הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

23.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59780

⸱

4 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

תקציר

עריכת הגנום באמצעות מערכת crispr-Cas יש מתקדם מאוד את היכולת לערוך בדיוק את גנום של אורגניזמים שונים. בהקשר של תאים מיונקים, טכנולוגיה זו מייצגת את האמצעים החדשניים לבצע הגנום-רחב מסכים גנטיים למחקרים גנומיקה תפקודית. ספריות של rnas מדריך (sgrna) מיקוד כל מסגרות הקריאה הפתוחה להתיר את הדור נתיישב של אלפי רטבאליות גנטית בבריכה אחת של תאים שניתן הוקרן עבור פנוטיפים ספציפיים כדי לסבך את הפונקציה גן ותהליכים סלולריים ב דרך לא משוחדת ושיטתית. CRISPR-Cas מסכי לספק לחוקרים עם שיטה פשוטה, יעילה, זולה לחשוף את התוכניות הגנטיות עבור פנוטיפים סלולריים. יתר על כן, ניתוח דיפרנציאלי של מסכי שבוצעו קווי תאים שונים מסוגים שונים של סרטן יכול לזהות גנים כי הם הכרחיים בתאי הגידול, חשיפת מטרות פוטנציאליות עבור טיפולים ספציפיים נגד סרטן. ביצוע מסכי הגנום כלל בתאים אנושיים יכול להיות מרתיע, כמו זה כרוך בטיפול של עשרות מיליוני תאים ודורש ניתוח של קבוצות גדולות של נתונים. הפרטים של המסכים האלה, כגון אפיון קו התא, שיקולי הספרייה של CRISPR, והבנת המגבלות והיכולות של טכנולוגיית CRISPR במהלך הניתוח, מתעלמים לעתים קרובות. בתנאי כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור ביצוע מוצלח של במאגר הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי מסכי.

מבוא

Crispr-Cas, קיצור עבור מקובצים באופן קבוע במרווחים של palindromic קצר ולאחר מכן ו crispr הקשורים נוקלאז, מורכב חלבון נוקלאז יחיד (למשל, Cas9) מורכב עם מדריך סינתטי RNA (sgrna). זה מורכב ribonucleoprotein מטרות האנזים Cas9 כדי לגרום להפסקות DNA כפול שנתקע על לוקוס גנומית מסוימת1. כפול תקועים הפסקות ניתן לתקן דרך הומולוגיה תיקון מכוון (HDR) או, בדרך כלל, באמצעות שאינם הומוולוגיים הצטרפות (NHEJ), שגיאה מועדת תיקון מנגנון כי תוצאות ההוספה ו/או מחיקות (INDELS) כי לעתים קרובות לשבש את פונקציית הגן 1. היעילות והפשטות של CRISPR מאפשר רמה בעבר בלתי מושג של גנומית מיקוד כי הרבה עולה מעל הגנום הקודם לעריכת טכנולוגיות [i.e., האצבעות אבץ נוקלאוסיס (הזפה) או שעתוק activator כמו הנוקלאוסים ( TALENS), שניהם סובלים ממורכבות עיצוב מוגבר, יעילות החצייה הנמוכה יותר, ומגבלות בתוך מעגל העריכה של הקולנוע2].

היישום מחקר בסיסי של CRISPR בודד מדריך מבוסס RNA הגנום המבוסס על עריכת מדענים ביעילות ובזול לחקור את הפונקציות של גנים בודדים וטופולוגיה של רשתות אינטראקציה גנטית. היכולת לבצע מסכי הגנום הפונקציונלי היה משופר מאוד על ידי שימוש במערכת CRISPR-Cas, במיוחד כאשר בהשוואה לטכנולוגיות מוקדמות יותר גנטי כגון התערבות RNA (RNAi) ומוטזיס גנים מלכודת. בפרט, rnai סובל השפעות גבוהות מחוץ למטרה ואת הנוק-אין שלם, וכתוצאה מכך רגישות נמוכה יותר וספציפיות לעומת crispr3,4,5, בעוד שיטות מלכודות גנטי ניתן רק בהפלואיד תאים עבור מסכי אובדן-פונקציה, הגבלת היקף דגמי התא שניתן לחקור6. היכולת של CRISPR לייצר הגן המלא לנקוש לכבות מספק מערכת חזקה יותר ביולוגית לחקור פנוטיפים מוטנטים, עם רעש נמוך, השפעות מינימליות מחוץ ליעד ופעילות עקבית על פני ריאגנטים5. Crispr-Cas9 sgrna ספריות המטרה הגנום האנושי כולו זמינים כעת נרחב, המאפשר דור סימולטני של אלפי גנים להוריד בניסוי אחד3,7,8,9 .

פיתחנו מאוד CRISPR-Cas9 הגנום-wide sgRNA בספריות ויראליות בשם טורונטו לנקוש-out (TKO) ספריות (זמין דרך Addgene) כי הם קומפקטי רצף ממוטב כדי להקל על ברזולוציה גבוהה מסכי גנומיקה תפקודית. הספרייה העדכנית ביותר, TKOv3, מטרות ~ 18,000 האדם בקידוד הגנים עם מדריכים 71,090 ממוטב לעריכת יעילות באמצעות נתונים אמפיריים10. בנוסף, TKOv3 זמין כספרייה חד-קומפוננטי (LCV2:: TKOv3, מזהה Addgene #90294) המבטא Cas9 ו sgRNAs על וקטור יחיד, הקלה על הצורך ליצור תאים Cas9 ביטוי יציב, המאפשר הגנום רחב לנקוש על פני מגוון רחב של סוגי תאים ממיונקים. TKOv3 זמין גם בווקטור ללא Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene מזהה 125517) והוא יכול להיות מנוצל בתאים לבטא Cas911.

הגנום-wide CRISPR-Cas9 לערוך אוכלוסיית התאים ניתן לחשוף לתנאי גדילה שונים, עם שפע של sgRNAs לאורך זמן ככמת על ידי הדור הבא רצף, מתן הבדיקה כדי להעריך את הירידה או העשרה של תאים עם המעקב גנטי רטבאליות. הספריות של CRISPR מעלף ניתן לרתום כדי לזהות גנים כי, על פי הטורבציה, לגרום לפגמים בכושר הסלולר, רגישות מתונה תרופות (למשל, גנים רגישים או עמידים), להסדיר ביטוי חלבון (למשל, עיתונאי), או נדרשים עבור מסוים פונקציית מסלול ומדינה. סלולרית12,13,14 לדוגמה, מסכי כושר דיפרנציאלי בקו התאים של סרטן יכול לזהות גם דלדול או הפחתה של אונאוגנים והעשרה או גידול של דכאי הגידול גנים3,14,15. באופן דומה, שימוש במינונים בינוניים של תרופות טיפוליות יכול לחשוף הן עמידות לסמים והן גנים הרגישות16,17.

בתנאי כאן הוא פרוטוקול הקרנה מפורטת עבור CRISPR-בקנה מידה-Cas9 אובדן הפונקציה של ההקרנה באמצעות הספריות של טורונטו-out (TKOv1 או v3) בתאי היונקים מהדור הספרייה, הקרנת ביצועים לניתוח נתונים. למרות שפרוטוקול זה הותאם במיוחד להקרנה באמצעות הספריות לדפיקה בטורונטו, ניתן להחילם ולהפוך לניתן להרחבה לכל הספריות הנמצאות במאגר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים המפורטים להלן צריכים לפעול לפי ההנחיות של המכון לבריאות הסביבה ולמשרד הבטיחות.

1. הגברה במאגר הספרייה

  1. לדלל את ספריית ה-DNA המוכן מראש של הספרייה כדי 50 ng/μL ב TE (למשל, TKOv3).
  2. אלקטרופורף את הספרייה באמצעות תאים אלקטרומוסמכים. הגדר סכום כולל של ארבע תגובות אלקטרופורציה כמתואר להלן.
    1. הוסף 2 μL של 50 ng/μL של ספריית TKO כדי 25 μL של תאים מופשרים לכיוון מקורר (1.0 מ"מ) על קרח.
    2. אלקטרופורטה באמצעות הגדרות אופטימליות המוצעות על-ידי פרוטוקול היצרן. בתוך 10 s של הדופק, להוסיף 975 μL של שחזור בינונית (או SOC בינוני) קובט.
    3. העבר תאים electroporated לצינור תרבות ולהוסיף 1 מ ל של מדיום שחזור. מודטה צינורות באינקובטור רועד ב 250 סל ד עבור 1 h ב 37 ° c.
  3. הגדר לוחית דילול כדי לחבר את הספרייה ולהעריך את יעילות ההמרה.
    1. הבריכה כל 8 מ ל של תאים משוחזרים ומערבבים היטב. העברה 10 μL של תאים במאגר כדי 990 μL של מדיום השחזור עבור דילול מתקפל 800 ומערבבים היטב.
    2. צלחת 20 μL של הדילול אל מראש מחומם 10 ס"מ ליברות + carbenicillin (100 μg/L) לוחית אגר. התוצאה היא דילול 40,000 מתקפל של transformants שישמשו כדי לחשב את יעילות השינוי.
    3. צלחת 400 μL של תאים התאושש על כל לוח על פני סך של 20 טרום מחומם 15 ס"מ ליברות + carbenicillin אגר צלחות. מודאת הצלחות במשך 14 עד 16 h ב 30 ° c.
      הערה: הצמיחה בטמפרטורה נמוכה זו מקטינה את השילוב החוזר בין המסוף הארוך (משמאל לימין)18.
    4. כדי לחשב את היעילות שינוי, לספור את מספר המושבות על לוחית הדילול 40,000-קיפול (שלב 1.3.2). הכפל את מספר המושבות שנספרו על-ידי 40,000 כדי להשיג את המספר הכולל של מושבות בכל הלוחות. המשך אם המספר הכולל של המושבות מייצג כיסוי ספריה שווה ערך למינימום של מושבות 200x לפי sgRNA (האופטימלי ביותר הוא 500-1000x).
      1. לדוגמה, מספר המושבה המינימלית עבור ספריית TKOv3 (71,090 sgRNA) הוא 1.4 x 107, ששווה ל-200x מושבות לכל sgRNA. אם ייצוג המושבה אינה מספיקה, הגדילו את מספר האלקטרופורציות בשלב 1.2 על בסיס מספר המושבות על לוחית הדילול כדי להשיג את הכיסוי המינימלי לספרייה.
  4. לקצור את המושבות כמתואר להלן
    1. על כל 15 ס מ לוחית, להוסיף 7 מ ל LB + carbenicillin (100 μg/L) בינוני, ואז לגרד את המושבות עם שליטת התא. עם פיפטה בצורת 10 מ ל, העבירו את התאים המעוקרים לבקבוקון או בקבוק בצורת חרוט.
    2. שוב לשטוף את הצלחת עם 5 מ ל של LB + carbenicillin בינוני ולהעביר את הפתרון לבקבוק.
    3. חזור על כל הלוחות לתאי בריכה מ-20 צלחות לתוך בקבוק סטרילי.
  5. מערבבים תאים שנאספו עם בר מעורר עבור 1 h בטמפרטורת החדר (RT) כדי להפריד את הגושים הסלולריים. העבר תאים מראש בקבוקי צנטריפוגה וצנטריפוגה ב 7,000 x g כדי חיידקים גלולה, ואז למחוק מדיה.
  6. שוקלים את הגלולה התא רטוב להפחית את המשקל של בקבוק הצנטריפוגה כדי לקבוע את המשקל הסופי של הגלולה רטוב. לטהר את ה-DNA באמצעות מקסי או מגה בקנה מידה ערכת טיהור הקיט בהתאם לכמות של גלולה חיידקים כל עמודה יכול לעבד.

2. הפקת וירוס בקנה מידה גדול של הספרייה

הערה: כל השלבים בסעיף זה של הפרוטוקול מתבצעים במתקן BSL2 + בתוך מחלקה II, הקלד A2 בטיחות ארון.

  1. לחשב את מספר 15 ס מ לוחות הדרושים עבור ייצור וירוסים מבוסס על ההערכה כי 18 מ ל של וירוס בדרך כלל נקצרו מ 1 15 ס"מ לוחית.
  2. הכנת תאים עבור העברה על ידי זריעת HEK-293T בתאי האריזה במדיה צמיחה אנטיביוטית נמוכה (Dמאמ + 10% FBS + אופציונלי: 0.1 x עט/דלקת) ב 8 x 106 תאים לכל 15 ס מ לוחית בגודל 20 מ ל של מדיה. התאים הדגירה הלילה ב 37 ° c, 5% CO2. ודא שהתאים המצופים הם 70%-80% שוטפת ומתפשטים באופן שווה ברגע החצייה.
  3. ביום שלמחרת, הכינו שלוש הצלחות פלסטיות כמתואר בלוח 1 עבור 15 ס מ לוחות. לחשב את כמות הפלסטיק הדרושה עבור העברה אחת ולעשות שילוב של פלמידים עבור מספר צלחות, ועוד אחד להיות מנוכר.
  4. הכינו מגיב מבוסס השומנים המבוסס על כל העברה כמתואר בטבלה 2. Aliquot מופחת סרום מדיה לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 mL עבור מספר לוחות להיות מזוהמים. הוסף מגיב החוצה, מערבבים בעדינות, ו-דגירה עבור 5 דקות ב RT.
  5. לאחר 5 דקות דגירה, להוסיף את כמות ה-DNA הנדרש עבור מעבר אחד לזיהום החצייה מגיב עבור 3:1 יחס של העברה מגיב-ל-μg של קומפלקס DNA. מערבבים בעדינות ומודרכות עבור 30 דקות at RT.
    הערה: הפעולות הבאות ניתן להכין בקבוצות של חמישה או פחות, עם 5 מרווחי זמן כדי למטב לזמן ולהימנע הדגירה מעל.
  6. לאחר 30 דקות של דגירה, העבר בזהירות כל תערובת המעבר לכל צלחת של תאים אריזות. להוסיף את התמהיל כולו באמצעות 1 mL הטיפ הקצה dropwise בתנועה מעגלית, זיגזג בלי להפריע monolayer התא. מודטה תאים ב 37 ° צ' עבור 18 h ב 5% CO2.
  7. הכנת מדיה הקציר נגיפי: 500 mL של dmem דיום בינונית + 32 mL של bsa מלאי (20 גרם/100 mL, הומס dmem מסנן מעוקר עם 0.22 יקרומטר מסנן) + 5 מ ל של 100 מיל עט/דלקת.
  8. לאחר 18 h, להסיר את המדיה (להשתמש בטיפול נאות של פסולת וירוס כגון דגירה של 1% נתרן ההיפוכלניט עבור 30 דקות לפני הסילוק). החלף בעדינות עם 18 מ ל של מדיית קציר ויראלי לכל צלחת. מודטה תאים ב 37 ° צ' עבור 18 h ב 5% CO2.
  9. לאחר 24 שעות, בדוק את תאי האריזה עבור מורפולוגיה חריגים והתמזגו כאינדיקציה לייצור וירוסים טוב. לאחר מכן, לקצור את הנגיף על ידי איסוף כל supernatant והעברת לתוך צינור צנטריפוגה מעוקר חרוטי.
  10. ספין התקשורת המכילה וירוס ב 300 x g עבור 5 דקות ו הגלולה תאים האריזה. לתוך צינור פוליפרופילן סטרילי. מבלי להפריע לגלולה
  11. אחסן את הווירוס ב-4 ° צ' לתקופות קצרות (פחות משבוע אחד) או מיד ב-80 ° c לאחסון לטווח ארוך. מעבר וירוס בקנה מידה גדול שיטת ' לשימוש בודד אמצעי אחסון לטווח ארוך כדי למנוע הקפאה/הפשרה.

3. אפיון קו תאים להקרנה

  1. בחר את קו התא הרצוי.
    1. למדוד ולהקליט את זמן ההכפלה המשוער של התאים.
    2. קביעת צפיפות הציפוי התא אופטימלית עבור תאים culturing כל 3-4 תא טווח בכלי תרבות רקמה של בחירה (למשל, 15 ס מ רקמות הרקמה התרבותית).
  2. לקבוע את הריכוז puromycin להשתמש בשורה התא הרצוי לבחירה של ספריות TKO המכיל puromycin התנגדות סמן כדלקמן:
    1. תאים זרע בצלחת 12 היטב על הצפיפות הנדרשת כדי להגיע למפגש אחרי 72 h, ולאחר מכן דגירה לילה (37 ° צ', 5% CO2).
    2. ביום שלמחרת, שנה למדיה המכילה טווח דילול של ריכוזי puromycin מ -0 μg/mL ל-10 μg/mL, בהפרשים של 0.5 μg/mL. דגירה את התאים עבור 48 h.
    3. לאחר 48 h, למדוד את הכדאיות התא על ידי ספירת תאים או alamarBlue כתמים.
    4. לקבוע את הריכוז הנמוך ביותר שהורג 100% של תאים ב 48 h. השתמש בריכוז זה כדי לבחור עבור אוכלוסיות התאים של CRISPR בשלבים 4.6 ו 5.2.6.
      הערה: עבור קווי התא עם זמני הכפלה ארוכים יותר, incubations יותר עם puromycin יכול להיות נסבל. במצבים אלה, לקבוע את עקומת להרוג עבור זמן הדגירה הנדרש עבור < 3 תא טווח. מזער את הזמן לבחירה כדי למנוע נושרת של גנים חיוניים לפני תחילת ההקרנה.
  3. בדוק את התאים רגישות הקסאדימטרטין ברומיד (עד 8 μg/mL) על ידי ביצוע עקומת תגובה מינון באותה שיטה המשמשת למדידת רגישות puromycin (שלב 3.2). אם הרעילות היא נצפתה עם < 8 μg/mL של הקסאדימתוס ברומיד, אין להשתמש.

4. טיטור פונקציונלי של ספריית CRISPR במאגר וירוס לקביעת משרד המידע

  1. הפשרת מגוון טרי של ספריית הספרייה הגנומית במאגר הווירוסים (למשל, LCV2:: TKOv3) ולשמור על קרח.
  2. עיצוב סדרה של אמצעי אחסון וירוס כדי לבדוק בין טווח של 0-2 מ ל (כלומר, 0 מ"ל, 0.25 mL, 0.5 mL, 1 מ ל, ו 2 mL).
  3. הקציר תאים היעד ואת תאי הזרע ב 15 ס מ לוחות בצפיפות הדרושים כדי להגיע למפגש ב 72 h.
  4. כדי לבדוק כל אמצעי אחסון של וירוסים, הכינו צלחות כפולות. הוסף תאים, וירוס, הקסאדיme, ברומיד (8 μg/mL) ומדיה לנפח סופי של 20 מ ל. לערבב צלחות ביסודיות, לשבת ברמת לוחות בחממה ו דגירה עבור 24 h (37 ° צ', 5% CO2).
  5. לאחר 24 שעות, להסיר וירוס המכיל מדיה ולהיפטר (השתמש באמצעי זהירות אבטחה טיחות לטיפול בפסולת וירוס). באופן אופציונלי, לשטוף בעדינות את הצלחת עם PBS חם כדי להסיר וירוס חיצוני.
  6. עבור כל תנאי וירוס, להחליף עם 20 מ ל של מדיה המכילה puromycin באמצעות הריכוז נחוש להרוג תאים בסעיף 3, לצלחת אחת לשכפל. לצלחת השנייה, הוסיפו 20 מ ל של מדיה טרייה ללא puromycin. מודטה עבור 48 h (37 ° צ', 5% CO2).
  7. לאחר 48 h, לבדוק כי כל התאים נגוע (0 mL מצב וירוס) שטופלו עם puromycin מתים. לקצור את כל הצלחות בנפרד ולפזר תאים על ידי חוזר בעדינות.
  8. לספור תאים מכל הצלחות ולחשב את משרד המידע העצמי עבור כל נפח וירוס על-ידי השוואת ספירות תאים עם בחירה puromycin לספירות תאים ללא puromycin (כלומר, +/-puromycin).
  9. גרף תוצאות כדי לקבוע את עוצמת הקול שמובילה 30%-40% הישרדות התא עם puromycin בחירה לעומת ללא puromycin. השתמש באמצעי אחסון וירוס זה כדי להשיג משרד משנה של 0.3 – 0.4 במהלך המסך תחת אותם תנאים של תרבות הרקמה.

5. הדבקת מסך ראשי, בחירה והפסיית תא

  1. בחר בכיסוי הספריה של CRISPR sgRNA כדי להישמר בכל המסך (מומלץ מינימום של 200).
    1. בהתבסס על כיסוי הספרייה, לקבוע את מספר התאים הדרושים כדי לשמור על כיסוי זה לכל sgRNA ואת מספר התאים הדרושים לזיהום ב-מוי 0.3 (טבלה 3).
    2. קבע את מספר הלוחות הדרושים להגדרת הזיהום (טבלה 4).
  2. הדבקת התאים באמצעות ספריית CRISPR
    1. הקציר תאים וזרע את מספר התא הנדרש לכל 15 ס מ לוחית.
    2. הוסף את ההקמאפין ברומיד (8 μg/mL) לכל הצלחות.
    3. הוסף את הווירוס באמצעי האחסון הנדרש עבור מוי 0.3 להקרנה ולוחיות הבקרה 2. עבור הפקד 1, אל תוסיף וירוס והחלף את אמצעי האחסון במדיה.
    4. מערבבים את הצלחות ביסודיות על ידי הטיה. מניחים צלחות בחממה, ומוודאים שהם ברמה.
      הערה: זיהומים אצווה ניתן לעשות על ידי שילוב שילוב הורים של וירוס, מדיה, ו הקסאדיme, ברומיד לתאי ההשעיה לפני ציפוי.
    5. הסר מדיה והחלף עם מדיה טרייה המכילה puromycin בריכוז שנקבע בשלב 3.2.4 להקרנה ושליטה 1 צלחות 24 שעות לאחר זיהום וירוס. הוסף מדיה טרייה ללא puromycin ללוחית הבקרה 2. התאים הדגירה עבור 48 h (37 ° צ', 5% CO2).
    6. 48 h לאחר puromycin נוסף, להבטיח כי כל התאים נגוע מתים (שליטה 1) כדי לאשר את הפעילות puromycin, ואז לקצור את התאים הנגועים.
  3. איסוף אוכלוסיית תאים נגועים והפסיית תא
    1. הpuromycin את התאים הנבחרים מכל לוחיות ההקרנה במיכל סטרילי אחד. לאסוף את התאים מכל צלחת בקרה בנפרד. פזר את התאים על ידי ליטוף חוזר עדין.
    2. ספור תאים מתאי סינון, פקד 1, ובקרה 2 בנפרד וחשב את מספר התאים ל-1 mL.
    3. חישוב משרד התקשורת וכיסוי מתקפל שהושגו כדלקמן:
      משוואה: MOI = סך כל התאים לכל הקרנה ÷ סך התאים בלוחית הבקרה; חישוב ניסיוני.
      נוסחת כיסוי קיפול: (תאים נגועים × MOI סופי) ÷ גודל ספריית sgRNA; חישוב מדעי.
    4. לאסוף שלושה משכפל של כדורי תא מתוך התאים במאגר בסיקור הספרייה הנבחר להפקת DNA גנומית. צנטריפוגה את התאים ב 500 x g עבור 5 דקות לשטוף עם PBS. סמן את הצינורות והקפא את כדורי התא ב-80 ° צ' (אלה הם דגימות התייחסות T0).
    5. פצל את המאגר של תאים נגועים לשלוש קבוצות שכפול (למשל, שכפל A, שכפל B, שכפל C), תוך שמירה על כיסוי ספריה בתוך כל שכפול. תאי הזרע באותה צפיפות הזריעה כפי שבדרך כלל היו משמשים בעת הרחאתם. השתמש באותו מספר תאים עבור כל צלחת שכפול ומספר כולל של תאים בין שכפול.
    6. להמשיך לעבר תאים והקציר שלושה משכפל של כדורי תא מכל שכפול של תאים נגועים במאגר כאמור לעיל, כל 3 – 8 ימים בהתאם לקו התא, עד 15 – 20 תא טווח. בכל מעבר, לקצור את התאים מכל הצלחות בכל קבוצה שכפול אחד עם השני (כלומר, כל התאים משכפול לוחיות מחדש יחד, כל התאים מתוך שכפול לוחות B מעורבבים מחדש יחד, וכו ').
    7. סמן כל גלולה עם זמן (T) ולשכפל ייעוד. זה מתאים למספר הימים post-T0 הגלולה נאסף (למשל, T3_A, T3_B, T3_C, וכו ').
  4. עבור מסכי סמים בחירה שלילית, לאפשר לתאים להתאושש לפחות מעבר אחד לאחר T0 לפני הטיפול. ב-T3 או T6, פצל את התאים מכל קבוצה שכפול (A, B, C) לאוכלוסיות טיפול ושליטה בסמים, תוך שימוש באותה דחיסות זריעה המשמשת בשלב 5.3.5.
    1. בריכה נפרדת של מספר התאים הדרושים לכיסוי ספריה עבור כל שכפול בקבוצת הטיפול בסמים. הוסף את הסם בריכוזי ביניים (IC20-ic50). זרע את התאים ואת הדגירה (37 ° צ', 5% CO2) עד המעבר הבא.
    2. בריכה נפרדת של מספר התאים הדרושים לכיסוי ספריה עבור כל שכפול בקבוצת בקרת הרכב. הוסף את פקד הרכב באמצעות אותו אמצעי אחסון כמו התרופה (< 0.5% v/v). זרע את התאים ואת הדגירה (37 ° צ', 5% CO2) עד למעבר הבא.
    3. המשך לחלוף את התאים ולקצור את כדורי התא עבור דנ א גנומית כל 3 ימים כמתואר בשלב 5.3.5, תוך רענון התרופה או הרכב בכל מעבר.
  5. עבור מסכי הבחירה החיוביים או עמידות הסמים, פצל כל קבוצת שכפול בהתאם למספר התאים הדרושים לכיסוי הספריה. להוסיף IC90 התרופות ריכוזי כל שכפול. ב IC90, רוב התאים יהרגו. אפשר אוכלוסיות עמידות לגדול ולאסוף כדורי תא (1 – 2 x 107 תאים) עבור הפקת DNA גנומית.

6. הכנת ובדיקת מדגם CRISPR

  1. דנ א גנומי
    1. מודיית את כדורי תא קפוא עבור 5 – 10 דקות ב RT עבור הפשרה.
    2. הוסף 1.4 mL של PBS אל צינור צנטריפוגה מ ל 50 mL המכיל גלולה תא. מערבולת עבור 20 s להשעות מחדש את התאים ומנוחה 1 דקות. במקרה הצורך, פיפטה 15x עם P1000 לפרק את הגושים הנותרים בתאים. אם העברת תאים מצינור 15 מ"ל או 1.5 mL, להשעות מחדש את התאים עם 1 mL של PBS, ואז להעביר תאים לצינור 50 mL ולשטוף את הצינור המקורי עם 400 μL של PBS.
    3. הוסף 5 מ ל של פתרון לליזה גרעינים לתאים מושעה מחדש. באמצעות הפיפטה 10 מ"ל, לערבב את המדגם על ידי ליטוף למעלה ולמטה 5x.
    4. הוסף 32 μL של RNase A (20 מ"ג/mL; כדי לקבל ריכוז סופי של 100 μg/mL) כדי הגרעין הגרעיני לערבב את המדגם על ידי היפוך הצינור 5x. מודטה את התערובת ב 37 ° c עבור 15 דקות ולאפשר דגימה להתקרר עבור 10 דקות ב RT.
    5. הוסף 1.67 mL של הפתרון משקעים חלבון לליפוסט ומערבולת במרץ עבור 20 s. גושים בחלבון קטן עשוי להיות גלוי לאחר ערבוב.
    6. צנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 10 דקות ב-RT.
    7. באמצעות מנקז 10 מ ל, להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגה 50 mL המכיל 5 מ ל של איזופנול. בעדינות לערבב את הפתרון 10x על ידי היפוך עד ה-DNA נצפתה.
      הערה: ה-DNA ניתן לראות כמו לבנים, חוט כמו חוטים היוצרים מסה נראה.
    8. צנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 5 דקות ב RT כדי גלולה DNA.
    9. באמצעות שימוש בפיפטה 10 מ ל, הסר בזהירות את הסופרנטנט והימנע מפירוק הגלולה הגנטית. הוסף 5 מ ל של 70% אתנול ב-RT ל-DNA. לסובב בעדינות את הצינור כדי לשטוף את הגלולה ואת הצדדים של הצינורית צנטריפוגה.
    10. צנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 5 דקות ב RT.
    11. באמצעות הצינורות 10 מ ל, להסיר בזהירות את האתנול 70% ולהימנע מפירוק הגלולה DNA. דנ א של גנומית אוויר במשך 10 דקות ב RT.
    12. הוסף 400 μL של הפתרון TE לצינור ולתת את ה-DNA מתמוסס ידי הדגירה ב 65 ° c עבור 1 h. לערבב את ה-DNA על ידי מצליף בעדינות את הצינור כל 15 דקות. אם ה-DNA אינו מתמוסס לחלוטין, שפופרת דגירה ב 65 ° c עבור תוספת 1 h תוך בעדינות מצליף הצינור כל 15 דקות, ולהשאיר אותו ב 4 ° c בלילה.
    13. צנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 1 דקות בשעה RT והעבר דנ א גנומית לצינור 1.5 mL נמוך מחייב.
    14. לכמת ולמדוד את הטוהר של ה-DNA גנומית על שני ספקטרוסקופיה (עבור כולל חומצות גרעין תוכן) ו פלואורומטר (עבור תוכן ה-DNA כפול תקוע).
  2. באופן אופציונלי, מזרז DNA גנומית אם יש בעיות עם הגברה הזרם PCR של sgRNA כדלקמן.
    1. העברת 400 μL של DNA גנומית לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
    2. הוסף 18 μL של 5 M הנאל (ריכוז סופי של 0.2 M) ו 900 μL של 95% אתנול.
    3. היפוך צינור 10x עד ביסודיות מעורב, אז צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 10 דקות ב-RT.
    4. הסירו בזהירות את הסופרנטנט. והימנעו מפירוק הגלולה לשטוף את הגלולה DNA עם 500 μL של 70% אתנול. סובב בעדינות את השפופרת כדי לשטוף את הגלולה DNA.
    5. צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 5 דקות ב RT.
    6. הסירו בזהירות את הסופרנטנט. והימנעו מפירוק דנ א דנ א של גנומית אוויר במשך 10 דקות ב RT.
    7. הוסף 300 μL של TE כדי לפזר דנ א כפי שמתואר בשלבים 6.1.12.
    8. לכמת ולמדוד את הטוהר של דנ א גנומית כפי שמתואר בשלב 6.1.14.
  3. הכנה לספריות ברצף של CRISPR
    1. הגדר את ה-PCR 1 כמתואר בטבלה 5 באמצעות סך של 100 ΜG של דנ א גנומית. הוסף 3.5 μg של דנ א גנומית לתגובה μL 50 להגדיר זהים 50 μL תגובות כדי להשיג את הכיסוי הרצוי. טבלה 6 מפרטת דוגמאות של רצפים פריימר עבור הגברה של LCV2:: TKOv3 ספריות ברצף. טבלה 7 מפרטת דוגמאות של רצפים פריימר עבור הגברה של pLCKO2:: TKOv3 ספריות הרצף.
    2. להגביר את ה-PCR 1 תגובות באמצעות התוכנית המתוארים בטבלה 8.
    3. בדוק PCR 1 הגברה על ידי הפעלת 2 μL של מוצר ה-PCR על ג'ל 1% צמח. ה-PCR 1 מניב מוצר של 600 bp.
    4. בריכה כל התגובות מ50 μL בודדים עבור כל דגימת דנ א גנומית ולערבב ידי vortexing.
    5. כוונן תגובה אחת ל-PCR 2 (50 μL) עבור כל דוגמה כפי שמתואר בטבלה 9 באמצעות 5 μl של מוצר ה-pcr 1 במאגר כתבנית. השתמש בצירופי אינדקס ייחודיים עבור כל מדגם בודד כדי לאפשר צירוף של דגימות ספריה ברצף.
    6. הגבר את תגובת ה-PCR 2 באמצעות התוכנית המתוארים בטבלה 10.
    7. ניקוי ציוד ג'ל לטיהור מוצרים מוגבר עם 0.1 N HCl במשך 10 דקות לפני השלכת ג'ל. הכן 2% ג'ל agarose המכיל כתם DNA לטיהור PCR 2 מוצרים מוגבר.
    8. הפעל את מוצר ה-PCR 2 ב-2% הצמח במתח נמוך (1.0-1.5 h הפעלה). ה-PCR 2 מניב מוצר של 200 bp.
    9. המחש את מוצרי ה-PCR. באור כחול ממאיר בלו את הלהקה 200 bp ולטהר את ה-DNA מן הפרוסה ג'ל agarose באמצעות ערכת החילוץ ג'ל. לכמת ולמדוד את הטוהר של הספרייה ברצף בשני ספקטרוסקופיה ו פלואורומטר.
      הערה: ריכוז הספרייה האופיינית ג'ל מטוהרים רצף נע בין 5-10 ng/μL ותשואה כוללת של 150 – 300 ng.
  4. רצף תפוקה גבוהה
    1. רצף את ספריות רצפי הרצף של ה-CRISPR על הרצף של הדור הבא.
    2. הפניית רצף T0 דגימות בעומק קריאה גבוה יותר של 400-עד 500 כיסוי ספריה. רצף דוגמאות של נקודות זמן נסיוניות עבור מסכי נפתחות בעומק קריאה מינימלי של קיפול 200. למסכים בחירה חיוביים חזקים, מינימום של עומק קריאה של 50 כיסוי קיפול מספיק לזיהוי של sgRNAs מועשר.
      הערה: קריטי לרצף את הדוגמה T0 כדי לקבוע ייצוג ספריה עבור מסך מסוים ולשמש כהפניה לשינויי הקיפול של sgRNA במשך הזמן.

7. ניתוח נתונים

  1. יישר את הרצף תוך שימוש בתוכניות כגון Bowtie כדי למפות רצף קריאות לספריית ההפניות באמצעות הפרמטרים הבאים:-v2 (מתן אפשרות לשני אי-התאמות) ו-m1 (להשליך כל קריאה שממופה ליותר מרצף אחד בספריה).
  2. לנרמל את מספר הקריאות הממופות הייחודיות עבור כל sgRNA עבור מדגם נתון ל-10,000,000 קריאות לכל מדגם באופן הבא:
    קריאות מנורמלות לכל נוסחת sgRNA לניתוח נתונים גנטיים, הממחישות את שיטת החישוב.שבעה עשר
  3. לחשב את השינוי log2 קיפול של כל sgRNA עבור כל שכפול בכל timepoint (Tn) בהשוואה למדגם T0 (Tn/T0). הוסף ספירה מדומה של 0.5 קורא לכל ספירות הקריאה כדי למנוע הפסקת שיבושים מאפסים. כלילת sgRNAs עם < 30 קריאות raw ב-T0 מדגימה מחישוב שינוי קיפול וניתוח במורד הזרם.
  4. לנתח שינויים מקפלים עם ניתוח בייסיאנית של היסוד הגנטי (בייגל) אלגוריתם < https:/agfibs.pb בייגלה ב>, באמצעות מערכות אימונים חיוניות ולא חיוניות שהוגדרו בעבר19 עבור מסכי הגן המרכזי ( הטבלה המשלימה S1) או מסוממים < https:/Agfibsupplatt-b > עבור מסכי התרופות20.
  5. חשב את הדיוק והאחזור להערכת ביצועי המסך באמצעות תוצאות BF. השתמש בערכה החיונית משלב 7.4 כרשימה החיובית האמיתית עבור הפונקציה precision_recall_curve של Scikit-ללמוד בספרייה פיתון, יחד עם מערכת המשנה מעל BF ציון. לחילופין, בצע את אותו הדבר באמצעות חבילת PRROC ב-R.
  6. חשב את שינוי הקיפול הממוצע של כל המדריכים עבור כל אחד מהגנים. צור מגרשים צפיפות עבור גנים חיוניים לא חיוניים (ראה שלב 7.4) ב R או תוכנה שוות-ערך. ב-R, אם x. ess הוא וקטור המכיל את ערכי שינוי קיפול היומן של גנים חיוניים ו-x. nonEss מכילים גנים שאינם חיוניים, התוויה באמצעות הפקודה הבאה:
    מגרש (צפיפות x. ess), xlab = "מתכוון logFC", col = "אדום", lwd = 2)
    קווים (דחיסות x. nonEss), col = "כחול", lwd = 2)
    הערה: לפרטים של גרסת פיתון וחבילות בשימוש, ראה scikit-ללמוד v 0.19.1: (פורסם על ידי Pedregosa et al.21).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מבט כולל על זרימת העבודה הקרנה CRISPR בקנה מידה של הגנום

איור 1 ממחיש סקירה של זרימת העבודה ההקרנה crispr במאגר, החל בזיהום של תאי היעד עם הספרייה crispr וירוס ב-משרד העניינים נמוך כדי להבטיח אירועים שילוב יחיד ייצוג ספריה נאותה (בדרך כלל 200-to 1000 קיפול). בעקבות זיהום, התאים מטופלים עם puromycin אנטיביוטי לבחור לתאי התמרה. לאחר הבחירה, כT0 תא בסיסית של התא נאסף כדי להעריך את התפל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשל הפשטות של השימוש שלה pliability גבוהה, הטכנולוגיה CRISPR כבר אומץ נרחב ככלי הבחירה עבור עריכת הגנום מדויק. ההקרנה CRISPR במאגר מספק שיטה לחקור אלפי רטבאליות גנטית בניסוי אחד. במסכים במאגר, ספריות sgRNA לשמש כברקודים מולקולריים, כמו כל רצף הוא ייחודי ממופה הגן המיועד. על ידי בידוד ה-DNA גנומית מאוכלוסיית התא, גנים הגורמים הפנוטיפ של עניין יכול להיקבע על ידי כימות השפע sgRNA על ידי רצף הדור הבא. שיטות רצף מקבילי בנפט מנוצל כדי לכמת sgRNAs בדגימות, כלומר מספר רב של אוכלוסיות תאים עצמאיות ניתן למאגר לנתיב רצף זהה כדי למז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי הגנום קנדה, קרן מחקר אונטריו, ואת המוסדות הקנדיים לחקר הבריאות (מגב-142375, PJT-148802).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 מיקרון
30° חממת
37° חממת
37° C, 5% CO2 אינקובטור
5 M NaClPromegaV4221
50X TAE bufferBioShopTAE222.4
6 N תמיסת חומצה הידרוכלוריתBioShopHCL666.500
95% אתנול
אלמר כחולThermoFisher ScientificDAL1025
טרנס-תאורה באור כחולThermoFisher ScientificG6600
אלבומין סרום בקר, בידוד הלם חום, שבר V. מינימום 98%, ביוטכנולוגיה בדרגתביוטכנולוגיהביושופ ALB001.250
השינוי של Dulbecco של Eagles MediumLife Technologies11995-065Cel
Culture Media קובטות אלקטרופורציהBTX45-0134
אלקטרופורטורBTX45-0651
תאים חשמליים EnduraLucigen90293
סרום בקר עובריGIBCO12483-020
תאי אריזה HEK293TATCCCRL-3216ממליץ על מספר מעבר < 15
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)SigmaH9268פולימר קטיוני לשיפור יעילות ההתמרה
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)
LB לוחות אגר עם קרבניצילין
LB בינוני עם קרבניצילין
סולם DNA במשקל מולקולרי נמוךאינגלנד BiolabsN3233S
ספקטרופוטומטרNanodrop ThermoFisher ScientificND-ONE-W
NEBNext Ultra II Q5 Master Mixניו אינגלנד BiolabsM0544L
Opti-MEMLife Technologies31985-070ערכת
טיהור מקסי פלסמידQiagen12963
pMD2.G (פלסמיד מעטפת)AddgenePlasmid #12259מערכת lentiviral
psPAX2 (אריזת פלסמיד)AddgenePlasmid #12260מערכת lentiviral
PuromycinWisent400-160-UG
QIA ערכת מיצוי ג'ל מהירהQiagen28704
Qubit dsDNA BR AssayThermoFisher ScientificQ32853
קיוביט פלואורומטרThermoFisher ScientificQ33226
RNAse AInvitrogen12091021
מדיום התאוששות S.O.CInvitrogen15544034
SYRB כתם ג'ל DNA בטוחThermoFisher ScientificS33102
טורונטו נוקאאוט ספריית CRIPSR (TKOv3) - Cas9 כלולAddgene Addgene ID #90203ספריית CRISPR רחבה גנום, כולל Cas9, 71,090 sgRNA
ספריית טורונטו KnockOut CRIPSR (TKOv3) -Addgene שאינו Cas9 Addgene #125517ספריית CRISPR בכל הגנום, שאינו Cas9, 71,090 sgRNA
Tris-EDTA (TE), pH8.0
UltraPure agaroseThermoFisher Scientific
Wizard ערכת טיהור DNA גנומיPromegaA1120
X-tremeGENE 9 מגיב טרנספקציה DNARoche06 365 809 001מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים
מסנן צלחת Cטלטול C ניו מופחתת מזהה 16500500

מקורות

  1. Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
  2. Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
  3. Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  4. Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
  5. Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  6. Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
  7. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  8. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  9. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
  12. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
  15. Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
  16. Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
  17. Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
  18. Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
  19. Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164(2016).
  20. Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , Available from: https://doi.org/10.1101/232736 (2017).
  21. Pedregosa, F. V., G,, et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
  22. Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213(2011).
  23. Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
  24. Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
  25. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554(2014).
  26. Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
  27. Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
  28. Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CRISPRCRISPRRNAPrecision Recall Analysis
מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.