שמתואר כאן הוא פרוטוקול עבור חיסונית ישירה של מיותטיות של מיוכי שרירים סעיפים. התאים הנקרוסטיים הם חדירות לחלבונים בסרום, לרבות חיסוני G (IgG). חשיפת ספיגת IgG על ידי מיותסיבים מאפשר זיהוי וקוונפיקציה של מיותסיבים שעוברים נמק ללא קשר למצב שריר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
נמק של סיבי שריר (מצוי) ממלא תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מספר מצבים שרירים, כולל dystrophies שרירים. האפשרויות הטיפוליות המתייחסות לגורמים שרירי ניוון שרירים צפויים להקל על ניוון שרירים. לכן, שיטה לקיים ולכמת את היקף מוות התאים בביופסיה שרירים נדרשת. שיטות קונבנציונליות להתבונן ניוון מיוכי באתרו הם או כמותיים גרוע או להסתמך על הזרקת של צבעים חיוניים. במאמר זה, פרוטוקול immunofluorescence מתואר כי כתמי נמק מיותמים על ידי מיקוד חיסוני G (IgG) ספיגה של סיבים מיומים. שיטת ספיגה IgG מבוססת על תכונות תא המאפיינים את מותו נמק, כולל 1) אובדן של שלמות קרום הפלזמה עם שחרורו של דפוסי נזק מולקולרי הקשורים ו 2) ספיגת חלבונים פלטיים. ב צולבות מוריין סעיפים, שיתוף החיסונית של מיוסים של סיבים מיותאיים, מטריקס חלבונים, ועכבר IgG מאפשר זיהוי נקי וברור של סיבים מיוטיים עם גורל נקרוטי. שיטה פשוטה זו מתאימה לניתוח כמותי וישימה לכל המינים, כולל דגימות אנושיות, ואינה דורשת הזרקה של צבע חיוני. את הצביעת של הסיבים נמק על ידי ספיגת IgG ניתן גם לזווג עם שיתוף החיסונית אחרים.
מבוא
שריר השלד הסטרינטי מורכב בעיקר מסיבי שריר (מיוסיבים), האחראים על התפקוד הרצוני האופייני. תאים אלה הם מבנים שלאחר הmitotic, התומכים בלחץ מכני המתרחשים במהלך התכווצות. יציבות מבנית של קרום מיוסיבי (sarcolemma) ומטריצה החילוץ שלה חיוניים הומאוסטזיס רקמות. תאי לווין מהווים את האוכלוסייה הראשית של שריר השריר בשריר השלד הבוגר וקיים במצב שקט יותר בשרירים בריאים. בעקבות מוות מיוסיבי, התחדשות שרירים נתמכת על ידי תאי לווין בעקבות תוכנית מיוגניים המערבת תא לווין הפעלה, התפשטות, בידול, והיתוך כדי בסופו של דבר הטופס החדש ביותר מיוקלסין סיבים.
מיומות מוות יכול להתרחש בתנאים שרירים מרובים, כולל טראומה מכנית, איסכמיה-reperfusion פציעות, או dystrophies שרירי, והוא משויך הורפולוגיה נקרוטית של תאים מתים1,2. מוות נקרוטי מאופיין חדירות מהירה של קרום הפלזמה ושחרורו של תוכן התא בתא החילוץ3. זה יכול לנבוע מתהליך בלתי מוסדר מעורבים לא האיתות התא הנכון (כלומר, נמק בשוגג), או מסלול תאיים מאורגן (כלומר, נמק מוסדר). ב סיבים מיואלה, הן מוסדרים4 ו לא מוסדר5 תהליכים יכולים להוביל נמק. תוצאה אופיינית של הבוליזיס היא שחרור של דפוסי מולקולה הקשורים נזק, הפעלת תגובה דלקתית רבת עוצמה6. הנוכחות של מקרופאגים הוא נצפתה סביב 48 h ו 72 h לאחר הפציעה7. מלבד תפקידם בסיווג של פסולת נמק, הם חשובים גם התחדשות שרירים8,9.
Dystrophies שרירים (MDs) הם קבוצה הטרוגנית של פתווגיות אשר לעתים קרובות תוצאה של פגם במבנה sarcolemma. ניוון שרירים duchenne (DMD) הוא מחלה הקשורה לקטינים X המשפיעים על כ 1 מתוך כל 3,500 זכר לידות ברחבי העולם10, וזה נגרם על ידי היעדר הביטוי הדיסטרופין בsarcolemma. ניוון כרוני של רקמת השריר בילדי DMD מוביל לחולשת שרירים קיצונית ותמותה מוקדמת. דלקת כתוצאה ממוות נקרוטי מגביר את הרעילות, ומקדם פיברוזיס שרירים ואובדן של תפקוד השריר11,12. טיפולים כיום בניסויים קליניים מיקוד השורשים של הפרעות ניווניות שרירים, כגון ריפוי גנטי, צפויים להקל על התרופות. טכניקות פשוטות כדי בדיוק לכמת ניוון שרירים הם נדרשים לכן.
מספר שיטות משמשות באופן שגרתי כדי לפקח על אובדן מיוסיבי בvivo. המדידה של הפעילות האנזימטית של קריאטין קינאז (CK) בדם מאפשרת כימות אמין של נמק מתמשך ברקמות השריר והלב. באתרו, haematoxylin ו אאוזין (H & E) כתמים היא השיטה הפופולרית ביותר כיום בשימוש באבחון להעריך ניוון-התחדשות שיפוץ. עם זאת, הבסיס המולקולרי של התוויות H & E של תאים מתים נשאר ברור. יתר על כן, שינויים צבע להציע מוות מיוסיבי ב H & E כתמים הם עדינים יחסית לא להקל על כימות אמין והזדהות. שיטות חשיפת הפיצול DNA, כגון הטרמינל deoxynucleotidyl מעביר dUTP לסיים את התוויות (TUNEL), באופן מושלם התווית נמק מוות3. הם גם מותאמים בצורה גרועה כדי לפקח על מותם של התאים הסינציוניים כגון סיבים מיועם. הזרקה של צבעים חיוניים, כגון הצבע הכחול של אוון (EBD), מייצגת חלופה שימושית להערכת סיבים מיומיים שאיבדו את השלמות של sarcolemma, אבל הוא לא בהכרח נוח בכמה פרוטוקולים ניסיוניים. למשל, הנוכחות של EBD בדגימות דם יכולה להשפיע על תוצאות של מדידות CK, שיטת צביעה במדד. יתר על כן, ספיגת תאיים של EBD הופך שיתוף immunolabelling מאתגרת. לכן, שיטה חלופית המאפשרת תיוג ישיר של סיבים מיוים שעוברים נמק הוא עניין.
המנגנון של פעולה של צבעים חיוניים מסתמך על אובדן של שלמות הממברנה פלזמה ב נמק מיוטיות ואת ספיגת פסיבי של הצבע המוזרק. באופן דומה, נמק מיוכי סיבים לספיגת חלבונים בדם כגון אלבומין, אשר ebd יש זיקה חזקה13,14, אימונוגלובולין G (igg), ו-igg15. הנוכחות החריגה של חלבונים בדם בתוך מיוסיבים ולכן מייצגת סמנים נוחים ליוווליזיס באתרו. צביעת חלבונים אלה יכולה להיות חלופה לשימוש בצבעים חיוניים.
באמצעות ספיגת IgG כסמן של מצוי באתרו, פרוטוקול זה משמש כדי להעריך ניוון שרירים בחלק הקדמי הפיזי (TA) של עכבר mdx הדיסטרופין לקוי. שיטה זו מציגה יתרונות משמעותיים על-פני טכניקות חלופיות: 1) היא מהווה הוצאה לדרך ופשוטה בביצועה; 2) זה לא דורש שום טיפול בעלי חיים לפני איסוף שרירים, כגון הזרקה של במחזור צבעים חיוניים, ו 3) כמו החיסונית המקובלת כל, הוא תואם עם תוויות שכונתיות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הניסויים נערכו בהתאם לחקיקה הצרפתית והאירופית (רישיון מספר 11-00010).
1. הכנת מסטיק טרגלואקנט
- בגביע הזכוכית, מתמוסס 6 גר' אבקת tragacanth ב 100 מ ל של מים מוהים. מכסים עם נייר כסף ולהשאיר לפחות 3 h. מדי פעם מערבבים באופן ידני עם מרית מתכת כמו התערובת במהירות הופך צמיגה.
- השאירו את תערובת הטראגלונט ב-60 ° c ללילה באמבט מים או בתנור. אטום בזהירות את הגביע כדי למנוע ייבוש. מערבבים לפחות פעם אחת לפני הציטוט.
- מחלקים ומאחסנים ב-4 ° צ' עד שבועיים.
2. אוסף שרירים
הערה: לניסוי זה, עכבר mdx זכר בן 4 שבועות הוקרב על ידי פריקת צוואר הרחם. הליך זה אינו דורש אלחוש והוא שיטת הרג הומאנית בהתאם לחקיקה המקומית.
- חיתוך של השריר החישורי הקדמי (TA)
- לאחר גילוח רגל העכבר, להניח את העכבר על גבו ולהצמיד את הרגליים על corkboard עם מחטים. באמצעות מספריים דיוק (או אזמל) ו מלקחיים, להסיר את העור הרגל מהרגל עד הברך כדי לחשוף את כל אורכו של השוקה ו-TA.
- עם מספריים, עשו חתך בין. השוקה לבין הת זה יהיה להקל על הפרדת ה-TA מן העצם ולספק אחיזה קלה לאפאיסיום. באמצעות מלקחיים דיוק, להסיר בזהירות את שכבת epimysium מהמשטח של ה-TA.
הערה: משלב זה, ת א עשויה להיות רגישה יותר לייבוש, שיש להימנע ממנה. - באזור הקרסול, לבודד את גיד ה-TA מגידים אחרים עם מלקחיים. בעדינות למשוך את גיד ה-TA כדי לבודד אותו מן השוקה ואת השרירים שמסביב.
- כאשר בטן ה-TA מופרדת לחלוטין, החזיקו את הגיד למעלה כך שרק החלק הטוב ביותר של שריר ה-TA מוצמד לברך. לחתוך בעדינות את הגיד הקרוב. ביותר האפשרי לעצם הברך
- מניחים את ה-TA ב גזה כי היא לחה בקלות עם תמיסת מלח כדי למנוע ייבוש לפני הקפאת השריר.
- טרום קריר 70-100 מ ל של איזופנטאן בתוך בגביע פלסטיק או פוליארבאואתילן על ידי טבילה חלקית אותו לתוך חנקן נוזלי. אפשר לו להתקרר עד שאיזופנטאן בתחתית הגביע הופכת להיות מוצק לבן.
- על קטע עגול של פקק (20 מ"מ x 11 מ"מ x 8 מ"מ), מקום ~ 0.5 mL של מסטיק tragacanth. בזהירות מראש לתייג את הצד השני של הפקק, כך ביופסיה יכול להיות מזוהה כראוי לאחר שלב ההקפאה.
- להטביע את ה-TA לתוך המסטיק עם מלקחיים, גיד המרוחק למעלה. כדי לאפשר חלקים החוצה המתאימים של השריר, להחזיק את השריר עם הציר שלה בניצב למשטח השעם. האיכות של הקריודורים ישתפר אם הביופסיה לא לגמרי מוטבע לתוך המסטיק. אפשר לפחות לחצי של ה-TA (צד גיד) להיות נחשף על ידי המסטיק.
- טבול במהירות את הפקק עם השריר המוטבע בשכבת האיזופנטאן הקפואה והקרה. שימו לב שהפקק צף באיזופנטאן הנוזלי. להחזיק את המדגם הפוך כמו השריר צריך להיות טבל לתוך איזופנטאן. השאירו את הדגימות באיזופנטאן למשך כ 2 דקות כדי לאפשר קיפאון מוחלט.
הערה: משלב זה, על ה-TA להישאר קפואה עד להקפאה. אחסן את השריר בקרח יבש לפני אחסון לטווח ארוך ב-80 מקפיא ° c.
3. קריוסיס1
- הגדר את טמפרטורת הקריוסטט ב-25 ° c. שמור על טמפרטורת האובייקט בסביבות-20 ° c. תקן את האובייקט בקריוסטט באמצעות טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). לקצץ את השריר עד להגיע לבטן השריר ואז לחתוך 7 על 10 יקרומטר סעיפים.
הערה: ייצוב טמפרטורת האובייקט דורש לפחות 10 דקות. - שמרו על שקופיות זכוכית המשמשות לאיסוף חלקי קריובטמפרטורת החדר (RT). אסוף לפחות שני מקטעים בכל שקופית. קטעי שריר באופן אוטומטי לדבוק ולהפשיר על המגע של שקופית זכוכית חמה. הסר את השקופית ושמור אותה ב-RT.
- אפשר למקטעים להתייבש לפחות 20 דקות ב-RT בסביבה מאוורר.
- אחסן את מקטעי ההקפאה על שקופיות זכוכית ב--80 ° צ' עד השימוש.
4. אימונוולבלינג
- הפשרת שקופיות ב-RT למשך 15 דקות לפחות בסביבה מאוורר.
- מהתוות את אזור המקטעים עם עט הידרופובי. . הניחו למכשול ההידרופובי להתייבש
- לתקן את הרקמה עם 2% פאראמפורמלדהיד במשך 10 דקות בחדר לח.
- שטוף את הסעיפים עם תמיסת מלח באגירה מפוספז (PBS) 2x עבור 5 דקות כל אחד.
- חסום את סעיפים שריר עם סרום עז 10% מדולל ב-PBS עבור 1 h ב RT בחדר לח.
- מודלת את הסעיפים 2 h ב RT (או לילה ב 4 ° c) בחדר לח עם הנוגדנים העיקריים מדולל בסרום עז 5%. לקבלת התיוג הפשוט של ספיגת IgG בסיבים מיוגית, רק מקטעי הדגירה עם נוגדנים לעכבר פאן-למינציה.
הערה: אנטיגנים אחרים של מטריצה החילוץ יכול להיות ממוקד כל עוד הם מספקים תוויות ברורות של המטריצה המקיפה של מטריצה של סיבים. סמנים להתחדשות שרירים, דלקת, או פרמטרים אחרים ניתן לשלב כל עוד הנוגדנים לא מורמות מארח העכבר. המיקרוסקופ המשמש לניתוח צריך לכלול צבע של קרינה פלואורסצנטית משלימה. - לשטוף את הסעיפים עם PBS 3x עבור 5 דקות כל אחד.
- מודקות את הסעיפים עם עז פלורסנט אדום שבטים משניים נוגדן הארנב IgG H & L וירוק עז פלורסנט משני שבטים משניים נוגדנים לעכבר IgG H & L. דגירה ב RT עבור 45 דקות בתא לח.
- לשטוף עם PBS 3x עבור 10 דקות כל אחד.
- הר את הסעיפים במדיום הרכבה פלורסנט המכיל 100 ng/mL 4 ′, 6-diamidino-2-פניינידול (DAPI) ולכסות כל שקופית עם שמיכות.
- אפשר ייבוש לילה ב -4 ° צ' לפני הדמיה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סיבי מיואלה מוקפים במטריצה מלמיסטית המכילה מלמינציה. כתמים אדומים תוחמת הפריפריה מיוים ומאפשר זיהוי שלהם. IgG מוצג בירוק. גרעינים הם מוכתמים DAPI והם נמצאים כחול מתחת למיקרוסקופ. עם זאת, גרעינים מוצגים בלבן כאן (איור 1). הפעילות החיסונית החלשה מהווה מצפה בתאי החילוץ, אשר ניתן להגדיל במקרה של דלקת. מכתים ירוק בתוך הסיבים מיותמים משקף את נוכחותו של IgG.
מעבר לעכבר Mdx מאופיין בשלב חולף של מיווזיס חריף...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נמק מיוסיבי הוא תוצאה נפוצה של התעמלות טראומטית בשרירים נורמליים. הוא מפוצה היטב על ידי קיבולת משובי חזקה של ושלתי השריר המקומי. עם זאת, בכמה מצבים שרירים כגון ב MDs, יכולת ההתחדשות של תאי לווין נפגעת על ידי מחלות כרוניות ופיברוזיס מוגזמת. הממצאים האחרונים מראים כי סיבי השריר יכול למות על ידי נקרוסיס, צורה מוסדר של נמק. באופן ספציפי יותר, עיכוב של נקרופזה עשוי להיות אסטרטגיה טיפולית חדשה עבור טיפול DMD4. חקירת מסלולים המוות תאים בהפרעות ניוון שרירים דורש שיטות אמינות של המוות תאים השריר הכמת. פרוט...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי האגודה הצרפתית הMyopathies עם התוכנית Translamuscle. המחברים מודים לד ר פרלה רייס-פרננדז וד ר מתיו בורבוק על הקריאה הזהירה של כתב היד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דיסקי פקק עגולים | Pyramid Innovation | R30001-E | אל תשכח לתייג בבירור את הפקק כך שניתן יהיה לקבוע את מזהה הדגימה לאחר הקפאת |
| Cryostat | Leica | CM3050 sn34 | יש לבצע הקפאת שרירים בין -20 ל-25 מעלות צלזיוס. עובי: 7-10 מיקרומטר. |
| Dakopen | Dako | S2002 | מחסום הידרופובי סביב קטעי השרירים. זה מונע פיזור של המדיום במהלך הדגירה |
| מלקחיים | FST | 91117-10 | / |
| נוגדן IgG נגד עכבר (H+L), Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | דילול: 1/500 |
| נוגדן IgG נגד ארנב עיזים (H+L) Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | דילול: 1/500 |
| סרום עיזים | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | בשלב החסימה, השתמש בדילול של 10% ב-PBS. לדגירת נוגדנים, השתמש בדילול של 5% במדיום הקפאה PBS |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | . יש לקרר בכוס המונחת בחנקן נוזלי. |
| עכברי mdx | מעבדת ג'קסון | C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J | עכברי Mdx עוברים מוטציה עבור הגן דיסטרופין. מגיל שלושה שבועות, השרירים מאופיינים בניוון כרוני |
| מיקרוסקופ | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A | מטריצת הטמעה |
| PFA (פרפורמלדהיד) | ThermoFischer Scientific | 28908 | משמש לקיבוע קריוסקציה (ניתן להשתמש ב-2% או 4% PFA) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | מדיום דילול עבור תיוג חיסוני |
| מספריים מדויקים | FST | fst 14001-12 ו- fst 14001-14 | משמש לאיסוף השרירים |
| נוגדן ארנב לעכבר פאן-למינין | סיגמא אולדריץ' | L9393 | דילול: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Aliquots לשמירה על +4° ג |
מקורות
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655(2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
