כאן, דמו של העכבר נאסף. בנוכחות אנטי-מקריש טסיות היו מטוהרים על ידי המדיום iohexol באמצעות מהירות נמוכה צנטריפוגה. טסיות הדם הופעלו עם תרומבין. כדי לחקור אם הם היו מעשי האיכות של טסיות מטוהר נותחו על ידי cy, מיקרוסקופ זרימה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
טסיות מטוהרים מדם שלם כדי ללמוד את המאפיינים הפונקציונליים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מתאי דם אדומים (RBC), כדוריות דם לבנות (WBC), וחלבונים פלזמה. אנו מתארים כאן טיהור של טסיות מתוך דם העכבר באמצעות שלושה מקפלים יותר מעבר מדרגה בינונית ביחס לנפח דגימת דם ו צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. ההתאוששות/תשואה של טסיות מטוהר היו 18.2-38.5%, ואת טסיות מטוהר היו במצב מנוחה, אשר לא מכילים כל מספר משמעותי של RBC ו-WBC. טסיות מטוהרים מטופלים עם תרומבין הגיע עד 93% הפעלה, המציין את הכדאיות שלהם. אנו מאשרים כי טסיות מטוהר הם טהורים מספיק באמצעות cytometric זרימה הערכה מיקרוסקופית. טסיות אלה ניתן להשתמש עבור ביטוי גנים, הפעלה, שחרור גרגר עושה מצבור, הדבקה assays. שיטה זו ניתן להשתמש לטיהור של טסיות מדם של מינים אחרים, כמו גם.
מבוא
טסיות הם רכיב של דם המתפקד כיוזם של קרישת דם בתגובה לנזק בכלי הדם. הם מתאספים באתר של פציעה. כדי לחבר את כלי הקיבול לקיר1 טסיות הם שברי אנוקלאט של ציטופלסמה הנגזר מהקרציטים של מח העצם תחת השפעת התרובטין ולהיכנס למחזור הדם2. הם נחשבים metabolically פעילים ומסוגלים לחוש הסביבה מסחטות על ידי הפעלת מפלי איתות תאיים כי התוצאה היא התפשטות טסיות, מצבור, ו הומוסטטית היווצרות תקע1,3. מלבד הומוסטזיס/פקקת וריפוי הפצע4, טסיות לשחק תפקיד חשוב בתגובות דלקתיות מארח, אנגיוגנזה, ו גרורות3,5,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אוסף דם העכבר צריך להתבצע עם טיפול בעלי חיים מוסדיים המתאים ולהשתמש אישור הוועדה.
הערה: פרוטוקול טיהור טסיות מתואר בדיאגרמת זרימה באיור 1.
1. אוסף דם
- הוסף 25 μL של 3.2% נתרן ציטראט (pH 7.2) כאנטי מקריש ו 0.4 mM של הפרו-Pro-Arg-Pro (GPRP) בצינור פוליפרופילן.
-
לאסוף כ 200 μL של דם מ C57BL/6 העכבר באמצעות מסלולית רטרו.
הערה: ניתן לאסוף דם מכל סוג של מאמץ העכבר ללא קשר לגיל או מין.- השתמש 2 מ ל של isofלוריאן בכל סוג של תא לההרדמה העכבר.
הערה: עומק ההרדמה נבדק על ידי סימנים של נשימה מוגברת וירידה בתנועה. ה....
- השתמש 2 מ ל של isofלוריאן בכל סוג של תא לההרדמה העכבר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סיכום של טיהור טסיות מתואר בדיאגרמת זרימה (איור 1). השלבים כוללים אוסף של דם מהעכבר באמצעות מסלולית רטרו בנוכחות של נוגד קרישה, תוספת של דגימת דם על בינוני הדרגתי iohexol, צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. האיכות של טסיות מטוהר הוערך עם מיקרוסקופ וזרימה cy, לאחר להכתים עם נוגדנים לזהות כל התאים מזהם טסיות מופעל.
המדיום מעבר הדרגתי ודגימת הדם יצרה שתי שכבות נפרדות בצינור, אם הדם התווסף לאט למדיום (איור 2 א
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בדרך כלל, טסיות מבודדות על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה אשר מניב פלזמה עשיר טסיות המכיל מספר משמעותי של כדוריות הדם, הפסולת התאית, וחלבונים פלזמה אשר יכול להפריע הביוכימי והפיסיולוגיים והצרכים הפיזיולוגיים טיהור נוסף21. לכן, חשוב להשתמש בשיטה מהירה ופשוטה אשר יכולה להניב טסיות טהור ללא מזהמים גדולים. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את טיהור של טסיות מ דם העכבר באמצעות בינוני מעבר הצבע עם מהירות נמוכה צנטריפוגה. הפרמטרים המשמשים פרוטוקול זה למקסם את התשואה ולמזער את ההשפלה של טסיות. בינוני וחלבונים פלזמה נ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
תודות
עבודה זו היתה נתמכת על ידי סטארט-up מימון של הקרן המחקר של סינסינטי לילדים ואוניברסיטת סינסינטי מענק הפיילוט Translational M.N. אנחנו רוצים להודות הילדים סינסינטי בבית החולים מחקר זרימה Cy, ליבה על השירותים שלהם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| APC חולדה נגד עכבר/אנושי CD62P (P-selectin) | תרמו-מדעי | 17-0626-82 | סמן הפעלת טסיות דם |
| צינור אפנדורף | פישר סיינטיפיק | 14-222-166 | צינור לצנטיפוגה |
| תוכנת FACS DIVA | BD Biosciences | פריט שאינו קטלוג | ניתוח טסיות דם |
| וצינור FACS | 352008 פישר סיינטיפיק | לזרימה ציטומטריה | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Invitrogen | 26140079 | מרכיב למאגר צביעה |
| FITC חולדה נגד עכבר CD41 | BD Biosciences | 553848 | סמן טסיות |
| דם ציטומטר זרימה | BD Biosciences | פריט שאינו קטלוג | ניתוח טסיות דם ודם מלא |
| תוכנת FlowJo | , Inc. | פריט שאינו קטלוג | ניתוח טסיות דם ודם מלא |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | מניעת היווצרות קרישי טסיות |
| צינור נימי המטוקריט | פישר סיינטיפיק | 22-362566 | צינור נימי לאיסוף דם |
| Hemavet | Drew Scientific | פריט שאינו קטלוג | מנתח תאי דם |
| Hemocytometer | Hausser | תא ספירת תאים | 3100 |
| איזופלורן | בקסטר | 1001936040 | שימוש להרדמת |
| מיקרוסקופ עכבר (אולימפוס CKX41) | אולימפוס | פריט שאינו קטלוג | ניטור וספירת תאים |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | שיפוע |
| בינוני PE חולדה נגד עכבר CD45 | BD Biosciences | 561087 | סמן WBC |
| PE-Cy7 חולדה נגד עכבר TER 119 | BD Biosciences | 557853 | סמן RBC |
| טיפים לפיפט 200 ומיקרו; L, ThermoFisher Scientific רחב קדח | 21-236-1A | העברת דגימות דם וטסיות דם | |
| קצות פיפט 1000 ומיקרו; L, ThermoFisher Scientific רחב קדח | 21-236-2C | העברת דגימות דם וטסיות | |
| מלח פוספט (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | מאגר לשטיפה ודילול |
| נתרן כלורי | Sigma-Aldrich | S7653 | תמיסת מלח פיזיולוגית |
| נתרן ציטראט | Fisher Scientific | 02-688-26 | נוגד קרישה |
| מאגר מכתים | בתוך הבית | פריט שאינו קטלוג | מאגר שטיפה ודילול |
| מי סטייל | הבית | פריט שאינו קטלוג | ממס |
| צנטריפוגה שולחנית | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | דלי מתנדנד צנטריפוגת רוטור |
| תרומבין | מעבדת מחקר אנזימים | HT 1002a | אגוניסט להפעלת טסיות דם |
| טריקסין | מאגר Sigma-Aldrich | T0377 | עבור מדיום Nycodenz |
מקורות
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
