגיה, המשמש באופן נרחב כדי ליצור ולאפיין הבדלים פנותאריים בין אוכלוסיות סלולריות. בעוד תרבויות אצווה לאפשר בחירת גדילה באופן מוגבל, טכניקות תרבות רציפה להרחיב באופן דרמטי את מידת השליטה ואת החיזוי של ניסויים אלה, על ידי הפעלת רגולציה מדויקת על הטופס ודינמיקה של בחירה כדי ליצור לשחזור, תוצאות כמותי²². תרבות רציפה הועסק בחירת בקרת בקפדנות עבור ספריות מגוון גבוה^20,23,24,25, וליישם משטרים גמישים מתוחכמים בניסויים ו . אבולוציה מכוונת,¹¹,^12,26,27 התרבות המתמשכת גם מאפשרת אפיון מדויק של תאים על פני מערך של תנאים מבוקרים לכמת כדי להבין טוב יותר מערכות גנטיות מורכבות ולייעל הנדסה ביורוביזציה זנים^{9,14 ,} . ^עשריםושמונה

עם זאת, אין פרוטוקול אוניברסלי לתרבות רציפה, כמו שינויים עדינים התנאים סלקטיבי יכול להוביל שינויים דרמטיים בתוצאות ביולוגיות^4,29,30. על הניסויים להיות מסוגלים לבחור בין משטרי בחירה ולהתאים את הפרוטוקולים והציוד הנסיוני בהתאם. בנוסף להצעת בחירה בין פרמטרים לבקרה, מערכות כאלה יהיו מתוחכמות מספיק כדי לנהל באופן עצמאי מספר פרמטרים בו בניסויים מקבילים מאוד הדרושים כדי לפענח תשומות לאינטראקציה במתחם מערכות ביולוגיות (כגון אפיסטזיס). התוכנית מטפלת באתגר זה בכך שהיא מאפשרת למשתמשים לבחור באופן שרירותי בבקרת משוב בין תנאי תרבות לבין פונקציות פלואידיc כדי לציין נישות סביבתיות מיוחדות במיוחד.

כדי להתגבר על המגבלות של ההתקנה הנוכחית ולהרחיב או לשנות את פרמטרי השליטה, השרוול החכם יכול בקלות להיות מחדש כדי להוסיף חיישנים חדשים או מפעילים. בנוסף, הפחתת נפח המבחנה תקטין הוצאות מדיה, שיכולות להיות משמעותיות בתרבות רציפה. בעוד העיצוב הנוכחי מאפשר מדידה ושליטה של טמפרטורה, התרבות עצבנות, אינדוקציה אור, העכירות, ו פלואידיקה, פרמטרים אחרים יש למדוד חיצונית על ידי דגימה מן הבקבוקונים. העבודה הנוכחית כוללת שילוב היכולת לנטר פעילות אנזימטית באמצעות לוציפראז ולווסת את החמצן ו-pH המומסים ישירות בתרבויות הדרך. בנוסף, בעוד לא הפגינו בעבודה זו, הדרך יכולה להיות ממשק עם ריבוב הרומן מיליפלוג מכשירים¹⁶ כי לצייר על עקרונות של אינטגרציה בקנה מידה גדול (שמקורם אלקטרוניקה ואימץ על ידי microfluidics) כדי ל ביוקר לאפשר טיפול בפלואידיג מורכבים יותר (לדוגמה, כניסות פלואידיסי, העברות בקבוקון-עד-בקבוקון). מודולים אלה מודול עשוי להיות מעוצב ומיוצר לחלוטין במעבדה, ומאפשר למשתמשים לנתב נוזלים על ידי הגשמה באופן תיכנותי שילובים שונים של שסתומים ברוטינות פלואידים אוטומטית. זה מאפשר למשתמשים להתגבר על עיצובים פלואידים נוקשה המשמשים באופן מסורתי בתרבות רציפה, אבל גם בקנה מידה יכולות פלואידיc כדי תפוקה גבוהה עם מספר קטן יותר של רכיבי בקרה יקרים (למשל, משאבות פריסטלטיות). לבסוף, אנו מקווים לשלב פלטפורמת דגימה אוטומטית אשר לנצל אלה מיליפלואידיקה ו-DIY רכיבים, התגברות על המגבלה של אינטראקציה ידנית במהלך ניסויים ארוכים יותר, שבו תרבויות דגימה יהיה מסורבל.

בנוסף לשינויים פיזיים בפלטפורמה, התוכנה מבוססת-האינטרנט פותחת דרגות חופש חדשות על-ידי מתן אפשרות למשתמשים לכתוב, לערוך ולשתף סקריפטים מותאמים אישית של התוכנית, ליצור אוטומטית תוכניות ליצירת משוב, לדוגמה, ליישומי תרבות (למשל, turbidostat). משתמשים יכולים לטאטא באופן תוכניתי בין טווחי פרמטרים בווריאציות עדינות על אותה ערכת בחירה או לחבר אלגוריתמי בקרה בצירופים חדשניים כדי לציין מספר כלשהו של ערכות בחירה מתוחכמות. יתר על כן, היכולת לפקח בקלות על תרבויות בזמן אמת הופך את הדרך שבה ניסויים מתנהלים. עם ניטור בזמן אמת, משתמשים יכולים 1) לבדוק את העקביות בין הריצות, תכונה קריטית עבור יישומים ביוביודויון וניסויים בתפוקה גבוהה, ו 2) להתערב במהלך ניסויים אם יש צורך, כדי לפתור זנים מאתגרת המוצג צמיחה ירודה או היווצרות המבנה, או לאבחן שגיאות משתמש (למשל, זיהום). לבסוף, עם מספר זרמי נתונים שנאספים ומפורשים בזמן אמת עבור כל תרבות בודדת, מייצרת החברה צפיפות גבוהה של נתונים, העשויה להקל על גישות הלמידה של המחשב לניתוח הזרם.

מעבר להדגים שימושים באפיון כושר, בחירת ספריות והתפתחות מעבדה, אנו רואים מספר שדות קשורים בשלים למימוש בהתפתחות עם פלואידיקה משולבת. הניסויים הרוחיים עם דגימות microbiome יכול לאשר את יציבות הקהילה בסביבות מבוקרת^31,32, לחקור הרכב microbiome באמצעות שיטות ומינים של החברה³³, או מיני לערבב באופן דינאמי כדי ל לחקור דינמיקה אקולוגית של הקולוניזציה או הפלישה^34,35. שיטות רבות עבור האבולוציה מכוונת רציפה של biomolecules יכול בקלות להיות מיושם על המכשיר כמו גם^26,36,37, מאוד הגדלת נגישות ותפוקה של מערכות אלה. היכולת לייעל את התנאים הגוברת כגון הרכב המדיה, טמפרטורה, וזנים דינמי, תפוקה גבוהה הטבע יכול לסייע במאמצי אופטימיזציה עבור יישומים ביואנויום התעשייה⁹. אנו מאחרים לדמיין באופן אנכי שילוב התפתחות עם טכניקות ניתוח אחרות כגון מיקרוסקופ וזרימה cy, לולאה באופנה הלולאה הסגורה, מתן מערכת אוטומטית לחלוטין לצמיחה וניתוח של תרבויות סלולר בשני תאים ואוכלוסייה אחת רמות. יתר על כן, עם כמה שינויים בחומרה לשרוול חכם, כגון איטום כלי הקיבול ושליטה בתכולת הגז, ניתן להתאים את ההתפתחות לצמיחה של מגוון רחב יותר של סוגי תאים, כגון תאי היונקים ההשעיה. זה גם אפשרי למקם את המסגרת כולה לתוך תא אנאירובי עבור תרבות התא אנאירובית. במבט קדימה, אנו מכוונים לבנות את מסגרת התוכנה שלנו לתוך תשתית ענן מרוכזת ולהאמין שזה יאפשר למשתמשים בקלות להגדיר, לנתח, ולשתף את הנתונים שלהם מרחוק ללא צורך להיות נוכח פיזית במעבדה. מתפקד כאוצר נתונים, תשתית ענן גם להשאיל את עצמה בקנה מידה גדול המטא ניתוח ברחבי ניסויים. אנו מצפים כי ההתפתחות וההתקדמות העתידית הזאת תרחיב במידה ניכרת את היקף הניסויים האפשריים של בחירת הגדילה על ידי הקלה על אוטומציה וחדשנות בתרבות המתמשכת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5 ליטר פלסטיק Hedpack עם כובע	לבישול וייצור יין במערב התיכון	45-56Y8-E2FR	לאיסוף פסולת
A-D(+)-גלוקוז	Chem-Impex	00805	עבור YPD בינוני
Attune NxT Autosampler	Thermo Fisher		מאפשר לזרימה ציטומטר להריץ דגימות מ-96 באר
צלחת Attune NxT זרימה ציטומטר	תרמו פישר		משמש לקביעת שברי אוכלוסייה באמצעות פלואורסence תא יחיד
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-07-0	עבור YPD בינוני
קרבניצילין	פישר	Scientific BP2648250	עבור YPD מחבר
טי התאמת צינור דוקרני עמיד בפני כימיקלים בינוניים, עבור מזהה צינור 1/8 אינץ', 250° F טמפרטורה מקסימלית	McMaster- Carr	5121K731	להסתעפות קלט מדיה
Chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	עבור YPD Medium
CLOROX GERMICIDAL Bleach 8.25	Fisher Scientific	50371500	לעיקור קווים נוזליים
מכסה בקבוקון eVOLVER מותאם אישית	למכסה FynchBio		יש יציאות לדגימה וקלט/פלט
נוזליCycloheximide	Fisher Scientific	ICN10018301	ללוחות דגימת זרימה ציטומטרית
אתנול, נטול מים (היסטולוגי)	Fisher Scientific	A405P-4	לעיקור קווים נוזליים
יחידת eVOLVER	FynchBio
Fisherbrand טיפים באורך מורחב (הרמה ממתלה; 1 עד 200 ul)	פישר סיינטיפיק	02-681-420	לדגימת בקבוקון
פישרברנד אוקטגון ספינבר מוטות ערבוב מגנטיים	פישר סיינטיפיק	14-513-57	קוטר: 4.5 מ"מ, אורך, 12 מ"מ
פישרברנד בקבוקי מדיה מזכוכית לשימוש חוזר עם כובע	פישר סיינטיפיק	FB8002000	חייב להיות מצויד בצינורות
צינורות גומי סיליקון בטמפרטורה גבוהה חצי שקוף לבן, דורומטר 70A, 1/8 אינץ' ID, 1/4 אינץ' OD	McMaster- Carr	51135K73	לבקבוקי מדיה
Mac מיני	אפל		להפעלת הניסוי/איסוף נתונים
פוספט חוצץ מלח (PBS)	Fisher Scientific	BP243820	ללוחות דגימת זרימה ציטומטריה
פיפטות	אפנדורף
פלסטיק צימוד צינור סיבוב מהיר, תקעים, עבור מזהה צינור דוקרני בגודל 1/16 אינץ', פוליפרופילן	מקמאסטר- Carr	51525K141	לבקבוקי מדיה
צימוד צינורות סיבוב מהיר מפלסטיק, תקעים, עבור מזהה צינור דוקרני בגודל 5/32 אינץ', פוליפרופילן	מקמאסטר- Carr	51525K144	לבקבוקי מדיה
צימוד צינורות סיבוב מהיר מפלסטיק, שקעים, עבור מזהה צינור דוקרני בגודל 1/16 אינץ', פוליפרופילן	מקמאסטר- Carr	51525K291	לבקבוקי מדיה
צימוד צינור סיבוב מהיר מפלסטיק, שקעים, עבור מזהה צינור דוקרני בגודל 5/32 אינץ', פוליפרופילן	מקמאסטר- Carr	51525K294	למדיה בקבוקים
מכסי בורג, חלק עליון פתוח, עם מחיצות סיליקון מול PTFE, מעבדה-PAC, מחיצה. גודל חוט בורג: 24-400, GREEN	Chemglass	CG-4910-04	בקבוקוני תרבית
נתרן כלורי (NaCl)	Fsher Scientific	S271-3	עבור YPD בינוני
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader	התקנים		למדידת OD600 של תרביות תאים בלילה
בקבוקון בלבד, מדגם, 40 מ"ל, שקוף, 28 מ"מ x95 מ"מ, GPI 24-400	Chemglass	CG-4902-08	בקבוקוני תרבית
תמצית שמרים	פישר מדעי	BP1422-500	עבור YPD בינוני