הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז

7.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59926

⸱

25 ביוני 2019

 , 
1Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מהירה בעלות נמוכה לוציפרראז בחני בתפוקה בינונית באמצעות העברת אינסולין מקושרת של גאוסיה לוציפראז כפרוקסי עבור הפרשת אינסולין מתאי בטא. ניתן לבצע את האפשרות עם מרבית קוראי הצלחות והפיפטות רב ערוצית.

תקציר

ביצוע נוגדנים מבוססי נוגדן עבור אוסף המופרש לאחר הדגימה לאחר מכן דורש בדרך כלל כמה שעות עד יום של זמן הצורך והוא יכול להיות יקר, בהתאם לצורך הספציפי. לוציפראז מופרש מזרז את התוצאות ולהקטין את עלות הכדאיות לכל מדגם באופן משמעותי. כאן אנו מציגים גישה בשימוש מועט יחסית כדי לאמוד פעילות הפרשה אינסולין מתאי β הלבלב באמצעות Gaussia לוציפראז מוכנס גנטית בתוך C-פפטיד. במהלך העיבוד האנטי-נגד-חרדה של הפרואינסולין, הג-פפטיד משחרר את הלוציפראז בתוך הפרשת האינסולין ושלפוחית האנרגיה שבה הוא מופרש עם אינסולין. תוצאות ניתן לקבל בתוך דקות לאחר איסוף המדגם בגלל המהירות של לוציפראאז assays. הגבלה של התשובה היא שזהו מדידה יחסית של הפרשת אינסולין ולא כימות מוחלטת. עם זאת, פרוטוקול זה הוא חסכוני, מדרגי, וניתן לבצע באמצעות מרבית קוראי לוחיות האור הרגילות. פיפטות אנלוגי ודיגיטלי רב ערוצי להקל על מספר שלבים של השיטת. ניתן לבדוק במקביל וריאציות נסיוניות רבות. לאחר מערכת ממוקדת של תנאים הם החליטו על, ריכוזי אינסולין צריך להיות נמדד ישירות באמצעות נוגדן מבוסס בחני עם עקומות סטנדרטיות כדי לאשר את תוצאות שיטת ללוציפראז.

מבוא

השיטה המוצגת כאן מאפשרת הפרשת אינסולין מקו בטא שונה גנטית להיות מוכן במהירות ובאופן בלתי נשכח בפורמט 96-היטב-צלחת. המפתח לפרוטוקול זה הוא גרסה משתנה של אינסולין עם הגאוסיה המופרש באופן טבעי (gluc, ~ 18 kda) הוכנס ( ראה איור 1) לתוך ה-C פפטיד כדי ליצור אינסולין-גאוסייה (insgluc)1,2. חלבונים גדולים אחרים, כגון gfp (~ 25 kda), הוכנסו בהצלחה לתוך C-פפטיד של אינסולין והציגו את העיבוד לאחר הניתוח הצפוי מתוך proinsulin-gfp לאינסולין ו gfp-C-פפטיד3,4. עבור הצורך בפרוטוקול זה, gluc כבר ממוטב codon עבור ביטוי היונקים ושני מוטציות הוצגו כדי לשפר זוהר כמו הקינטיקה5,6. ניתן לבדוק בקלות צירופים מרובים ושכפול של תנאי טיפול בתבנית 96-היטב, וניתן לקבל את תוצאות ההפרשה מיד לאחר הניסוי.

יתרון מרכזי, כפי שצוין בעבר2, הוא העלות הנמוכה של מדידה זו הפרשה מבוסס לluciferase (< $0.01/טוב) אשר מבדיל אותו מן העלויות הגבוהות יחסית והיבטים טכניים של חיסוני מקושרים אנזים בחני (אליאס) ( > $2/ובכן) ו-פלואורסצנטית הומוגנית בזמן (HTRF) או אחרים Förster העברת אנרגיה (מבוסס) נוגדן (> $1/ובכן) assays. בהשוואה לאלה המבוססים על נוגדנים, אשר למדוד את הריכוז של האינסולין על ידי התייחסות עיקול סטנדרטי, שיטת InsGLuc מודד פעילות הפרשה כהשוואה יחסית לשלוט בארות על הצלחת. מסיבה זו, כל ניסוי דורש הכללה של שליטה נאותה. הבחנה זו היא עסקת חליפין כדי לאפשר מדידות מהירות וזולה. עם זאת, הפרשת insgluc הוכח להיות מתואם מאוד עם הפרשת אינסולין כפי שנמדד על ידי אליסה1,2. טכנולוגיה זו הפכה להיות מדורגים עבור הקרנת תפוקה גבוהה1,2,7 והובילה לזיהוי של מודולים הרומן של הפרשת אינסולין כולל מעכבי מגודרת מתח תעלת אשלגן7 כמו גם מעכב מוצר טבעי של β cell פונקציה, Chromomycin a28. השימוש ב-InsGLuc הוא המתאים ביותר עבור חוקרים המתכננים לבחון ללא הרף תנאי טיפול שונים להשפעה שלהם על הפרשת אינסולין. בניסויים מעקב יש צורך לחזור על ממצאים מרכזיים בתוך קו β הורים, ובצורה אופטימלית באיים מוריים או בני אדם, ולמדוד הפרשת אינסולין באמצעות שיטת נוגדן מבוססת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים, מדיה ומאגרים (שולחן 1)

  1. הכנת MIN6 מדיה מלאה ב 500 mL של גלוקוז גבוה (4.5 g/L) בינונית שונה של הנשר של Dulbecco (Dמאמ) עם התוספים הבאים: 15% סרום של העובר (FBS), 100 יחידות/מml 100, מסטרפטומיצין μg/mL, 292 μg/מ"ל L-גלוטמין, ו 50 μM . β-מרקפטואתנול
    הערה: קו התאים היציבים במקרה זה מתוחזק ב250 μg/mL של אנטיביוטיקה G418.
  2. הכינו את ביקרבונט מאגר Krebs-צלצול (KRBH) על-ידי ביצוע פתרון המכיל 5 מ"מ KCl, 120 מ"מ הייגל, 15 מ"מ HEPES (pH 7.4), 24 mM נחקו3, 1 מ"מ MgCl2, 2 מ"מ cacl2, ו 1 מ"ג/mL-מבצע רדיוחיסוני כיתה בכיתה סרום אלבומין. גלוקוז יש להוסיף היכן שצוין מ 2 מניות M.
    הערה: KRBH משמש לדגירה את התאים עם וללא גירוי כדי להעריך אינסולין ו/או הפרשה של גאוסייה לוציפראז.
  3. הכינו את התמיסה של קומרכאזין (CTZ) כדלקמן. הכן acidified מתנול על-ידי הוספת 106 μL של HCl מרוכזת ל-10 mL של מתנול. לאחר מכן, התמוססות CTZ ב-acidified מתנול ב 1 מ"ג/mL ולאחסן ב-80 ° c ב-בורג צינורות כובע.
    הערה: מניות אלה לשמור על פעילות מספקת לוציפראז שגרתי, גם לאחר 1 שנה של אחסון נאות.
  4. הכינו את גאוסיה לוציפראז (GLuc) מאגר הנתונים המבוסס על ספרות9 , כמו גם פטנט מידע10 כדי לסייע במחצית החיים של שיטת Gauferase של גאוסייה ב 96 בפורמט צלחת לוחית. השתמש בנוסחה: 25 מ"מ מסנן טריס pH 8, 1 מ"מ EDTA, 5% גליצרול, 1 מ"ג/mL Na2פו4, 300 מ ל נתרן Ascorbate, 200 mm na2כל כך3 במים. הקפאת מניות ב-20 ° c. לאחר הפשרה, לאחסן את המאגר ב 4 ° c.
  5. כדי להכין את הפתרון העבודה של Gauferase, להוסיף 4.2 μL/mL של 1 מ"ג/mL (2.36 מ"מ) מניות CTZ פתרון מאגר שיטת GLuc. זה התוצאות בפתרון עבודה 2x של 10 μM CTZ אשר יהיה הריכוז הסופי של 5 μM בבחינה.

2. תרבות של InsGLuc MIN6 תאים וזריעה לפרשת הפרשה

  1. לתרבות MIN6 תאים, טריזיסיזציה וזרע התאים פעם בשבוע באמצעות טכניקות רגילות של תרבות התא. שינוי מדיה בתאים כל 2-3 ימים. כלול אנטיביוטי בחירה מתאים, כגון 250 μg/mL של G418 במדיה.
    1. כדי לספק מספר מספיק של תאים שבועי לניסויים, לשמור על התאים ב T75 צלוחיות. זריעת 6 x 106 תאים לכל T75 ב 10 מ ל של המדיה תניב בדרך כלל 30 x 106 כדי 40 x 106 תאים סך לכל T75 לאחר 7 ימים של תרבות.
  2. כדי להכין תאים לציפוי לתוך 96-טוב צלחות, לשטוף confluent T75 של InsGLuc MIN6 תאים פעמיים עם PBS ולהוסיף 2 מ ל טריפסין. מודקון ב 37 ° צ' עבור ~ 5 דקות או עד התאים הנתק מן הבקבוקון. קבע את ריכוז התא למילי-ליטר.
    1. לדלל את התאים במדיה המלאה 1 x 106 תאים/mL כדי לגרום 1 x 105 תאים ב 100 μl לכל טוב ב-96-באר צלחת. התאים צריכים להיות מאוד מספקת לצורך שיטת החיבור לאחר 3 – 4 ימים.
      הערה: כדי להאריך את תקופת התרבות, ניתן לציפוי מחצית מריכוז התא. שינויי מדיה אינם נדרשים לפני יום הטיפול, אלא אם כן התאים חשופים לטיפולים ניסיוניים.

3. גלוקוז-גירוי הפרשת גאוסיה לוציפראז

  1. ביום המנה מכינים מספיק KRBH לניסוי (שלב 1.2). מינימום של 50 mL של KRBH per 96-ובכן הצלחת נדרש, ולכן להכין לפחות 75 mL כדי להבטיח מספיק מאגר עבור הניסוי. הכינו מאגר נוסף, אם צירופים שונים של תנאי טיפול בסמים ידרשו KRBH לדילול.
  2. הכינו מאגר מים ללא גלוקוז. Decant המדיום מ 96-ובכן צלחת (s) על ידי היפוך במהירות את הצלחת מעל כיור מעבדה ולאחר מכן למחוק בחוזקה על ערימת מגבות נייר כדי להסיר עודף בינוני.
  3. באמצעות צינורות אלקטרוניים או ידני של 8 ערוצים, פיפטה 100 μL/ובכן KRBH מן המאגר על פני הצלחת 96-באר (s). חזור על הסכום הכולל של שתי שטיפות.
  4. (צעד אופציונלי של טיפולים בתרכובת חריפה) אם לא ביצוע טיפולים בסמים, המשך בשלבים 3.5 ו-3.6 ללא שינוי. כדי לבחון את ההשפעות של מולקולות קטנות על הפרשת אינסולין, ניתן להוסיף תרכובות לתאים במהלך תקופת הדגירה המוקדמת, תקופת הגירוי, או שניהם.
    1. טכניקה אחת היא להוסיף תרכובות אצווה כדי KRBH ב 1.5 mL ולהשתמש בצינורות הניתנים להתאמה דיגיטלית 8 ערוצים כדי להעביר את התרופה-KRBH מן הצינורות לתאים ב 96-באר צלחות.
      הערה: אם הצינור הניתן לכוונון אינו זמין, עותק משוכפל 96-ובכן צלחת של סמים-KRBH ניתן לעשות ומתקן שמונה ערוצים סטנדרטי ניתן להשתמש כדי להעביר את המאגר. שינויים נוספים בפרדיגמת הטיפול ניתן לטפל בתאים במשך 24 שעות במדיה לפני התיתינה, כפי שמתואר בעבר1,8.
  5. הוסף 100 μL של KRBH המכיל את הריכוז הרצוי של גלוקוז או תרכובות ומניחים את המנה בחממה 37 ° c עבור 1 h.
    הערה: בהתאם לפריסה הניסיונית, היא מועילה מאוד לקבל מעבר של צינור רב ערוצי אלקטרוני המאפשר מעבר מיגדרי של הערוץ מטור של שמונה 1.5-mL לשמונה שורות של צלחת 96-באר.
  6. לאחר השעה 1 של הדגירה המוקדמת, לחזק את המאגר לתוך הכיור ולמחוק בחוזקה על מגבת נייר. הוסף 100 μL של גלוקוז חינם KRBH לכל טוב לשטוף את הרקע שנצבר של הלופראז גאוסייה. Decant הצלחת שוב ולהוסיף שליטה ומגירוי תנאים לצלחת ב 100 μL לכל טוב. מניחים את הצלחת באינקובטור 37 ° c עבור 1 h.
  7. לאסוף בקפידה 50 μL של supernatant באמצעות מצפטה רב-ערוצי, שינוי טיפים בין תנאי טיפול לפי הצורך, ולהעביר את supernatant לנקות אטום לבן אטומה ל96 בנת היטב.
    הערה: לוחיות השפל של הקירות הלבנים ברורים ניתן להשתמש אם יש צורך, למרות כמות משמעותית של אות לוציפראז יאבדו.
  8. לאחר איסוף של 50 μL של KRBH supernatant, המדגם יכול להיות מיידי. במקרה הצורך, לחתום ולאחסן דגימות ב -4 ° c לכמה ימים (פעילות gluc מחצית חיים ~ 6 ימים) או-20 ° c עד חודש אחד11,12.

4. הסדר הלוציסייה המופרש

  1. כדי להכין את הפתרון העובד העבודה GLuc, פיפטה את הכמות הנדרשת של פתרון מלאי CTZ (4.2 μL/mL) לתוך מאגר שיטת GLuc. כדי למנוע התחממות CTZ, הצינורות במהירות ב-80 ° c מקפיא או לשמור את הצינור על קרח יבש.
  2. באמצעות הצנרת האלקטרונית רב-ערוצי, להוסיף במהירות 50 μL של הפתרון העבודה GLuc לעבוד גם על פני הצלחת 96-באר המכילה את KRBH supernatants שנאספו. אם יש טיפות על הצדדים של בארות כלשהן, לקצר לסובב את הצלחת בצנטריפוגה הנדנדה השולחן הראש התנופה.
  3. קרא את האור בקורא צלחת מתאים בתוך כמה דקות ולקרוא כל טוב עם זמן אינטגרציה 0.1 s.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי למדוד את הביצועים של הקבוע תחת תנאי בקרה, מינון פשוט של התגובה הגלוקוז במינון או גירוי באמצעות הפרדיגמה diazoxide ניתן להשלים. במקרה של לשעבר, מראש לקדם את התאים עבור 1 h בתנאים ללא גלוקוז ואחריו טיפול עבור 1 h עם ריכוזי גלוקוז הגוברת צריך לגרום לפעילות הפרשה מעט מאוד ב-5 מ"מ, בעוד הפרשה מוגברת נצפתה מעל 8 מ"מ גלוקוז (איור 2). גירוי עם 35 mM KCl גם משמש כשליטה חיובית על הפרשה מגורה. הכללת הפרשה-תרופות מאופפות במהלך תקופת הגירוי צריכה לתת את העיכוב הצפוי א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מציגים שיטה להעריך במהירות גלוקוז מגורה הפרשות אינסולין תגובות מתאי MIN6 β. לקבלת התגובות הטובות ביותר בסדר זה חשוב לזרוע את התאים MIN6 בצפיפות הנכונה ולאפשר להם להפוך 85-95% confluent. זה משפר את התגובות β cell לגלוקוז בגלל שיפור תא הקשר וסינכרון התאים, אשר מתרחשת הן באיים הראשיים17,18,19,20,21 , כמו גם MIN6 תאים16,<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים מודים לכל החברים הנוכחיים והקודמים במעבדת קוב לעבודה ולדיונים יקרי ערך, ולדיון וואר לסיוע מינהלי. מיכאל קאלוואט נתמך על ידי קרן המחקר לסוכרת קטינים סרה-2019-702-Q-R. עבודה זו נעשתה אפשרית דרך NIH R37 DK34128 ו וולש קרן גרנט I1243 למלאני קוב. חלקים מוקדמים של עבודה זו היו נתמכים גם על ידי NIH F32 DK100113 למייקל קאלוואט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חומרי תרבית תאים חזקים>
rIns-GLuc תאיקו תאים הורי MIN6 המבטא ביציבות pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc ומתוחזק ב-250 ug/ml G418
DMEMSigmaD64294.5 גרם/ליטר מדיה גלוקוז
סרום בקר עוברי, סיגמאF4135
/ StreptomycinThermo-Fisher ScientificSV30010
בטא-מרקפטואתנולThermo-Fisher ScientificBP 176-100
גלוטמיןThermo-Fisher ScientificBP379-100
Trypsin-EDTASigmaT3924-500
G418Gold BiotechnologyG418-10תמיסת מלאי 250 מ"ג/מ"ל במים. הקפיאו מינויים ב-20 מעלות צלזיוס.
צלוחיות תרבית רקמות T75פישר סיינטיפיק07-202-000
96 צלחות תרבית רקמות בארCelltreat229196
מאגרי ריאגנטים (50 מ"ל)קורנינג4870
<חזק>שם<חזק>חברה><חזק>מספר קטלוגי<חזק>תגובות
<ריאגנטים לבדיקת הפרשה חזקים>
BSA (דרגת RIA)Thermo-Fisher Scientific50-146-952
D-(+)-גלוקוזסיגמאG8270-1KG
KClThermo-Fisher ScientificP217-500
NaClThermo-Fisher ScientificS271-3
Hepes, pH 7.4Thermo-Fisher Scientific50-213-365
NaHCO3>Thermo-Fisher Scientific15568414
MgCl2Thermo-Fisher ScientificM9272-500G
CaCl2SigmaC-7902
NameCompanyמספר קטלוגיComments
>תרופות אופציונליות לניסויי גירוי
DiazoxideSigmaD9035תמיסת מלאי: 50 מ"מ ב-0.1N NaOH. הוסיפו כמות שווה של 0.1N HCl לכל חוצץ שבו מוסיפים דיאזוקסיד.
אפינפרין (מלח ביטרטרט)SigmaE4375תמיסת מלאי: 5 מ"מ במים
PMA (phorbol 12-myristate)SigmaP1585תמיסת מלאי: 100 µ M ב-DMSO
strong>NameCompanyCatalog NumberComments
>Guassia assay materials
Disodium phosphate (Na2HPO4)Thermo-Fisher ScientificS374-500
גליצרולתרמו-פישר סיינטיפיקG334
נתרן ברומידתרמו-פישר סיינטיפיקAC44680-1000
EDTAתרמו-פישר סיינטיפיקAC44608-5000תמיסת מלאי: 0.5 M pH 8
Tris baseRPIT60040-1000.0תמיסת מלאי: 1 M pH 8
חומצה אסקורביתפישר סיינטיפיקAAA1775922US7718389 פטנטים בארה"ב טוען כי אסקורבט יכול להגביר את יציבות הקואלנטרזין.
Na2SO3SigmaS0505-250Gפטנט ארה"ב US8367357 מוצע סולפיט עשוי להפחית את הרקע עקב BSA
Coelenterazine (מקורי)Nanolight / Prolume3035MGתמיסת מלאי: 1 מ"ג/מ"ל ב-MeOH מחומצן (2.36 מ"מ)
OptiPlate-96, לבן אטום 96-בארות MicroplatePerkin Elmer6005290כל צלחת לבנה אטומה של 96 באר אמורה להספיק. לוחות תחתונים שקופים יעבדו גם הם, אולם חלק מהאות יאבד.
שםCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Synergy H1 קורא צלחות היברידי או שווה ערךBioTek8041000נדרש קורא צלחות עם זיהוי זוהר ויכולות צלחת 96 בארות.
פיפטת VOYAGER 8 ערוצים (50-1250 ומיקרו; L)Integra4724פיפטה רב-ערוצית אוטומטית שימושית ביותר להוספה מהירה של ריאגנטים לוציפראז ותאי ציפוי בפורמט 96 בארות
8 ערוצים 200 ומיקרו; L פיפטהטרנספרפט S 20-200 ומיקרו; L2703710
MIN6 יציבים פניצילין מומת בחום<

מקורות

  1. Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
  2. Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
  3. Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
  4. Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
  5. Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
  6. Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
  7. Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , WO2018175324A1 (2018).
  8. Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
  9. Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14(2014).
  10. Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
  11. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
  12. Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
  13. Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
  14. Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
  15. Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
  16. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  17. Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
  18. Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
  19. Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
  20. Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
  21. Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
  22. Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
  23. Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  24. Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835(2018).
  25. Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
  26. Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
  27. Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

C peptideELISA
מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.