מאמר שיטה

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

DOI:

10.3791/59842

⸱

24 באפריל 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Clinical Biosystems Institute, Smidt Heart institute, Cedars Sinai Medical Center, 2Beckman Coulter Life Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטת העיכול האוטומטית של חלבון פלזמה לניתוח מבוסס ספקטרומטר מערכות מבוססות-פרוטאומית כמותית. בפרוטוקול זה, שלבי העברת הנוזלים והדגירה עבור הדנטורציה של חלבונים, הפחתה, האלקילציה וטריפסין תגובות לעיכול הם יעילים ואוטומטיים. זה לוקח בערך חמש שעות להכין צלחת 96-באר עם דיוק הרצוי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנה לדוגמא לניתוח ספקטרומטר המסה בפרוטאומניקס דורשת מחשוף אנזימטי של חלבונים לתערובת פפטיד. תהליך זה כולל מספר רב של תהליכי דגירה והעברת נוזלים על מנת להשיג דנטורציה, הפחתה, האלקילציה והמחשוף. התאמת זרימת עבודה זו לתחנת עבודה אוטומטית יכולה להגביר את היעילות ולצמצם את מקדמי השונות, ובכך לספק נתונים אמינים יותר להשוואות סטטיסטיות בין סוגי דגימה. בעבר תיארנו הכנה לדוגמה של פרוטאומית אוטומטית1. כאן, אנו מדווחים על פיתוח של זרימת עבודה יעילה ומבוקרת יותר עם היתרונות הבאים: 1) מספר צעדי ההעברה הנוזליים מצטמצם מ -9 עד 6 על-ידי שילוב ריאגנטים; 2) זמן הליטוף מופחת באמצעות טיפ סלקטיבי ליטוף באמצעות מ96 מיקום מראש עם ערוצים מרובים; 3) תפוקה פוטנציאלית מוגברת על-ידי הזמינות של עד 45 עמדות הסיפון; 4) המארז המלא של המערכת מספק טמפרטורה משופרת בקרת הסביבה ומפחית את הפוטנציאל לזיהום של דגימות או ריאגנטים; ו-5) התוספת של איזוטופ יציב המכונה פפטידים, כמו גם חלבון β-גלטוסידאז, לכל מדגם עושה ניטור ובקרת איכות אפשרי בכל התהליך כולו. שיפורים אלה בחומרה ובתהליך מספקים מענה טוב לתוכנה ומשפרים את הדיוק בתוך הספק והאיכות הבין-שיטת (CV) של פחות מ -20%) עבור מבוסס LC-MS חלבון וכימות פפטיד. את זרימת העבודה כולה לעיכול 96 דגימות בצלחת 96-באר ניתן להשלים בערך 5 שעות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבון מבוסס ספקטרומטריה (MS) מבוססי חלבונים וכימות פפטיד מיושם יותר ויותר ככלי יואנליטיים עבור ניתוח פלזמה במחקר בסיסי מעבדות קליני2,3. מיכשור ואינפורמטיקה המחויבים יש מתקדמים במהירות כמו MS הפכה את השיטה של בחירה עבור כימות חלבונים או חלבונים שונה על ידי התמקדות רצפי פפטיד ספציפיים בשל יכולתה לכמת מאות פפטידים בהפעלה אחת MS4. ההכנה לדוגמא משמשת כבסיס לניתוח הפרוטאומית כלשהו. לפני הניתוח MS, החלבונים במדגם ביולוגי הם בדרך כלל באופן מצומצם, מופחת, האלקין, מתעכל לתוך פפטידים טריפטיים, ו התפלה5. אלקיללציה חוסם cysteines כדי למנוע שינויים בלתי מבוקרת ולהבטיח לכל cysteines יש מסה זהה. לאחר מכן, טריפסין מתווסף כדי לעכל חלבונים לתוך פפטידים. כל אחד מהצעדים הללו מחייב אופטימיזציה, והתהליך כולו מבוצע באופן מסורתי ידנית, ומאפשר הקדמה של שגיאות אנליטיות.

צינור הפיתוח המסורתי בסמנים מורכב משני תהליכים עיקריים: פרוטאומיקס רובה עבור גילוי חלבון גלובלי כדי ליצור מלאי חלבון מעמיק6 ו פרוטמרים ממוקדות עבור אימות ואימות מכוון בדיוק גבוהה ותפוקה גבוהה של חלבון ככמת7. ללא קשר לגישה MS, הכנת המדגם הוא אותו ומרכזים על מחשוף אנזימטי של חלבונים לתוך תערובת פפטיד. כפי שהוצע על ידי ואן Eyk ו סוהני8, לאחר שיטה המאפשרת ניתוח מדויק, מדויק, ולאחר החשיפה הן לגילוי ממוקד הרצוי ביעילות לעבור בדיקות ביואריטים של גילוי קליני מיושם. לשם כך, אוטומציה של הכנה לדוגמה תהיה מועילה ותספק את היכולת להגביר את היעילות לניתוח בתפוקה גבוהה. שיטות ידניות מציגות בדרך כלל שגיאות אנליטיות מעבר למגבלות המקובלות שנקבעו על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) בהנחיות אימות השיטות הביואנליטיות המתוקנים, הכוללות סמנים ודיאגנוסטיקה2,9. הפיתוח של מהיר, מאוד מדויק, ואת הידיים ללא מדגם MS חלבון הכנה לדוגמה יהיה צורך להקל על מחקר ביולוגי, אשר דורש הכנת וניתוח אלפי דגימות ביולוגיות. הכנה לדוגמה MS יש שלבים רבים שבהם ניתן להציג שגיאות, והתהליך הוא מייגע וגוזלת זמן.

בשיטה המשופרת שלנו, תחנת עבודה אוטומטית הייתה מתכנתים לבצע את כל הליכי ההכנה לדגימת פלזמה הדרושים בסך של 6 צעדים (איור 1) כדי להבטיח: 1) העברות נוזלים מדויקות; 2) התגובה מתחילה ומופסקת בזמן עקבי; 3) התגובה מבוצעת בטמפרטורה מבוקרת (כלומר, חממה); ו -4) לתגובה יש ערבוב אחיד לכל התגובות. אנו מיושמים גם הוספת בקרת איכות אקסוגני חלבונים ותקנים פנימיים (תקני האיזוטופ מסומן על-ידי האיזוטופים) כדי להבטיח תפוקה באיכות ובלתי מזדהות של חלבון מבוסס LC-MS ו-פפטיד לכמת בפורמט 96. כולל הכנה מגיב, שעות של זמן עבודה וכולל סך של 1,000,000 ליטוף צעדים יידרש לעבד 96 דגימות בצינורות בודדים. אוטומציה מפחיתה את הזמן ומספר האינטראקציות האנושיות הכרוכות בכך.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנות למטפל בנוזלים אוטומטי

  1. צור שיטה חדשה מתפריט קובץ (קובץ | שיטה חדשה)
    הערה: השלם את השלבים בסדר הנתון. הגופן הנטוי מציין טקסט להקלדה בתוכנת ביוסק. אנא צרו קשר עם המחברים לקבלת מידע אודות טכניקות ליטוף ותבניות.
  2. הקלד משתני שלב התחלה וערכיהם בשלב ההתחלה כמפורט בטבלה 1.
  3. קבע עמודות לליטוף עצות סלקטיבי. עבור השלבים 1.3-1.7, לחץ על הגדרת שלב גלובלי בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות.
    1. באמצעות הגדרת שלב גלובלי , הגדר ערך = העמודה הראשונה למשתנה FirstColumn_Global, ערך = משפחה1 למשתנה LastColumn_Global, ערך = עמודה ראשונה בעמודה מרבית + 1 לעמודותמשתנה וערך = עמודות * 8 לבארותמשתנים.
    2. בחר בשלב ה- Script בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. הקלד את ה-VB script כפי שמצוין באיור 2.
  4. הגדרת אמצעי אחסון עבור מתערבב הגדרת פתרונות כוללים וכלליים.
    1. באמצעות ההגדרה שלב גלובלי , הגדר את הערכים המתאימים למשתני ערבוב אמצעי האחסון כפי שמוצג בטבלה 2.
    2. לחץ על הלחצן אם שלב בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. תחת תנאים, הקלד דוגם אוטומטי.
    3. תחת לאחר מכן, לחץ על הגדרת השלב הכללי בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותה לפעולת השירות.
    4. באמצעות ' קבע שלב גלובלי ', הגדר ערך =(mobilephase עמודות *)+ 10 כדי משתנה mobilephaseבאר.
    5. תחת אחר, לחץ על הגדרת השלב הכללי בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות.
    6. שימוש בקביעת השלב הגלובלי , הגדרת ערך = 0 למשתנה מובייל הוסבאר
  5. הגדרת תצורה של התקנה מודרכת לכלי (GLS)
    1. לחץ על השלב ' עורך הסיפון ' בסרגל הכלים תחת כלי שירות. צור חפיסה חדשה שיתאימו לפריסת החפיסה באיור 3 ותייג אותה כחפיסה 1.
    2. לחץ על שלב ההתקנה המודרכת בסרגל הכלים תחת ההתקנה & התקנים וגרור אותו לפעולת השירות. גרור ושחרר את סוגי עבדה אספקה בעמדות הסיפון כפי שמצוין בטבלה 3. לאחר מכן, מלא את הכרטיסיות בטבלה כפי שמוצג בטבלה 3 ובאיור 4 (הגדרת הכיוונון המודרך).
  6. הגדרת פרוצדורה עבור ספירת עצות
    1. לחץ על הגדרת שלב הפרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותה לפעולת השירות. הליך שמות כמונה עצות.
    2. לחץ על שלב ה-Script בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. הקלד את ה-VB script כפי שמצוין באיור 5 (קובץ script של ספירת עצות).
    3. לחץ על הלחצן אם שלב בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות.
    4. תחת תנאים, הקלד TL5 = 0.
    5. תחת לאחר מכן, לחץ על המהלך שלב labware בסרגל הכלים תחת התקנה & שלבי התקן שלבים וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה מ TL5 כדי TR3. לחץ על הזזת שלב Labware בסרגל הכלים, תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה מ TL2 כדי TL5. לבסוף, לחץ על העבר שלב Labware בסרגל הכלים תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה מ BC90 כדי TL2.
  7. הגדרת נוהל לחממה
    1. לחץ על הגדרת שלב הפרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותה לפעולת השירות. הליך שמות כחממה.
    2. הקלד במחצית כשמות משתנים ו- 1800 כערך ברירת מחדל.
    3. הקלד בטמפ ' הזמן הבא כשמות משתנים ו- 22 כערך ברירת מחדל.
    4. הקלד temp כשם משתנה ו- 60 כערך ברירת מחדל.
    5. לחץ על צעד Labware המשופר בסרגל הכלים תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה מ P11 כדי INHECO1.
    6. לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. הליך שמות כמונה עצות.
    7. לחץ על הצעד הנמצא בתוך הסרגל הכלים מתחת לתוספות וגרור אותו לפעולת השירות. סוג ב INHECO1 עבור השימוש במכשיר במיקום, = המחצית עבור מודטה עבור, = Temp עבור ° צ' ו 3 עבור ° c של טמפרטורת היעד. בחרו באפשרות ' טלטול ' ובסגנון הטלטול האורביטל (כיוון השעון). עבור הגדרות, הקלד 1.00 mm מצד לצד, 6.6 פעמים בשנייה, 1.00 mm העברת מודעות לאחור ו 6.6 פעמים בשניה.
      הערה: ודא כי תוכנת החממה INהאו מותקנת.
    8. לחץ על הצעד הנמצא בתוך הסרגל הכלים מתחת לתוספות וגרור אותו לפעולת השירות. סוג ב INHECO1 עבור השימוש במכשיר במיקום, = המחצית עבור מודטה עבור, = Temp עבור ° צ' ו 3 עבור ° c של טמפרטורת היעד. בחר את הניעור תוך כדי האפשרות לנער את סגנון הטלטול והכיוון האורביטל (נגד כיוון השעון). עבור הגדרות, הקלד 1.00 mm מצד לצד, 6.6 פעמים בשנייה, 1.00 mm הלוך ושוב ב 6.6 פעמים בשנייה.
    9. לחץ על שלב ההשהיה בסרגל הכלים תחת תוכנית ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. השהה את כל המערכת עבור 1 s.
    10. לחץ על הגדרת שלב הפרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותה לפעולת השירות. הליך שמות כחממה.
    11. לחץ על הצעד הנמצא בתוך הסרגל הכלים מתחת לתוספות וגרור אותו לפעולת השירות. סוג ב INHECO1 עבור השימוש בהתקן במיקום, 1 עבור מודל עבור, = השעה הראשונה עבור ° צ' ו 3 עבור ° c של טמפרטורת היעד.
  8. . הגדרת נוהל לאורביטל
    1. לחץ על צעד Labware המשופר בסרגל הכלים תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה מ P11 כדי Orbital1.
    2. לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר את ספירת העצות של השגרה.
    3. לחץ על שלב הפעולה של ההתקן בסרגל הכלים תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. בחר התקן OritalShaker0, מחיצת זמן פקודה. הזן מהירות לרעוד 1000, הזמן להגיע מהירות מלאה 2, זמן לנער 30.
    4. לחץ על צעד Labware המשופר בסרגל הכלים תחת ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. להעביר עבדה אספקה Orbital1 כדי P11.
  9. הגדרת התמהיל הראשון
    1. לחץ על הצעד בחירת עצה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות. בחר סידור מחדש של מיקום TL4.
    2. לחץ על הצעד הנמצא בתוך הסרגל הכלים מתחת לתוספות וגרור אותו לפעולת השירות. סוג ב INHECO1 לשימוש המכשיר במיקום, 1 עבור מודטה עבור, 60 עבור ° צ' ו 3 עבור ° c של טמפרטורת היעד.
    3. לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך שלב בחירת עצה. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    4. לחץ על השלב בחירת עצות לטעינת עצות בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות, בשלב הלולאה. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    5. לחצו על הצעד ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' תחת ' שלבי ניהול נוזלים ' וגררו אותה לשיטה, בשלב הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. הקלד ב-volume = התמהילהראשון, שליף בטור 1 ובשורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    6. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בשלב הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. סוג ב-volume = התמהיל הראשון, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    7. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בשלב הלולאה. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
  10. התקנת הדגימות
    1. לחץ על הלחצן אם שלב בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. הקלד סמלפלייט כתנאי.
    2. תחת לאחר מכן, לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינת טיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) בודדת והקלד = עמודותמסוג.
    3. לחצו על הצעד ' בחר עצות לגבי השלבים ' בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך אז. בחר Greiner96RoundPS סוג Labware ומיקום דגימות. הקלד באמצעי אחסון = מדגם, שולי העמודה הראשונה ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    4. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר BCDeep96Round Labware סוג ולוחית התגובה מיקום. סוג באמצעי אחסון = לדוגמה, מוותר על עמודה = עמודה ראשונה ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    6. לאחר סיום ה- If step, לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר באפשרות ' חממה '. הקלד במחצית כשמות משתנים ו- 1800 כערך ברירת מחדל. הקלד בטמפ ' הזמן הבא כשמות משתנים ו- 22 כערך ברירת מחדל. הקלד temp כשם משתנה ו- 60 כערך ברירת מחדל.
  11. הגדרת בלוק ציסטאין
    1. לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך שלב העצה בחר. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    2. תחת לולאה, לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינת טיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    3. לחצו על השלב ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' מתחת לצעדים באמצעות מענה נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. סוג בכרך = Cysteinemix, משבית בטור 2 ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    4. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round סוג Labware התגובה צלחת מיקום. סוג בכרך = Cysteinemix, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    6. לאחר סיום הלולאה If , לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי הבקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר באפשרות ' חממה '. הקלד במחצית כשמות משתנים ו- 300 כערך ברירת מחדל. הקלד בטמפ ' הזמן הבא כשמות משתנים ו- 43 כערך ברירת מחדל. הקלד temp כשם משתנה ו- 25 כערך ברירת מחדל.
  12. הגדרת התמהיל השני
    1. לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך שלב העצה בחר. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    2. תחת לולאה, לחץ על השלב בחירת עצות לטעינת עצות בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    3. לחצו על השלב ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' מתחת לצעדים באמצעות מענה נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. סוג בכרך = שניות לערבב, ומערבביםבטור 3 ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    4. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ולוחית התגובה מיקום. סוג באמצעי אחסון = שניות לערבב, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    6. לאחר סיום הלולאה If , לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי הבקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר פרוצדורה מסלולית.
    7. לחץ על שלב ההשהיה בסרגל הכלים תחת תוכנית ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. השהה את כל המערכת עבור 1 s.
  13. הקמת הוספת טריפסין
    1. לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך שלב העצה בחר. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    2. תחת לולאה, לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינת טיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    3. לחצו על השלב ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' מתחת לצעדים באמצעות מענה נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. סוג באמצעי האחסון = טריפסין, ומטה בטור 4 ובשורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    4. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ולוחית התגובה מיקום. סוג באמצעי אחסון = טריפסין, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    6. לאחר סיום הלולאה If , לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי הבקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר באפשרות ' חממה '. הקלד במחצית כשמות משתנים ו- 3600 כערך ברירת מחדל. הקלד בטמפ ' הזמנית כשמות משתנים ו- 25 כערך ברירת מחדל. הקלד temp כשם משתנה ו- 43 כערך ברירת מחדל.
    7. לחץ על הצעד הנמצא בתוך הסרגל הכלים מתחת לתוספות וגרור אותו לפעולת השירות. ודא שתוכנת החממה INהאו מותקנת. סוג ב INHECO1 לשימוש המכשיר במיקום, 1 עבור מודטה עבור, 25 עבור ° צ' ו 5 עבור ° צ' של טמפרטורת היעד.
  14. הגדרת מקוצ'ינג
    1. לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך שלב בחירת עצה. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    2. תחת לולאה, לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינת טיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    3. לחצו על השלב ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' מתחת לצעדים באמצעות מענה נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round Labware סוג ומיקום צלחת מגיב. סוג באמצעי אחסון = כיבוי, שליף בטור 5 ובשורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    4. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round סוג Labware התגובה צלחת מיקום. סוג באמצעי אחסון = כיבוי, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    6. לאחר סיום הלולאה If , לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי הבקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר את מסלולהפרוצדורה.
    7. לחץ על שלב ההשהיה בסרגל הכלים תחת תוכנית ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. השהה את כל המערכת עבור 1 s.
    8. לחץ על שלב ההשהיה בסרגל הכלים תחת תוכנית ההתקנה &Amp; שלבי התקן וגרור אותו לפעולת השירות. בחר השהה את המערכת כולה והצג הודעה זו. הקלד את ההודעה ' המשך אחרי צנטריפוגה '.
  15. הגדרת הצלחת עבור דוגם אוטומטי
    1. לחץ על ' אם שלב ' בסרגל הכלים תחת ' שלבי בקרה ' וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך השלב ' בחר עצה ' . הקלד מסמפלר אוטומטי כתנאי.
    2. תחת לאחר מכן, לחץ על שלב הלולאה בסרגל הכלים תחת שלבי בקרה וגרור אותו לפעולת השירות. הקלד col כמשתנה = העמודה הראשונה כהתחלה, = משפחהעמודה כסוף ו- 1 כתוספת קבועה.
    3. תחת לולאה, לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינת טיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC230 עצות, TL6 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) יחידה והקלד 1.
    4. לחצו על השלב ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' מתחת לצעדים באמצעות מענה נוזלי וגררו אותו לשיטה, בתוך הלולאה. בחר BCDeep96Round סוג Labware ומיקום לוחית מגיב. סוג ב-volume = Mobilephase, מותחת בטור 6 ובשורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    5. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך הלולאה. בחר Bio_RadPCR96 סוג Labware ומיקום לוחית זיהוי אוטומטי. סוג ב-volume = מובייל, מוותר על עמודה = col ו-row 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    6. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1.
    7. לאחר סיום הלולאה If , לחץ על שלב הפעלת פרוצדורה בסרגל הכלים תחת שלבי הבקרה וגרור אותו לפעולת השירות. בחר את ספירת העצותשל השגרה.
    8. לחץ על השלב בחירת עצות לטעינת עצות בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול בנוזלים וגרור אותו לפעולת השירות. בחר BC90 עצות, TL5 מיקום והTL2 גיבוי עצות מיקום מהתפריט הנפתח. בחר עמודה (ות) בודדת והקלד = עמודותמסוג.
    9. לחצו על הצעד ' בחירת עצות לטיפול בסרגל הכלים ' תחת ' שלבי ניהול נוזלים ' וגררו אותו לשיטה שבלולאה. בחר BCDeep96Round סוג Labware התגובה צלחת מיקום. הקלד את עוצמת הקול = העברת מעכל, העמודה הראשונה ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    10. לחץ על הצעד בחירת עצות לטיפים בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות, בתוך הלולאה. בחר Bio_RadPCR96 סוג Labware ומיקום לוחית זיהוי אוטומטי. הקלד בכרך = מוביילה-it, מוותר על עמודה = עמודה ראשונה ושורה 1. בחרו טכניקה ממוטבת מהתפריט הנפתח של הטכניקה.
    11. לחץ על הצעד בחירת עצות לטעינה בסרגל הכלים תחת שלבי טיפול נוזלי וגרור אותו לפעולת השירות בתוך אז. בחר באפשרות בטל טעינה של עצות ל-TR1. השלב של עצות הבחירה מסתיים כאן.
    12. שמור ושנה את שם השיטה.

2. להכין דגימה, labware, ו ריאגנטים

  1. העברה 5 μL של פלזמה אדם בריא במאגר לתוך פוליפרופילן, 96 בצלחת הבאר עמוק.
    הערה: ראה טבלת חומרים לריאגנטים ואספקה המשמשת בפרוטוקול זה. TPCK טיפל טריפסין נרכש ו טריפסין ליחס המצע וזמן דגירה היה מיטבי באופן ספציפי. אם כיתה שונה של טריפסין משמש, כגון כיתה רצף רקומביננטי טריפסין, האנזים ליחס המצע וזמן דגירה צריך להיבדק ואופטימיזציה.

3. הליכי ניתוח

  1. לחץ פעמיים על סמל התוכנה.
  2. תחת הכרטיסיה שיטה , בחר בבית כל הצירים כדי לכוון ולהכין את המטפל הנוזלי האוטומטי. ודא שכל מזרקים בתחנת העבודה אינם מכילים בועות אוויר גלויות.
  3. תחת קובץ, בחר באפשרות ' פתח ' | . שיטת השירות
  4. בחר את השיטה (איור 6).
  5. הפעל את השיטה על-ידי לחיצה על סמל הפעלה בצורת משולש ירוק.
  6. כדי שלוח אוטומטי יהיה מוכן בסוף השיטה, הזן את הערך ' true ' באפשרות ' הזן ערך לשימוש עבור ' שורת הפקודה ' דוגם אוטומטי ' ולאחר מכן לחץ על ' אישור'. אם לוחית הדוגם האוטומטית אינה מוכנה, הזן את הערך ' false ' ולאחר מכן לחץ על ' אישור'.
  7. הזן את הערך ' 1 ' בשורת הפקודה ' הזן ערך לשימוש עבור ' בעמודה הראשונה ' ולחץ על ' אישור'.
  8. הזן את הערך ' 12 ' בשורת הפקודה הזן ערך לשימוש עבור ' העמודה האחרון ' ולאחר מכן לחץ על אישור.
    הערה: שלב זה וצעד 4.7 מספרים לתחנת העבודה לבצע עיכול ב -12 עמודות של צלחת 96-באר, וכתוצאה מכך כל הבארות של הצלחת המשמשת לעיכול
  9. אם לוחית לדוגמה משמשת עם כרכים לדוגמה של לפחות 20 μL, הזן את הערך ' true ' באפשרות ' הזן ערך לשימוש ' בשורת הפקודה ' סמלילוח ' ולאחר מכן לחץ על ' אישור'. אם לא נעשה שימוש בצלחת לדוגמה, הזן את הערך ' false ' ולאחר מכן לחץ על ' אישור'.
    הערה: אם לא נעשה שימוש בצלחת לדוגמה, הוסף 5 μL של דגימה לכל אחד מתאים ללוח התגובות.
  10. בצע את ההוראות בחלון ' הגדרת מונחה לכלי ' ולחץ על ' המשך'.
    הערה: החלון הבא מתאר את הפריסה עבור "הלוח המיגיב" להיות מוכן (איור 7, טבלה משלימה 1). הכרכים הבאים יהיו מצוטט לכל אחת מתוך 8 בארות של עמודה אחת ב-1 mL עיגול עמוק 96-ובכן:
    טור 1:540 μL של התגובה מיקס 1.
    טור 2:50 μL של בלוק של Cysteine.
    טור 3:730 μL של מיקס התגובה 2.
    טור 4:130 μL של טריפסין.
    עמודה 5:130 μL של ' פתרון כיבוי '.
    טור 5:1090 μL של פתרון שלב נייד (אם המשתמש הוזן ' true ' בשלב 6).
  11. לחץ על הבא והחלון הבא מתאר את אמצעי האחסון המינימלי (20 μl) הדרושים למרכאות בלוח הדגימה. אם המשתמש הכניסה את הערך ' false ' לקבלת הבקשה הכרוכה בלוח המדגם (שלב 9), המשתמש יתבקש להוסיף בדוגמה 5 μL ללוח התגובות.
  12. לחץ על הבא.
    הערה: החלון הבא מראה שיש למקם תיבת קצה 90 μL ריקה בחפיסה האוטומטית של המטפל בנוזלים.
  13. לחץ שוב על הבא , הנחת הסיפון האוטומטי של המטפל הנוזלי כפי שצוין ומומחש (איור 8) כולל את הלוח מגיב, את הצלחת התגובה, את הצלחת לדוגמה, הלוח autosampler, 6 מלא 90 μl תיבות עצה, תיבת הקצה הריק 90 μl, ותיבת הקצה מלא 230 μl.
  14. לחץ על ' סיום ' כדי להתחיל בפעולת השירות.
    הערה: לאחר לחיצה על סיום, למשתמש אין אפשרות להגיע למטפל הנוזלי האוטומטי. זה יהיה "לשבור את הווילון האור" של המכונה ולעצור את המטפל נוזלי כאמצעי זהירות.
  15. ב להמשיך לאחר צנטריפוגה בקשה, לאחזר את הצלחת התגובה ואת צנטריפוגה אותו 30 דקות ב 3,000 סל ד.
  16. לאחר השלמת הצנטריפוגה, החזר את לוחית התגובה למטפל הנוזלי האוטומטי למיקום שבו היה לפני הצנטריפוגה ולחץ על המשך.
    הערה: המטפל בנוזל האוטומטי יעצור שוב כאשר פעולת השירות תושלם. אם המשתמש הוזן ' true ' לשלב 6, לאחר מכן ניתן להסיר את הלוח האוטומטי מתחנת העבודה ולהציב לתוך הדוגם האוטומטי של כלי כרומטוגרפיה נוזלי לניתוח.

4. ממדי מועד

  1. לפתור פפטידים על בעלי זרימה גבוהה הכוללת של a סי18 2.1 mm x 100 מ"מ, 3.5 יקרומטר עמודה עם קצב זרימה של 0.25 mL/min ומנותח בתוך מוטבע על ספקטרומטר המסה פי ארבעה משולשת מוט.
    הערה: לאחר העיכול פפטיד, המוקד LC-MSMS השיטה כדי לכמת פפטידים מדגימות רובוטית מוכן מתוארת בפירוט1 בעקבות תיאור קצר של LC-msms.
  2. הגדר את טמפרטורת תנור העמודה ל-40 ° c. השתמש במאגר A (2% acn, 98% מים, 0.1% פורמית חומצה) ו מאגר B (95% acn, 5% מים, 0.1% החומצה פורמית) כמו שני השלבים הניידים.
  3. העמודה באמצעות 5% B עבור 5 דקות לאחר הטעינה. אליוט הפפטידים מעל 30 דקות עם ליניארי 5% עד 35% הדרגתי של מאגר B.
    1. מחזר את העמודה לפני טעינת המדגם הבא על ידי שטיפת עם 98% B עבור 10 דקות ולאחר מכן 5% B עבור 5 דקות.
    2. לצורך הסחה מקוונת, הפנה את החומק שלאחר העמודה לבזבוז לפני שנכנס למקור היונים באמצעות שסתום מיתוג של שני שלבים.
  4. עבד את נתוני ה-MRM.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת ההכנה לדוגמה האוטומטית של פרוטקומניקס בתחנת העבודה האוטומטית הותאמה מהפרוטוקול האוטומטי הקודם שלנו בשיטת הרכישה האיתנה LC-SRM-MS1 ל-אלבומין, חלבון הפלזמה הנבחר, ו-β-גלטוסידאז (β-gal), חלבון אקסוגני המשמש לבקרת איכות. לאחר העיבוד, הדגימות הופעל על משולש פי ארבעה משולשת מוט-MS ב-שיטת SRM מיקוד הסרום אלבומין, β-גלטוסידאז. מקדם הווריאציה (CV) של אות SRM עבור כל מעבר שימש כדי לנטר את הצורה התוכונות של פרוטוקול העיכול האוטומטי.

אנו מאוטומטיים את התוספת הכימית וערבוב צעדים לעיכול של 5 מדגימות פלזמה μL עם טריפסין של 2 שעות הסיפון-החממה. כדי לקבוע את השגות, 5 μL של בריכת פלזמה היה מחבר בארות מרובות של צלחת התגובה עם ראש רב-ערוצית (96 סיכה). כדי לפקח על עקביות, הוספנו חלבון β-גל לפני הפחתת תגובות האלליציה. התהליך האוטומטי של ההכנה לדוגמה פרוטאומניקס נבדק בשיטת הרכישה החזקה LC-SRM-MS, כולל אלבומין, חלבון הפלזמה הגבוה ביותר, וחלבון β-gal, המשמש לבקרת איכות. שלושה פפטידים β-גל ו שני פפטידים אלבומין היו מנוטרים של חלבונים מעובד החלבון אלבומין ומחודדים β-gal חלבון (שולחן 4).

במאמץ לחסוך זמן ולפשט את ההליך, הפחיתו את הנוזל המעביר את השלבים של הוספה/ערבוב/דגירה של תערובת מגיב ותגובה עם תחנת העבודה מתוך זרימת עבודה של תשעה צעדים לזרימת עבודה של שישה שלבים (איור 1). זרימת העבודה פרוטמית הכולל היתה מורכבת משני רכיבים ניסיוניים: הכנה לדוגמה אוטומטית ו-LC-MS/MS. ראשית, הערכנו את הדיוק של LC-MS/MS הנתונים הרכישה על ידי שמונה זריקות רצופות מאותה עיכול היטב של הצלחת אוטומטית הדוגם. הדיוק של זרימת העבודה האוטומטית הכנה לדוגמה חושבה על-ידי אחוז מקדם הסטייה (% CV) של זרימת העבודה הכוללת של SROMIC מינוס% CV של ה-LC-MS/MS (איור 9ב). עם הליך העיכול יעיל פלזמה בתחנת העבודה האוטומטית, דיוק ניסיוני של הכנה דגימות אוטומטיות היה פחות מ 11.4% עבור אקסוגני β-גל חלבונים (10.0% כממוצע), ופחות מ 14.9% עבור החלבון הנפוץ ביותר אלבומין האנושי (9.9% כממוצע) (איור 9). עוצמות האות הטובות נצפו עבור חלבון האלבומין האנושי והβ-גל כצפוי (איור 9ג).

עבור כל צעד ליטוף העברת נוזלי, טכניקות היו אופטימיזציה במיוחד. כדי לנטר את הדיוק של העברת הצעדים הנוזליים, היינו מחודדים בתקנים מבוססי איזוטופ (SIL) בעלי התווית האנדוגניים של חלבון אלבומין ומβ-גל חלבון בשלושה שלבי העברת מגיב עצמאיים: התגובה מיקס 1, חוסם Cysteine, ו מיקס התגובה 2 (איור 10). אותות MRM מחמשת פפטידים SIL אלה נרכשו כדי לפקח על הדיוק של שלבי העברת נוזל אוטומטי. הממוצע% CV עבור פפטידים, DDNPNLPR ^, ו GDFQFNISR ^ (^ מייצג את N15 חומצה אמינית) מן התגובה ערבוב 1 צעד נע בין 1.8% כדי 11.2%. הממוצע% CV של פפטיד אחד (IDPNAWVER ^) מן חוסם Cysteine נע בין 6.6 ל 8.8%. הממוצע% CV של שני פפטידים (WVGYGQDSR ^) נע בין 6.2% כדי 11.9% (איור 10).

כדי לאמת את זרימת העבודה האוטומטית פרוטאומניקס לדוגמה, אנו הערכנו הנוזלוניים על פני מספר חלבונים ומספר ימים עבור אלבומין סרום אנושי, אקסוגני β – גל, ו 40 חלבונים נוספים פלזמה. הצלחנו לעבד 21שכפולדגימות (פלזמה במאגר אנושי רגיל), מיקום טוב המוצג באיור 11א, בשלושה ימים שונים. קורות חיים בתוך יום חושבו מ -21 בארות שהוכנו באותו יום. הממוצע היומיומי% קורות החיים עבור 40 חלבונים נע בין 4%-20% (איור 11ב). כדי להעריך את אפקט הקצה של זרימת העבודה האוטומטית המבוססת על הלוח,% CV חושב מבארות ספציפיות בתוך עמודות ושורות מוגדרות (איור 12A עבור מפת עמודה ושורה). העוצמות של אותות MRM היו דומות בכל תצורות הטורים והשורות עם% CV החל מ-3%-22% (איור 12ב').

לסיכום, זרימת העבודה האוטומטית הממוטבת מניבה 96 דגימות מעובדות בצורה אחידה תוך פחות מחמש שעות עם דיוק ניסיוני מעולה. עבור תאימות עם זרימת עבודה אוטומטית, בחרנו ריאגנטים כי יש זניח תופעות לוואי לא ספציפיות, הם יציבים באור הסביבה, הם LC-MS/MS ידידותית, והוא יכול להיות מאוחסן כמו הקפואים ali,.

figure-results-1
איור 1: סכימת זרימת העבודה של הכנת המדגם. 6 השלבים העיקריים בתהליך העברת הנוזלים מפורטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: עצה טעינת סקריפט. פרטי ה-VB Script מוצגים כאן. קובץ ה-script מציין תנאי טעינת קצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הרחבה אוטומטית של תחנת עבודה. החפיסה כוללת של 1x1 האלפים, טיפ טעינת האלפים, אשפה, שטיפת טיפים, פלטייר ואינקובטור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: מאפייני הלוחית הכימית. מוצגים הם המאפיינים הדרושים עבור לוחית מגיב עבדה אספקה בעת הגישה באמצעות ההתקנה מודרך עבדה אספקה. בחר את העמודה המתאימה והקלד את המשתנים כפי שמצוין באיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: תסריט ספירת טיפים. קובץ script זה מסייע לעקוב אחר מספר עצות בחפיסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: סקירה של השיטה לעיכול ומצטט דגימות פלזמה. שלבים לחישוב מגיב, התקנת עבדה אספקה ומניפולציות נוזלים בשיטת המטפל הנוזלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: פריסת הלוחית הכימית. מוצגים הם ריאגנטים כימי הדרושים לעיכול פלזמה הכנה אוטומטית ומופץ על פני הצלחת מגיב labware. איור זה שונה מפתק טכני10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 8: פריסת עבור עבדה אספקה על הסיפון של תחנת העבודה האוטומטית. מוצג הוא פריסת החפיסה עבור שיטת עיכול הפלזמה עבור המטפל הנוזלי. איור זה שונה מפתק טכני10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 9: הדיוק של זרימת העבודה פרוטמית הכוללת מורכב קורות חיים של תחנת העבודה ו-LC MS/MS קורות חיים.
חמישה פפטידים מ-β-gal ו אלבומין הפיקוח, כרומטוגרמות ו פפטיד זמן ההחזקה עבור כל פפטיד מוצג (א), דיוק נקבע מ 30 בארות/דגימות עיבוד מייצג, קורות חיים% עבור זרימת עבודה פרוטמית סה, הניתוח LC MS/ms ועיבוד לדוגמה אוטומטית שחושבו (ב). בסך הכל, פפטידים מתעכל הראה אותות טובים נע מ 1x105 עד 1x108. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10
איור 10: קביעת דיוק של שלבי העברת נוזלים. פפטידים סינתטיים היו מחודדים בשלב מסוים ריאגנטים, והעברת נוזל אוטומטי נקבע על ידי סך% CV. מ 30 בארות/דגימות ניסוי מינוס% CV LC MSMS (נקבע על ידי 8 לחזור על זריקות LC MSMS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-11
איור 11: מספר ימים של הצגת הזמן של זרימת העבודה לדוגמה פרוטמית אוטומטית עם 42 בדיקת MRM חלבון. (A) לוחית התגובה מפה עבור כל אחד משלושת הימים הוא להראות כאן, 5 μl פלזמה נוספה לכל אחד 21 בארות. 3 בארות שהתקבלו 5 מים שימשו כפקדים שליליים/ריקים. (ב) עוצמות ה190 הממוצעות של מעברים מורכבים מ-75 פפטידים ו 42 חלבונים (משמאל) ו-% CV עבור כל מעבר MRM חושבה מ -21 בארות העיכול עבור כל יום (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-12
איור 12: משוב של מיקומים ספציפיים של בארות (מיקום של עמודות ושורות). (A) עמודות ומיקום שורות עם מפת צלחת מוצגים כאן. (ב) מיקום שורה מציין אותות MRM ספציפיים של עוצמות ממוצעות מבארות שצוינו (משמאל) וקורות חיים% (מימין) מעיכול בודד לצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-13
איור 13: צילום מסך של עורך טכניקה. עבור כל תבנית Pipetting יטוף, להגדיר את המאפיינים של חישה ברמה נוזלית, זיהוי קריש, פירסינג, נוזל סוג, כללי, מנושף, לוותר, לערבב וכיול. התבנית והטכניקות המשמשות בפרוטוקול זה מוצגות בטבלה משלימה 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שתנהשתנהערךתיאור/
תעשיהבוליאנינכוןהשתמש בדוגם אוטומטי
בצלאלספר שלםמיכל 5כרך הבטאל
BG1ספר שלם0.8BG1 אמצעי אחסון
BG2ספר שלם0.8BG2 אמצעי אחסון
BG3ספר שלם0.8BG3 אמצעי אחסון
שטיינחוסמיספר שלם1.25כמות חוסם cysteine
מאגר כתמיםספר שלם0.45נפח מאגר ציסטיין
דאטוורנטספר שלםמיכל 5נפח דנאטנט
העברת מעכלספר שלם10נפח העברה לתקציר
המאגר הראשוןספר שלם25.9נפח מאגר ראשון
העמודה הראשונהספר שלם1העמודה הראשונה
HSA1ספר שלם0.8HSA1 אמצעי אחסון
HSA2ספר שלם0.8HSA2 אמצעי אחסון
טור מאחרוןספר שלם12העמודה האחרונה
מובייל ה. א. הספר שלם90נפח בפאזה ניידת
הרוותספר שלם10עמודת כיבוי
הסוכן המורדספר שלםמיכל 5הפחתת עמודת סוכן
דוגמהספר שלםמיכל 5העמודה ' דוגמה '
סמליצלחתבוליאנינכוןהשתמש בצלחת לדוגמה
מאגר שניותספר שלם58.4נפח מאגר שני
טריפסיןספר שלם10טריפסין

טבלה 1: משתני שלב התחלה

ערךשתנה
= מאגר ראשון + מBG1 + מHSA1תערובת ראשונה
= מBG2 כתמים + מאגר שקופיות +ציסטיישטייקס
= מאגר שניות + BG3 + HSA2מיקס שנייה
= (התמהיל הראשון * עמודות) + 30המיערבל הראשון
= (CysteineMix * עמודות) + 20ליבסטבאר
= (מיקס שניות * עמודות) + 10מערבל שניות
= (טריפסין * טורים) + 10טריסינבאר
= (כיבוי * עמודות) + 10קובצ'באר
= (מערבל לראשונה * 8) + 100המימלאי הראשון
* 8 + 20ציסטיישטיינמסטוק
= (שניות * 8) + 100שניות

טבלה 2: משתני שילוב אמצעי אחסון

סוגשםעמדהעומקאפייניהשתמש?
BCDeep96Roundלוחית מגיבP51 (למעלה)#= לא סמליפלייט
BCDeep96Roundלוחית מגיבP51 (למעלה)#= סמליצלחת
BCDeep96Roundלוחית תגובהP111 (למעלה)נכון
Bio_RadPCR96 *דגימותP91 (למעלה)= סמליצלחת
Bio_RadPCR96 *הלוח ' דוגם אוטומטי 'P101 (למעלה)= דוגם אוטומטי
BC90ריק1 (למעלה)נכון
BC901 (למעלה)נכון
BC901 (למעלה)נכון
BC2301 (למעלה)= דוגם אוטומטי
BC901 (למעלה)= טורים > 1
BC901 (למעלה)= טורים > 3
BC901 (למעלה)= טורים > 5
BC901 (למעלה)= טורים > 7
BC901 (למעלה)= טורים > 9
הערה
*: מתאים 96 הטוב ביותר ביו-ראד צלחת.
: לחץ על מאפיינים ולאחר מכן הזן את משתני אמצעי האחסון כפי שמצוין באיור 6.

שולחן 3: הגדרת הכיוונון המודרך

חלבון ID רצף פפטידמיסת Q1 (Da)מיסת רבעון 3 (Da)זמן (מזערי)קטע יוןפוטנציאל לשרתאנרגיית התנגשותתא התנגשות יציאה פוטנציאלית
התקן התקן | P00722 | BGAL_ELOCIמיכל שפיר542.3262.119.7+ 2y261218
542.363619.7+ 2y5612512
542.3764.219.7+ 2y6612518
מיכל כנעני550.3436.118.1+ 2y7 + 261238
550.3871.218.1שישי השביעי612518
550.3774.218.1+ 2y661338
מיכל שוונגאר534.3782.112.1שישי השביעי51256
534.3562.112.1+ 2y551276
534.2505.212.1+ שנייה90258
התקן התקן | P02768 | ALBU_HUMANמיכל הגלעדי470.8596.29.2+ 2y5612716
470.8499.39.2+ שנייה612718
470.8710.49.2+ 2y6612718
LVNEVTEFAK575.3694.418.2+ 2y673.129.618
575.3937.518.2שמונה בתים73.129.618
575.3823.418.2שישי השביעי73.129.618

שולחן 4: פרמטרי MRM

טבלה משלימה 1: הצלחת מגיב אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן.

טבלה משלימה 2: תבנית פרוטוקול אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיבוד לדוגמה לספקטרומטר מסה דורש הדנטורציה של חלבונים, הפחתה והאלדילציה כדי לחסום את הציסטנים, וטריפסין העיכול לקליב חלבונים לתוך פפטידים. כל תגובה כימית או אנזימטית צריכה להיות מאותחלת בזמן ייעודי ומבוצעת בטמפרטורה מבוקרת, וכל צעד בתהליך כרוך בצעדים מרובים של העברת נוזלים שבהם ניתן להציג וריאציה ניסיונית. עיבוד לדוגמה אוטומטי מספק פתרון לדילמה זו. כיום זמין מערכות טיפול נוזלי יש את היכולת להעביר ריאגנטים לתוך 96-היטב צלחות עם דיוק ודיוק של פחות מ 5%, בהתאם לראש וסוג טיפ בשימוש, וכלה בדגימות דגירה, עם טלטול במידת הצורך, תחת טמפרטורות מבוקרת הנע בין 14 ° צ' ל 70 ° c. השתמשנו במטפל נוזלי אוטומטי כדי לעבד פלזמה עבור srm בחני בפורמט 96.

ישנם אלפי אתרי מחשוף הפרוטאז בתוך תערובות מורכבות של חלבונים בסרום, פלזמה, ודגימות ביולוגיות אחרות; וכל אחד מחלבונים אלה יש מאפיינים ייחודיים המשפיעים על נגישות אתר המחשוף ואת היציבות של הפפטידים הנובעים. לכן, אי אפשר לעצב תהליך עיבוד לדוגמה אופטימלי לכל חלבון. החלופה הטובה ביותר. היא להיות עקבית ככל האפשר

כדי להשיג עקביות, היינו ממוטבים לכל צעד שבוצע על ידי המפעיל הנוזלי האוטומטי. לראשונה שקלנו את אמצעי האחסון הנדרש ואילוצים המוטלים על ידי סוג של נוזל (פלזמה, מים, או אורגני) ומאפיינים המקביל (צמיגות, לכידות, ותנודתיות), חומרה (תחנת עבודה ליטוף ראש וצלחת לתפוס זרועות), ו labware. לאחר מכן השתנו המהירות והפער האווירי הנגרר לשאיפה, המהירות ונפח ההתפרצות לחילוק, והכוח והמשך של ערבוב, תוך שילוב של מגע התשר לאחר שאיפה ו/או מחלק, במידת הצורך, כדי לסלק נוזלים הקפדה על החלק החיצוני של הטיפים (איור 13, תוספת טבלה 1) פפטיד SIL ייחודי, מראש הוקרן ליציבות, היה מחודדים לכל מגיב כדי לאפשר לעקוב אחר הדיוק של כל שלב טיפול נוזלי. לאחר האופטימיזציה, תהליך קורות החיים עבור רוב המעברים היו פחות מ 10%, הפגנת השגות טוב עם תחנת העבודה האוטומטית (איור 9, איור 10, איור 11 ואיור 12).

זרימת העבודה האוטומטית המוצגת כאן מספקת את העיכול האנזימטי העקבי באמצעות שיפור ותפוקה משופרות בהשוואה לשיטות ידניות (איור 9, איור 10). גישה זו מבטיחה לשפר את הדיוק והמהימנות של גילוי ביומיקר ואימות באמצעות ספקטרומטר מסה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פלזמה אנושית בריאה מאוגדתBioreclamation Inc.פלזמה אנושית נבדקה בכתב היד
Acetonitrile, HPLC GradeThermo Fisher ScientificA998SK1LC MS / MS ממס
B-Galactosidase רקומביננטמחלבוני בקרה אקסוגנייםSigma-AldrichG3153-5MG
תחנת עבודה אוטומטית Biomek i7בקמן קולטר, בע"מתחנת העבודה להכנת דגימה פרוטאומית: תחנות העבודה האוטומטיות של Biomek אינן מיועדות או מאומתות לשימוש באבחון מחלות או מצבים אחרים
Biomek i-Series Tips 230µ L בקמן קולטר לא סטרילי"מB85903 טיפים, i7 מתכלה
טיפים 90µ מסדרת Biomek i; L בקמן קולטר לא סטרילי"מB85881 טיפים, i7 מתכלה
FG, ערכת Trypsin TPCKSciex4445250טריפסין המשמש בעיכול
צלחות PCR קשות 96 בארות, פרופיל נמוך, קיר דק, חצאית, ירוק/שקוף Bio-Rad#hsp9641צלחת דגימה אוטומטית
Octyl B-D-GlucopyranosideSigma-AldrichO9882-5Gחומר ניקוי המשמש לעיכול
פוליפרופילן, צלחות באר עמוקות 96 עגולות סטריליותBeckman Coulter, Inc.267007 מגיב ולוח עיכול
בולטות UFLCXR מערכת HPLCShimadzu, יפןזרימה גבוהה LC sytem
QTRAP 6500SCIEXספקטרומטר מסה
מים, HPLC כיתהתרמו פישר מדעיW54LC MS / MS ממס
Xbridge BEH30 C18 2.1 מ"מ x 100 מ"ממים186003564LC MSMS עמודה
E.Coli . בע בע

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Q., et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  2. Lehmann, S., et al. Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold? Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).
  3. Abbatiello, S. E., et al. Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).
  4. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).
  5. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
  6. Yates, J. R. 3rd Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).
  7. Nilsson, T., et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).
  8. Van Eyk, J. E., Sobhani, K. Precision Medicine. Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).
  9. Hoofnagle, A. N., et al. Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays. Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).
  10. Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series. Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LC MS96

מאמרים קשורים