מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
הגדרת מנגנוני הסלולר שבבסיס המחלה חיונית לפיתוח therapeutics הרומן. אסטרטגיה המשמשת לעתים קרובות לפענח מנגנונים אלה היא להחדיר מוטציות בגנים המועמדים ולתאר באופן איכותי שינויים במבנה של רקמות ומרקלים סלולריים. עם זאת, תיאורים איכותניים לא יכולים ללכוד הבדלים עדינים, אולי באופן שונה וריאציות פנויואיות על פני אנשים באוכלוסיה, והם מוערך לעתים קרובות סובייקטיבי. כאן, גישות כמותיים מתוארות כדי ללמוד את המבנה של רקמות ואורגלים באלאואודה caenorditis באמצעות סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בשילוב עם תוכנות ביולוגיות זמינות מסחרית עיבוד. ניתוח כמותי של פנוטיפים המשפיעים על שלמות הסינפסה (גודל ורמות זריחה משולבת), פיתוח שרירים (גודל תא השריר ואורך הפילמנט רירן), ומורפולוגיה מיטוכונדריאלי (מעגליות וגודל) בוצעה כדי להבין ההשפעות של מוטציות גנטיות על אלה מבנים סלולריים. גישות כמותיים אלה אינן מוגבלות ליישומים המתוארים כאן, שכן ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את המבנה של רקמות אחרות ואורגלות בתוך הנימטודה, כמו גם באורגניזמים אחרים במודל.
מבוא
האלמטדה (האלאים) מנוצל יותר ויותר כמערכת מודל לחשיפת התהליכים הביולוגיים והמולקולריים המעורבים במחלות אנושיות. נמטודות מבוגר יש אורך הגוף של רק מעל 1 מ"מ, והוא יכול לייצר דגירה גדולה של עד 300 ביצים1. לאחר בקיעה, הג דורשים רק 3-4 ימים כדי להגיע לבגרות, ולחיות במשך כ 2-3 שבועות2. בשל קלות התפירה, הג הוא אחד המבוקשים ביותר בדגמי בעלי חיים vivo לביצוע הקרנת סמים מהירה וחסכונית כדי לזהות therapeutics למחלות אנושיות. בנוסף, שימור גנטי שלה, הגדרה התנהגות היטב, גוף שקוף עבור מיקרוסקופ אור פלואורסצנטית או קל, וקלות של מניפולציה גנטית להפוך את המחקר של ההשלכות הסלולר והמולקולריים של מוטציות ג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. צמיחה ואחזקה של C. אלגיה זנים
- זרעים Nematode צמיחה בינונית (NGM, לראות את הטבלה חומרים) אגר צלחות עם 300 μl של החיידק הגדל איטי OP50 זן בארון זרם למינארי.
- השאירו את לוחות NGM אגר בארון הזרימה למינארי להתייבש.
הערה: בהיעדר ארון זרימה למינארי, ניתן להשאיר צלחות להתייבש על הספסל, אך הן נוטות יותר לזיהום. - העברה לפחות 20 בעלי חיים לכל אחד משני OP50-שופרה לוחיות העבודה של NGM אגר כדי להיות מניות עובד. יש שתי דרכים עיקריות. להעביר בעלי חיים
- לקטוף: להרים בעדינות את החיות באמצעות בחירת חום מעוקר. שיטה זו יעילה לבחירת בעלי חיים בודדים או מרובים מצלחת אגר. לאחר שריטה קטנה של חיידקים בקצה בעת איסוף מסי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ג. אלגיה הוא אורגניזם מודל אידיאלי ללימוד מורפולוגיה של רקמות ואורגלות שונות בשל פשטותו, השושלת הידועה של התאים, השקיפות והכלים הזמינים. כאן, אנו מספקים גישות כמותיים ללימוד אורגלים (למשל, המיטוa) ורקמות, כולל הסינפסות והשרירים באמצעות הדמיה של קרינה בשידור חי ותוכנות חינם ביולוגי לעיבוד תמונה.
רגולציה קפדנית של ביטוי MEC-17 נדרש עבור הפיתוח הרגיל סינפסה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
וריאציות מורפולוגית העריכו לעתים קרובות באמצעות ספירה ידנית של הבדלים מורגש או שימוש בספי שרירותי כדי לקבוע פגמים בהשוואה לסוג פראי הפנוטיפים. לאחרונה, עם זאת, שיטות כמותיים שימשו למחקרים השוואתיים של המבנה כדי למדוד במדויק ולתאר שינויים ברמה התאית התאית בצורה לא משוחדת. היכולת לזהות הבדלים עדינים אך רלוונטיים ביולוגית בין פנוטיפים הוא אמצעי רב-עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים השולטים בשינויים במבנה מורפולוגיה הנגרמים מגורמים סביבתיים או ממחלות גנטיות. המשך העלייה ברזולוציית המחשוב וההדמיה המיקרוסקופיה, ביחד עם.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
אנו מודים לחברי מעבדת נוימן עבור דיונים וקלט יקרי ערך. זנים מסוימים סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). המחברים מודים WormBase על שפע של מידע על C. אלגיה, ולהכיר מונש מיקרו הדמיה, אוניברסיטת מונש, לאספקת מכשור, הדרכה ותמיכה טכנית. עבודה זו נתמכת על ידי מענקי מחקר CMTAA (2015 ו 2018), ו-NHMRC פרויקט מענקים 1101974 ו 1099690 הוענק B.N.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Leica | TCS SP8 | פלטפורמה הפוכה |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| כיסויי זכוכית #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| זכוכית כיסויים #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | תוצרת SCHOTT |
| זכוכית שקופיות | תרמו מדעי | MENS41104A/40 | |
| אור LED | Schott | KL 300 LED | |
| מיקרוסקופ סטריאו | אולימפוס | SZ51 | |
| טריפטון (פפטון מקזאין) | Merck | 107213 | מרכיבים למרק ליזוגני (LB) |
| תמצית שמרים בינונית | מרכיבים של Merck | 103753 | למרק ליזוגני (LB) |
| נתרן כלורי | מרכיבים 106404 של Merck | למרק ליזוגני (LB) | |
| פפטון בינוני (פפטון מבשר) | מרכיבי Merck | 107214 | למצע גידול נמטודות (NGM) אגר |
| Agar | Sigma | A1296 | מרכיבים למצע גידול נמטודות (NGM) אגר |
| נתרן כלורי | מרכיבי Merck | 106404 | למצע גידול נמטודות (NGM) אגר |
| כולסטרול | סיגמא | C8667-25G | רכיבים למצע גידול נמטודות (NGM) אגר |
| סידן כלוריד | Merck | 102382 | למצע גידול נמטודות (NGM) אגר |
| מגנזיום גופרתי | מרכיבי Merck | 105886 | למצע גידול נמטודות (NGM) אגר |
| דיפוטסיום פוספט | מרכיבי Merck | 105101 | עבור מצע גידול נמטודות (NGM) אגר |
| אשלגן דימימן פוספט | Merck | 104873 | רכיבים עבור מצע גידול נמטודות (NGM) אגר |
| דיסודיום פוספט | מרכיבי Merck | 106586 | עבור מאגר M9 |
| נתרן כלורי | Merck | 106404 | רכיבים עבור מאגר M9 |
| אשלגן דימימן פוספט | Merck | 104873 | מרכיבים למאגר M9 |
| מגנזיום גופרתי | Merck | 105886 | מרכיבים למאגר M9 |
| פיפטה פסטור | קורנינג | CLS7095D5X-200EA | |
| צלחות פטרי | קורנינג | CLS430589-500EA | |
| חוט פלטינה | סיגמא | 267201-2G | |
| מרית | Met-app | 2616 | |
| טטרמיזול הידרוכלוריד | סיגמא | L9756-5G |
מקורות
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
