הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

5.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/60039

⸱

23 באוגוסט 2019

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, New York University School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Whitehead Institute for Biomedical Research

במאמר זה

סיכום

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

תקציר

הארגון והמבנה של תחומי כרומטין הם ייחודיים לתאי תאים נפרדים. הטעות שלהם עלולה לגרום לאובדן זהות תאית ו/או מחלה. למרות מאמצים עצומים, ההבנה שלנו על היווצרות והתפשטות של תחומים כרומטין עדיין מוגבלת. תחומים כרומטין נחקרו בתנאים יציבים, אשר אינם מסייעות לעקוב אחר האירועים הראשוניים במהלך הקמתה. כאן, אנו מציגים שיטה ליצור מחדש תחומים כרומטין לשחזר ולעקוב אחר היווצרות שלהם כפונקציה של זמן. למרות, לראשונה מיושם על המקרה של PRC2-תיווך כרומטין היווצרות התחום, זה יכול להיות מותאם בקלות לתחומים אחרים כרומטין. שינוי ו/או שילוב של שיטה זו עם טכנולוגיות גנומיקה והדמיה יספק כלים יקרי ערך ללמוד את הקמתה של תחומים כרומטין בפירוט רב. אנו מאמינים ששיטה זו מהפכה את ההבנה שלנו לגבי אופן הפעולה של תחומים כרומטין ואינטראקציה זה עם זה.

מבוא

הגנום eukaryotic הם מאורגנים מאוד ושינויים בנגישות כרומטין ישירות שולטת בתמלול גנים1. הגנום מכיל סוגים שונים של תחומים כרומטין, אשר מתאם עם הפעילות הטרנססקריפט ושכפול עיתוי2,3. תחומים אלה כרומותין טווח בגודל של קילוסים מספר (kb) ליותר מ 100 kb והם מאופיינים על ידי העשרה שינויים ברורים ההיסטון4. השאלות המרכזיות הן: כיצד נוצרים תחומים אלה וכיצד הם מופצים?

אחד מתחומי כרומטין המאופיינת ביותר הוא מאומץ באמצעות הפעילות של קומפלקס הדיכוי הרב פוליקומב 2 (PRC2). PRC2 הוא קומפלקס רב ממדי subunit המורכב מקבוצת משנה של קבוצת פולימסרק (pcg) של חלבונים5,6, ו לזרז את מונו-, di-ו טריתילציה של ליזין 27 של היסטון H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 משויכים למצב כרומטין דכאני, אך תפקידה של H3K27me1 אינו ברור6,11. אחד המרכיבים המרכזיים של PRC2, פיתוח אאקטודרם עובריים (שלוש), נקשר למוצר הסופי של PRC2 זרז, H3K27me3, דרך הכלוב הארומטי שלה ותכונה זו מביא לגירוי אלוסטריה של PRC212,13. הפעילות הPRC2 אנזימטית חיונית לשימור הזהות התאית במהלך הפיתוח כביטוי בלתי הולם של גנים מסוימים התפתחותיים, כי הם התווית עבור שושלת מסוימת, יהיה מזיק5,6 . לפיכך, להתיר את המנגנונים שבהם PRC2 מטפחת היווצרות של תחומים כרומטין דכאניים ביונקים היא בעלת חשיבות יסודית להבנת הזהות התאית.

כל המערכות הנסיוניות האחרונות שתוכננו לחקור היווצרות דומיין כרומטין כולל תחומים PRC2-תיווך כרומטין, בוצעו בתנאים יציבים, אשר אינם יכולים לעקוב אחר אירועי התפתחות של היווצרות תחום של כרומטין ב תאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מערכת סלולרית inducible העוקבת אחר גיוס והפצה ראשונית של תחומים כרומטין. באופן ספציפי, אנו מתמקדים מעקב אחר היווצרות של תחומים כרומטין PRC2 מתווכת המהווים H3K27me2/3. מערכת זו שיכולה ללכוד את הפרטים המכניים של היווצרות דומיין כרומטין, יכול להיות מותאם לשלב תחומים כרומטין אחרים, כגון תחומים למדו נרחב הכוללת או H2AK119ub או H3K9me. בשילוב עם טכנולוגיות גנומיקה והדמיה, לגישה זו יש את הפוטנציאל לטפל בהצלחה בשאלות מרכזיות שונות בביולוגיה כרומטין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דור של inducible הצלה mESCs

1. תרבית תאים

  1. השתמש ללא מאכיל C57BL/6 בתאי גזע עובריים של העכבר (mESCs) בעל משולב באופן בלתי נשכח CreERT2 טרנזגנטי, אשר ניתן לאתר את הגרעין על הממשל של 4-הידרוקסיטמוקסיפן (4-OHT)13.
  2. לגדול mESCs ב-בינונית ESC קונבנציונאלי14,15, בתוספת עם 1000 U/mL בחיי, 1 μm טיפשה מעכב PD0325901 ו 3 μm GSK3 מעכב CHIR99021. עבור מדיום הרגיל ESC, השתמש בנוק-אאוט המכיל 15% סרום של שור עוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין ו 0.1 mM 2-mercaptoethanol.
  3. להשתמש לוחות מצופה עם 0.1% הג פתרון עבור culturing mESCs.

2. הדור של נוקאאוט שבטים (KO) mESCs

  1. מדריך עיצוב RNAs (gRNAs) כדי למחוק Exon 10 ו Exon 11 של עותק אנדוגני של mESCs באמצעות כלי העיצוב CRISPR בספסל16. הרובוט-ko-grna-1 מטרות אינטרון מיד הזרם של אקסון 10 ו--KO-grna-2 מטרות אינטרון מיד במורד הזרם אקסון 11. היישום הסימולטני של gRNAs האלה מוחק הן Exon 10 ו-Exon 11 על ידי הצטרפות לא הומוולוגי (NHEJ).
  2. שיבוט gRNAs לתוך pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) באמצעות הוראות רן et al., 201317.
  3. בפורמט 6-היטב, transfect 2 x 105 mESCs עם 1 מ ג של כל ד. ל. Ko-grna-1 ו-שולחן ה-Ko-grna-2 (ראה טבלה של חומרים) באמצעות הזיהום מגיב על ידי ביצוע הוראות היצרן. שינוי התקשורת 24 שעות לאחר הזיהום.
  4. יומיים לאחר ההעברה, לבודד את התאים החיוביים GFP באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS). צפו ליעילות השינוי בסביבות 10-30%. למיין סביב 5 x 105 תאים כדי ללכוד מספיק תאים gfp חיוביים לציפוי.
  5. צלחת מבודדת GFP חיובי mESCs לתוך 15 ס מ מצופה מראש עם 0.1% ג'לטין (10-20 x103 תאים לכל צלחת) עבור קטיף המושבה.
  6. הגדל את התאים באמצעי ESC במשך שבוע עד שמושבות בודדות יהיו גלויות. . להחליף את התקשורת כל יומיים
  7. בחר מינימום של 48 מושבות באמצעות 20 μL מיקרופיפטה טיפ. מגרדים את המושבה בזמן. שאתה מוריד את המיקרופיפטה אל תשבור את המושבה. לתאים בודדים להעביר את המושבה לתוך המאהאז (20 mL) 96 צלחת היטב.
  8. מודקון את המושבות במשך 10 דקות ב 37 ° c עד כל התאים מנוכה.
  9. הוסף 200 mL של מדיית ESC לתוך כל טוב באמצעות הצינורות רב-ערוצי.
  10. מערבבים היטב את התאים לתוך שני 96 בנפרד לוחות היטב באמצעות צינורות רב-ערוצי.
  11. השתמש באחד הצלחות 96 היטב עבור הגנוקלדה ולשמור על השני גדל עד המסקנה הגנוזה. השתמש בפתרון החילוץ DNA כדי לחלץ דנ א מ 96 צלחת הבאר על ידי ביצוע הוראות היצרן.
  12. השתמש ב-גנוהקלדה התחל Gnt_EED-KO-up ו -Gnt_EED-KO_down, אשר לאורך האתר נמחק ולבצע את ה-PCR הגנוזה עם taq DNA פולימראז בעקבות הוראות היצרן.
    הערה: סוגים אחרים של השימוש בדנ א יכול לשמש גם עבור הגנוטיפים, עם זאת, Taq DNA פולימראז מציע נוחות כמו תגובת ה-PCR יכול ישירות להיות טעון על ג'ל כאשר מאגר התגובה שלה בצבע משמש.
    1. צפו במוצר ה-DNA של משקל מולקולרי נמוך בתאים עם מחיקה homozygous יחסית למקרה פראי (WT).
      הערה: כדי ליצור תאים PRC2 null, homozygous מחיקה של exons 10 ו -11 היא הכרחית לערער ולבזות, יחידת משנה חיונית של ליבה PRC213. היעילות של המטרה היא. כ -10%
  13. לאמת את מחיקת ה-בסיס 10 ו -11 ואובדן של חלבון ה-, באמצעות רצפי הרצף של סאנגר והמערב המערבי, בהתאמה.
  14. לאשר את דלדול של ה-H3K27me2/me3 מ כרומטין בתאי ה-, באמצעות שבב-seq באמצעות נוגדנים נגד H3K27me2/me3 ו-. השתמש בפרוטוקול שניתן ב Oksuz et al., 201715 עבור ניסויי שבב-seq.

3. הנדסת mESCs לנמל הרבור הERT2 המבוסס על מinducible

  1. עיצוב grna (-inducible) כדי להציג חתך בתוך אינטרון בעקבות אקסון 9 של באמצעות באמצעות כלי העיצוב crispr בספסל16 (ראה טבלת חומרים).
  2. שיבוט gRNAs לתוך pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) באמצעות הוראות רן et al., 201317.
  3. עיצוב ה-DNA תבנית התורם הכוללת רצף של ה-dna לאחר אקסון 9 ו-C-טרמינל דגל-HA תג במעלה של רצף T2A-gfp, הכל בכיוון הפוך ביחס לרצף הגן אנדוסוגני.
    1. האגף את הקלטת עם אחוי-מסדר ורצף פוליאדלציה מקונן בין הטרוולוגי לאתרים loxP הפוכה (lox66 ו lox71)18.
    2. כלול לפחות 500 bp של זרועות הומולוגיה מכל קצה. פצל את תבנית התורם לתוך 2 מקטעים של שברי גנים gBlocks (ראה בלוק-1, Gblocks-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" ו-Gblocks-2-כלוב-מוטציה "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") ולהרכיב אותם לתוך וקטור בוטה באמצעות גיבסון שיבוט בעקבות הוראות היצרן.
      הערה: gblock-2 מכיל שאריות ארומטיים (Y365) בתוך כלוב המידע החשוב לאינטראקציה עם H3K27me312. gBlock-2-Wt מכיל שאריות סוג פראי, ואילו gblock-2-כלוב-מוטציה מכיל את כלוב-המוטציה של (Y365A), לא מסוגל לחייב את H3K27me3. ההצלה Inducible WT הצלה מסומן כמו i-WT-r ו Inducible כלוב-מוטציה הצלה ההצלה מסומן כמו i-MT-r לנוחות.
  4. בתבנית 6-הבאר, transfect 2 x 105 mESCs עם 1 מ ג של grna (אני-grna-inducible) ו 1 מ"ג של תבניות התורם (i-WT-r או i-MT-r) באמצעות מגיב לבידוד ובידוד בתאי gfp חיוביים באמצעות facs.
  5. בצע את השלבים 2.3-2.11 כדי לבודד מושבות בודדות מוכן עבור מיקוד מוצלח.
  6. השתמש הקלדה התחל Inducible_Genotype-FW -1 ו -Inducible_Genotype-REV-1, אשר לאורך הקלטת שנוספה ולבצע PCR הקלדה באמצעות taq DNA פולימראז.
    הערה: יעילות המיקוד עבור CRISPR היא בסביבות 10%.
    1. אשר שילוב נכון של הקלטת על-ידי ה-PCR באמצעות Inducible_Genotype-FW-2 ו -Inducible_Genotype-REV-2 התחל, אשר נמצאים מחוץ לזרועות הומולוגיה.
      הערה: שילוב Homozygous של הקלטת הוא הכרחי כדי לבצע הצלה יעילה של הצוות. שים לב כי תאים עם אינטגרציה homozygous יפיק מוצר אחד גדול DNA בהשוואה ל-WT, אשר יפיק מוצר קצר.
  7. אשר את השילוב של הקלטת על-ידי רצף של סנגר.
  8. לאשר היפוך של הקלטת ואת הביטוי של PRC2 ורכיבי ליבה אחרים (למשל, EZH2 ו SUZ12) על ממשל 4-OHT על ידי המערב המערבי.
  9. לאשר את הביטוי של T2A-GFP ואחוז של להעיף ידי cy try זרימה. שים לב כי הביטוי של GFP הוא מעיד על היפוך של הקלטת ואת הביטוי של ה-משפט.

4. בעקבות התגררות והפצת פעילות PRC2 על כרומטין

  1. ודא כי i-WT-r ו-i-MT-r mESCs אין ביטוי דולף של GFP על ידי הזרמת cy, לנסות. במקרה של ביטוי דולף של GFP, לבודד תאים GFP-שליליים על ידי FACS לפני תחילת הניסוי.
  2. הרחב את i-WT-r ואני-MT-r mESCs לתוך 5 15 ס"מ לוחות (5x 106 תאים לכל צלחת).
  3. לגרום הבעה של WT או כלוב-מוטציה באמצעות מינהל של 0.5 mM 4-OHT עבור 0 h, 12 h, 24 שעות, 36 h ו 8 ימים (1 15 ס מ לתנאי). שנה את המדיה לאחר 12 h עבור טיפולים ארוכים יותר מ-12 שעות. בודד את התאים המשולבים מחדש בהצלחה על-ידי FACS באמצעות GFP. כוונן את זמן הטיפולים כך שכל התנאים ייאספו בו.
  4. בצע שבב-seq עבור H3K27me2, H3K27me3 לחקור את התצהיר הזמני שלהם כרומטין בתגובה לביטוי מחדש של WT או כלוב-מוטציה ב. השתמש בפרוטוקול שבב-seq כולל הכנה לספריה המפורטת ב-Oksuz et al., 201715.
  5. השתמש בבקרת הדקר בכל מדגם כדי לאפשר השוואה כמותית בין נקודות זמן שונות19.
    1. עבור שליטה ספייק, השימוש כרומטין מדרוסופילה מלאנוסטר (ביחס 1:50 לכרוטין הנגזרת מהsc), כמו גם לדרוזוהילה H2Av נוגדן ספציפי (1 μl של נוגדן H2Av לכל 4 μg של דרוזוהילה כרומטין על פי הוראות היצרן) בכל דוגמה.
    2. הכינו את הכרוטין מדרוסופילה באופן דומה לזה מmESCs באמצעות הפרוטוקול המפורט Oksuz et al., 201715.
  6. מפה את הרצף קורא עבור שבב-seq כדי mm10 הגנום עם Bowtie 2 באמצעות פרמטרים ברירת המחדל20.
  7. לנרמל את העכבר שבב-seq קורא לדקר ב Drosophila ילה לקרוא ספירות21. חשב את פקטור הנורמליזציה של הדקר באמצעות הנוסחה הבאה: 1 x 106/מיוחד של דרוזוהילה הקורא ספירות. מצפים לקבל בערך 1 x 106דרוזוהילה לקרוא ספירות ו 20 x 106 העכבר סופר לכל ניסוי.
    1. כאשר אתה מסדר את דגימות הקלט, אל תכלול את הכרומטותין .
  8. השתמש בכלי genomecov מכלי המיטה כדי להמיר קובץ bam לתוך bedtools22. בשלב הבא, המירו את המיטה לקובץ הפאה הגדולה בעזרת הכלי מיטה מUSCS23,24. עיין בקובץ ה-script הבא:
    gen = "הנתיב אל mm10 הגנום"
    chr = "נתיב לגודל כרומוזום mm10"
    inp_bam = "הנתיב אל קלט bam הקובץ"
    הכפל = "חישוב פקטור הנורמליזציה של הדקר"
    כלים למיטה genomecov-bg-$multiply-ibam $inp-g $gen > פלט. בדפורגרף
    מיון-k1, 1-k2, 2n פלט. בדפורגרף > output_sorted.
    בoutput_sorted ביגרפיטופאה. ב$chr output.bw
  9. להמחיש את הצפיפות שבב-seq לקרוא על ידי העלאת קבצים פורסמים בדפדפן USCS הגנום24.

5. ניטור הופעתה וצמיחה של H3K27me3 וקדי בגרעין mESCs

  1. צלחת 1x 104 mESCs לתוך 8-היטב שקופיות קאמרית מצופה מראש עם 0.1% ג'לטין.
  2. למחרת, להתחיל לבצע ברציפות 4-OHT (0.5 מ"מ) השראות לאסוף את התאים ביטוי ד. א. עבור נקודות הזמן שצוין (0 h, 12 h, 24 h ו 36 h). שנה את המדיה לאחר 12 h עבור טיפולים ארוכים יותר מ-12 שעות.
  3. תקן את mESCs עם 4% פאראמפורמלדהיד בתמיסת מלח (PBS) בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות.
  4. החדירות התאים עם PBS/0.25% טריטון X-100 בשעה RT עבור 30 דקות.
  5. לחסום את התאים עם ה-PBS/5% סרום חמור/0.1% טריטון X-100 (חסימת מאגר) ב RT עבור 30 דקות.
  6. לדלל H3K27me3 נוגדן ראשי 1:500 במאגר חסימת ולהוסיף על התאים.
  7. מודיית את התאים עם הנוגדן העיקרי לילה ב 4 ° c.
  8. למחרת, לבצע 3 שוטף עם PBS/0.1% טריטון X-100.
  9. לדלל נוגדן משני (אלקסה פלורינציה 595) 1:1000 במאגר חסימת ולהוסיף על תאים.
    1. בצע את כל הincubations בחושך בשלבים הבאים כמו נוגדנים משני מצועם אלקסה Fluor הם רגישים באור.
  10. מודיית את הנוגדן המשני עבור 2 h ב RT.
  11. לבצע 3 שוטף עם PBS/0.1% טריטון X-100.
  12. לדלל DAPI (1 מ"ג/mL) 1:4000 עם PBS/0.1% טריטון X-100 ולהוסיף על תאים.
  13. דגירה את התאים עם DAPI עבור 10 דקות ב RT.
  14. הר את התאים עם הר אקווה.
  15. התמונה התאים עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בהגדלה 63 x.
  16. עיבוד וצבע מדומה לתמונות באמצעות התפלגות ImageJ, פיג'י25.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוכנית כללית של מערכת ההצלה המותנית
איור 1 מראה את התוכנית מיקוד כדי להציל באופן מותנה תאים מבוססי KO עם או WT או כלוב-המוטציות (Y365A) המתבטאת כי הוא מתבטא מתוך לוקוס מסוגני. לאחר הפסקת הפעולה של ה-PRC2, יחידת משנה של הליבה החיונית עבור היציבות והפעילות האנזימטית שלה, קלטת בתוך אינטרון בעקבות אקסון 9 של המערכת הציגה (איור 1). הקלטת כוללת את הרצף הנותר של שלוש שנות ה-Dna, בכיוון הפוך ביחס לרצף הגנטי האנדוגני.  הקלטת מוקף הטרוולוגי אתרים הפוכי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גישה רבת עוצמה כלפי הבנת הפרטים המכניים במהלך היווצרות תחום כרומטין נתון, היא לשבש תחילה את התחום ולאחר מכן לעקוב אחר השיחזור שלה במהלך התאים. התהליך יכול להיות מושהה בכל עת במהלך השיקום כדי לנתח בפרוטרוט את האירועים המתבצעים. המחקרים הקודמים על תחומים כרומטין לא היו מסוגלים לפתור אירועים כאלה כפי שהם בוצעו בתנאים יציבים המצב (למשל, השוואת סוג פראי ונוקאאוט גן). כאן, אנו מתווה מערכת כדי להעריך את היווצרות דינמי של תחומים כרומטין, כפי שמסומן על ידי גיוס והפצת תחומים דכאניים PRC2 בתאים.

הצעד הקר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

D.R. הוא שותף מייסד של קונסטליישן תרופות ו משען Therapeutics. מחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

אנו מודים לד"ר ל. ואלס, ד. Ozata ו-H. Mou לתיקון כתב היד. מעבדת D.R. נתמכת על ידי המכון הרפואי הווארד יוז והמכונים הלאומיים לבריאות (R01CA199652 וR01NS100897).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(Z)-4-הידרוקסיטאמוקסיפן (5 מ"ג)סיגמאH7904-5MGלאינדוקציה של ביטוי EED
16% תמיסה מימית פרפורמלדהיד (10x10 מ"ל)מדעימיקרוסקופיית אלקטרונים15710לאימונופלואורסצנציה
2-מרקפטואתנולLifeTechnologies21985-023לתרבית mESCs
2% תמיסת ג'לטיןסיגמאG1393-100 מ"לעבור mESCs תרבית
Accutase 500 מ"לחדשני Cell Tech/FISHERAT 104-500עבור mESCs תרבית
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson immunoresaerch711-585-152עבור אימונופלואורסצנציה
Aqua-Mount הרכבה בינוניתFISHER/VWR41799-008עבור אימונופלואורסצנציה
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PKFisher Sci177445PKלאימונופלואורסצנציה
DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד) - 10 מ"גLife TechD1306למעכב ERK אימונופלואורסצנטי
PD0325901Stemgent04-0006לתרבית mESCs
ESGRO עכבר רקומביננטי LIF חלבוןMillipore/FisherESG1107לתרבית mESCs
FBS תאי גזע מוסמכיםאטלנטהS10250לתרבית mESCs
גיבסון הרכבה מאסטר מיקסNEBE2611Lלשיבוט תבנית תורם
מעכב GSK3, CHIR99021Stemgent04-0004לתרבית mESCs
H3K27me2 (D18C8) ארנב mABאיתות תאי9728Sנוגדן ל-ChIP-seq
H3K27me3איתות תאים9733Sנוגדן ל-ChIP-seq
היסטון H2Av נוגדן (pAb)מוטיב פעיל39715בקרת ספייק אין עבור נוקאאוט ChIP-seq
DMEMInvitrogen10829-018לתרבית mESCs
L-גלוטמיןSigmaG7513לתרבית mESCs
ליפופקטמין 2000LifeTech11668019לטרנספקציה
MangoTaq DNA פולימראזביוליןBIO-21079לגנוטיפ PCR
סרום חמור רגיל (10 מ"ל)Jackson ImmunoResearch017-000-121לאימונופלואורסצנציה
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא/רושP0781לתרבית mESCs
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)Addgene48138לשיבוט gRNA
תמיסת מיצוי DNA QuickExtractLucigenQE0905Tלגנוטיפ PCR
Triton X-100SigmaT8787-250ML
ערכת שיבוט PCR אפס קההThermo FisherK270020לשיבוט תבניות תורם
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1רצף: ctctggctactgtcaactag. gRNAs מתחברים ל-EED נוקאאוט ב-C57BL/6 ESCs עבור מערכות i-WT-r ו-i-MT-r.
רצף EED-KO-gRNA-2: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. זוגות gRNAs לנוקאאוט EED ב-C57BL/6 ESCs עבור מערכות i-WT-r ו-i-MT-r.
EED-gRNA: atggcaccccgaaattagaa. gRNA ותורם ליצירת מערכת i-WT-r ברקע EED-KO.
תורםhttps://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA ותורם ליצירת מערכת i-WT-r ברקע EED-KO.
EED-gRNA: atggcaccccgaaattagaa. gRNA ותורם ליצירת מערכת i-WT-r ברקע EED-KO.
i-MT-r תורםhttps://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA ותורם ליצירת מערכת i-MT-r ברקע EED-KO.
<פריימרים חזקים>גנוטיפיים
Gnt-EED-KO-FW-1רצף: ctgtaggctgccatctgtga. אלל מסוג בר יפיק תוצר של 1.9 קילו-בייט. אלל נוקאאוט יפיק תוצר של 200 bp.
רצף Gnt-EED-KO-REV-1agccagggctacacagagaa. אלל מסוג בר יפיק תוצר של 1.9 קילו-בייט. אלל נוקאאוט יפיק תוצר של 200 bp.
רצף Inducible_Genotype-FW-1: tgcagtgaaacaaatttggaa. כאשר הקסטה מוכנסת, הפריימרים יפיקו 1863 bp. האלל מסוג הבר יפיק תוצר של ~200 bp.
רצף Inducible_Genotype-REV-1: gagaggggtggcacttaaa. כאשר הקסטה מוכנסת, הפריימרים יפיקו 1863 bp. האלל מסוג הבר יפיק תוצר של ~200 bp.
רצף Inducible_Genotype-FW-2: ccccctctctctctct. כאשר הקסטה מוכנסת, הפריימרים יפיקו 3200 bp. האלל מסוג הבר יפיק תוצר של 1560 bp.
רצף Inducible_Genotype-REV-2: atgcctgggtgaatgaaaaaa. כאשר הקסטה מוכנסת, הפריימרים יפיקו 3200 bp. האלל מסוג הבר יפיק תוצר של 1560 bp.
, רצף מושרה רצף מושרה :

מקורות

  1. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).
  2. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  3. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  4. Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation. Bioessays. 39 (12), (2017).
  5. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  6. Holoch, D., Margueron, R. Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).
  7. Cao, R., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing. Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).
  8. Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein. Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).
  9. Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites. Cell. 111 (2), 185-196 (2002).
  10. Müller, J., et al. Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex. Cell. 111 (2), 197-208 (2002).
  11. Ferrari, K. J., et al. Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity. Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).
  12. Margueron, R., et al. Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks. Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).
  13. Oksuz, O., et al. Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation. Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).
  14. Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs. Cell. 156 (4), 678-690 (2014).
  15. Oksuz, O., Tee, W. W. Probing chromatin modifications in response to ERK signaling. Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).
  16. Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: https://benchling.com (2018).
  17. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  18. Zhang, Z., Lutz, B. Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein. Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).
  19. Orlando, D. A., et al. Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome. Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).
  20. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  21. Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. R package version 1.2.1. , (2019).
  22. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  23. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  24. UCSC Genome Browser Home. , Available from: https://genome.ucsc.edu (2019).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  27. Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  28. Højfeldt, J. W., et al. Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

היווצרות דומיינים של כרומטיןכרומטין בתיווך PRC2נוקאאוט באמצעות CRISPR-Cas9אנליזת ציטומטריה של זרימהאנליזת ChIP-seqמיקרוסקופיית פלואורסצנציהתאי גזע עובריים של עכברמחיקת הגן EEDהשראה באמצעות 4-Hydroxytamoxifenהשקעת H3K27me3
שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.