פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד של גלגל העין של העכבר עם עפעף, משטח עינית, מקטעים קדמי ואחורי במצב לא תקין יחסית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של גלגל שלם כדי להשיג רקמת פני השטח העינית אינטגרלי לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה
במאמר זה
סיכום
תקציר
משטח עינית (OS) מורכב גיליון אפיתל עם שלושה חלקים מחוברים: palpebral לחמית, בולבר לחמית האפיתל הקרנית. הפרעה של מערכת ההפעלה תוביל לדלקת, דלקת הלחמית או שניהם (keratoconjunctivitis הלחמית). ב מודלים בעלי חיים ניסיוניים עם שינויים גנטיים מסוימים או פעולות מלאכותיות, זה שימושי כדי לבחון את כל חלקי מערכת האפיתל של OS להערכת השינויים הפתולוגית היחסיים של כל חלק במקביל. עם זאת, ניתוח של רקמות מערכת ההפעלה כמכלול ללא עיוות או נזק כבר מאתגרת, בעיקר בשל רכות והתיקמות של מערכת ההפעלה המוצמדת פיזית להפריד העפעפיים עדיין והעין. בנוסף, שקע העין העמוק שנוצר על ידי עצמות הגולגולת/מסלולית קשה מאוכלס לגמרי על ידי גלגל העין עוזב מקום מוגבל לניתוח הפעלה. כתוצאה מכך, הניתוח הישיר של גלגל העין עם רקמות מערכת ההפעלה המשויכת מהצד הפנים לעתים קרובות להוביל לנזקי רקמות, במיוחד palpebral ו בולבר לחמית. בפרוטוקול זה, תיארנו שיטה להסיר את הגולגולת ואת עצמות מסלולית ברציפות מראש עכבר מנוכר, עוזב את העפעפיים, משטח העינית, עדשה הרשתית לגמרי בחתיכה אחת. השלמות של גיליון מערכת ההפעלה השתמר היטב, וניתן היה לבחון אותו על ידי היסטולוגיה או חיסוני בסעיף אחד.
מבוא
המשטח העינית מורכב גיליון רציף של האפיתל הקרקע כולל palpebral לחמית, בולבר לחמית ו קרנית1. מבנים רבים הבלוטות משויכים האפיתל המשטח העינית ויחד לייצר שכבה של הסרט דמעה הגנה על משטח קרנית מפני ייבוש והסביבה פלישות2. הפרעה של מערכת ההפעלה תוביל לדלקת, דלקת הלחמית או שניהם (keratoconjunctivitis הלחמית). שני הגורמים הגנטיים והגירויים הסביבתיים או האינטראקציות שלהם תורמים לשינויים פתולוגיים של מערכת ההפעלה3,4. בהתאם, מגוון של מודלים מהונדסים גנטית, פיזית או כימית המושרה שימשו לחקר תהליכי מחלות של מערכת ההפעלה האנושית.
המבנה והתפקוד של מערכת ההפעלה של העכבר דומה לזה של בני אדם במובנים רבים. מרכיבי הסרט הקרוע שמופרשים על ידי בלוטות העינית דומים גם לעכברים ולבני האדם. הרבה מחקרים נערכו באמצעות מודלים העכבר להסבר מנגנוני היכרויות של מחלות האדם מערכת ההפעלה5,6,7. בהזדמנויות רבות, חשוב לנתח את הגלובלי במקום שינויים מולקולאריים מקומיים של מערכת ההפעלה כדי להשיג מידע מקיף תחת אותו טיפול ניסיוני. לכן, הכנה לדוגמה עם יושר טוב נדרשת כדי להבטיח כל חלק של מערכת ההפעלה להיות מנותח בו.
העכבר מערכת ההפעלה מקורביו בחוזקה עם גלגל העין כי היה מוטבע שקע העין/מסלול (ספל גרמי עשוי מספר עצמות הגולגולת שונים) ומתחבר אליו דרך רקמות חיבור דק. קיימים אתגרים עצומים לניתוח משטח העינית כולו מבלי לפגוע בpalpebral או בולבר לחמית. אתגרים אלה יורדים מ: (אני) מערכת ההפעלה היא רכה ורזה ומודבקת לתוך פיזית להפריד העפעפיים עדיין מטלטלין ועין, ולכן פגיע עיוות ונזק; ו-(ii) המרחב המוגבל בין עצמות המסלול לבין העין מגבילים את פעולות החיתוך. האתגרים הם הרבה יותר גדול עבור העכבר המבוגר. בתוך העכבר העובריים, ההתקשות עצם מסלולית אינו שלם והרקמות המקיפות הם יחסית רופף8. הראש ניתן להסיר ומנוכר, ולאחר מכן באופן ישיר בקיבוע של פאראפורמלדהיד (בשיא) קיבעון והטבעה9. לעומת זאת, העצמות לפני הלידה והעכבר למבוגרים הופכים להתקשות באופן מלא עם רקמות מסביב עבה, מה שהופך את החדירה של fixatives פחות יעיל. יתר על כן, עצמות מסלולית/הגולגולת הם קשים ושבירים, שבור בקלות כאשר מנציב אותם תרכובות הטבעה רכה כגון פרפין. פיסות עצמות שבורות יהיה פה אחד לקרוע את הרקמות הסמוכות וכתוצאה מכך מורפולוגיה רקמות נחות.
מחקרים רבים שפורסמו לעתים קרובות הראו משטח עינית חלקי, אשר עשוי להספיק למטרות מחקר מסוימות שלהם10,11. בדיקה ברוטו של הספרות מצאו רק מחקרים מראים את כל פני השטח העינית שלם הפגינו ללא תיאור מפורט של פרוטוקולי הניתוח12,13. בפרוטוקול זה, אנו מפורטים שיטת הניתוח להשגת משטח בלתי נפרד לאחר לידה העין, שבו מסלולית עצמות הגולגולת היו מסודרת הוסר, השארת משטח העינית ללא שינוי יחד עם העין והעפעפיים, למזער את הנזקים הפיזיים. בדקנו בהמשך את מערכת ההפעלה היסטולוגיה וביצעו אימונוהיסטוכימיה באמצעות מקטעי הרקמה שהוכנו על-ידי פרוטוקול זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים הכרוכים בשימוש בעכברים אושרו על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשימוש במרכז הבריאות של דז'ונגשאן, ודבקה בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים בחקר אופטלמולוגי וחזון.
1. חיתוך עין עם משטח עינית ועפעפיים שלמים
- . לנתח את הראש
- המתת חסד יום לידה 10 (P10) ו P28 עכברים (לראות את הטבלה של חומרים עבור זנים העכבר) על ידי פריקה צוואר הרחם, לחתוך את הראש מהצוואר על ידי זוג של מספריים חדים.
- ראש bisect עם זוג מספריים ישרים לאורך קו האמצע משונן להתחיל את העצם הפנימי rostrally אל האף (איור 1a, B).
הערה: עצם הגולגולת מתקשה עם הזדקנות העכבר, להיזהר לשמור את המספריים חיתוך לאורך קו האמצע ככל האפשר. - מניחים כל חצי של הראש בצלחת פטרי נקייה, לחתוך את הלסת ואת הלשון תחילה באמצעות מספריים חדים. לשחרר את העצב האופטי על ידי חיתוך אותו מהמוח לפני מיקום הראייה האופטית, ולהסיר את כל רקמות המוח כולל הנורה הריח מוצמד לקיר הגולגולת.
- עכשיו את הרקמות הנותרות יהיו כל עצמות הגולגולת/מסלולית הקשורים העין (איור 1ג, ד). שטוף את החלק הנותר עם ה-PBS כדי לנקות את הדם ופסולת השיער.
- הקידומת של רקמות עם 4% פאראפורמלדהיד (התחתית, בתוך מלוחים פוספט באגירה [PBS], pH 7.4) בצינורית בטמפרטורה 50 mL בטמפרטורת החדר (RT) עם סיבוב. זמן הקיבעון המשוער הוא כדלקמן: ~ 10 דקות עבור P0 כדי P7; ~ 20 דקות עבור P8 כדי P28; ו ~ 30 דקות עבור P29 ומעלה.
הערה: הקיבעון מציע קשיחות רקמות הפיכת הקרע שלאחר מכן קל יותר. בנוסף, קיבעון מראש נמנעת מהשארת רקמה טרייה שאינה קבועה זמן רב מדי לפני שהקרע יושלם.
התראה: המטה מסוכן ויש לטפל בו בזהירות.
- להסיר עצמות הגולגולת/מסלולית.
- לאחר הקיבעון, לשטוף במהירות את הראש גזור ב PBS שלוש פעמים כדי לחסל את שערות שבורות ותיקונים כדי להמשיך בניתוח נוסף.
התראה: חשיפה לתיקונים במהלך הניתוח עלולה להיות מזיק לבריאות. - מניחים את הרקמה בצלחת פטרי בגודל 10 ס מ, חותכים את הגולגולת לשלושה חלקים לאורך המטוסים המצוינים באיור 1D, E. גלגל העין בשקע חבוי בחלק האמצעי של הגולגולת תחת העצמות הקדמית, חזיתית והלסת התיכונה (איור 1D, E).
- השתמש שני זוגות של מס ' 4 מלקחיים ישר כדי לקלף את העצם האטימוד כדי לחשוף במלואו את העצמות הקדמית והלסתהראשונה (איור 1F).
- לחלק את משטח הגולגולת (כולל הלסת הקדמית ועצמות המצח) לתוך 4 אזורים (איור 1F). הכנס את הקצה של מלקחיים מעוקלים אופקית לתוך כל אזור כדי להסיר עצמות הלסת הקדמית והחזיתית ברצף (איור 1F).
הערה: עצמות הלסת השניה לא יכולות להיות מוסרות בו. בסבלנות לנתח אותם חלק אחרי חלק. העצם הקדמית מחוברת ישירות לעין דרך רקמות חיבור רכות. יש להיזהר כאשר מסירים אותו מן העין כדי למנוע מתיחה העין ולהזיק לחמית. - לאחר ההסרה של עצם הלסת החלקית מקסימום ואת כל העצם הקדמית, העצמות המשמשות כבסיס ו jugal יהיה חשוף (איור 1G). הסר את שתי העצמות הקשורות השרירים התת עורית ושומנים סביב העין, לקצץ את גלגל העין עם העפעפיים והעור המצורפת לבלוק ריבוע קטן צורה להפחית את נפח הרקמה ולהקל על הרקמה בעת הטבעה (איור 1 H).
- הניחו את גלגל העין והרקמות המשויכות בחזרה ל -4% בכיוון ההפוך והמשיכו לתקן את הלילה ב -4 ° c. הרקמה הקבועה יכולה להישמר למשך חודש אחד לפחות ב-4 ° c ב-PBS עם תוספת של 0.02% נאן3. לחלופין, המשך לניתוח היסטולוגית באופן מיידי.
הערה: אם הרקמה צריכה להיות מאוחסנת לתקופות ארוכות יותר, היא יכולה להיות מאוחסנת בקלות ב-70% אתנול.
- לאחר הקיבעון, לשטוף במהירות את הראש גזור ב PBS שלוש פעמים כדי לחסל את שערות שבורות ותיקונים כדי להמשיך בניתוח נוסף.
2. ניתוח היסטולוגית
- בחלק פרפין והמטאוקסילין ואאוזין (H & E) מכתים
- בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי המתואר במקומות אחרים9 לבצע הטבעה פרפין והסרת.
- אימונוהיסטוכימיה (IHC)
- Dewax את הפרפין סעיפים עם קסילן ו מחדש את הסעיפים באמצעות סדרת אלכוהול (100%, 95%, 80%) למים מזוקקים (dH2O).
- לבצע אחזור אנטיגן על ידי טיפול במיקרוגל של שקופיות רקמה ב 0.01 M חומצת לימון מאגר (3 גרם של trisodium ציטראט, 0.4 g לימון חומצה ל 1 L מזוקקים כפול H2O) בצנצנת שקופית זכוכית עם כוח נמוך (120 W). אנרגיה צריכה להיות מועברת לסירוגין עבור סך 5-10 דקות עם כל מרווח שנמשך כ 2 דקות.
הערה: מיקרוגל בעל כוח גבוה או חימום עקבי יוביל לניתוק מקטעי רקמות מהשקופית. - בחרו את השקופיות מצנצנת הזכוכית, נגבו בזהירות את הנוזל שיורית סביב כל מקטע באמצעות רקמות הפנים ומניחים אותם על מדף השקופיות בתיבה היסטולוגיה. צייר ריבוע סביב כל מקטע עם עט היסטולוגית עמיד למים. מקום 100 μL של חסימת מאגר (0.1% טריטון X-100 ו-10% בסרום חמור ב-1x PBS) על כל ריבוע, ו מודדת עבור 30 דקות ב RT.
- הסר בזהירות את הפתרון חסימה עם ואקום, להוסיף את הנוגדן העיקרי (לראות את הטבלה של חומרים) עם דילול הרצוי במאגר חסימת, ולהמשיך להסיר את השקופיות ב 4 ° c עבור 24 שעות או יותר.
הערה: הריכוז של כל נוגדן ראשוני המשמש ל-IHC משתנה, וצריך להיבדק בניסויים בפיילוט. - רוחצים שקופיות רקמה עם PBST (0.1% טריטון ב PBS) שלוש פעמים, עבור 10 דקות כל אחד. חזור על שלב 2.2.4 באמצעות הנוגדן המשני (ראה טבלת חומרים) יחד עם 4 ', 6-diamidino-2-פניינילינידול (dapi) החלפת מאגר חסימת. המשך לעבור לפחות 4 שעות או יותר בטמפרטורת החדר (RT).
- להסיר את הנוגדן המשני, לשטוף את מקטעי הרקמה עם הפתרון PBST שלוש פעמים, עבור 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן לשטוף עם PBS נקי עבור עוד 5 דקות.
- נגב את השאריות של PBS הסביבה מקטעים רקמות, הר שמיכות על סעיפים עם הרכבה בינונית. בצעו מיקרוסקופ פלורסנט לקבלת תמונות (ראו טבלת חומרים).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עצמות הגולגולת הגדולות הנצפים מזוויות שונות היו מאוירים באיור 1א-E, עם צבעים המציין עצמות שונות. השתמשנו בחיה בת ארבעה שבועות להדגמה של תהליכי הניתוח. בעקבות צעדים לחיתוך 1.1.1-1.1.3 וקיבעון קצר (שלב 1.1.4), גלגל העין עם עצמות הפנים המשויכים מומחש 1E. קיצוץ נוסף כדי להסיר הקדמי (האף והלסת הקדמית) והאחורי (למשל, הקודקודית) כמו גם העצמות המוכבקות לחסום רקמה עם עצמות הלסת הקדמית בעיקר מקסימום על גבי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תזכורת קריטית אחת להכנת העין שלמה היא כי כל עצמות מסלולית יש להסיר לחלוטין, במיוחד juga ועצמות lacrimal, אשר קטנים ממוקם ליד החלק התחתון של שקע העין. כל עצמות שמאל-מעל עלול לסבך את היסטולוגיה שלאחר מכן. במקרה פיסת עצם זעיר לא הוסר לחלוטין מניתוח בטעות, ניתן לבחור מתוך לחסום פרפין הטבעה באמצעות זוג מלקחיים. החור שנותר מאחור צריך להתמלא. בפרפין לאחר ניתוח זה
יש לתרגל זהירות נוספת בעת טיפול בעדשה. פיסות העדשה השבורה מפוזרות בדרך כלל דרך החלק השלם. הדבר ישפיע במידה ניכרת על בחינת המיקרוסקופיה ועל ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מודים לפרופסור רונג ג'ו על קריאה קריטית של כתב היד, וכל חברי המעבדה לסיוע טכני. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מן הארגון הלאומי למדעי הטבע של סין (NSFC: 31571077; בייג, סין), פרויקט החדשנות של מדעי העיר גואנגזו וטכנולוגיות (201707020009; גואנגג'ואו, מחוז גואנגדונג, סין), "100 אנשים תוכנית" מאוניברסיטת סון יאט-סן (8300-18821104; גואנגג'ואו, מחוז גואנגדונג, סין), ומימון מחקר מתוך המעבדה מפתח המדינה של רפואת עיניים במרכז דז'ונגשאן אופטלמולוגי (303060202400339; גואנגג'ואו, פרובינציית גואנג-דונג, סין).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 ופעמים; תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| צינור צנטריפוגה 50 מ"ל | |||
| שונות | |||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | ריכוז מומלץ 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | ריכוז מומלץ 1:500 - 1,000 |
| נוגדן Anti-K12 | Abcam | ab124975 | ריכוז מומלץ 1:1,000 |
| נוגדן Anti-K14 | Abcam | ab7800 | ריכוז מומלץ 1:800 |
| חומצת לימון | |||
| מכשירי | דיוק עולמיים14127 | ||
| ניתוח מיקרוסקופ. | Olmpus | SZ61 | |
| אלכוהול אתילי | |||
| Zeiss | AxioImager.Z2 | ||
| Fluoromount-G מדיה הרכבה | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| מספריים מיקרו חיתוך-להב ישר | World Precision Instruments | 503242 | |
| תנורי מיקרוגל | Galanz | זני עכבר P70D20TL-D4 | |
| C57/BL6 ו-Sv129 מעורב | |||
| מס' 4 מלקחיים ישרים | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| סרום עיזים רגיל | |||
| (PFA) | שונים | הכן תמיסה של 4% ב-1 ופעמים; PBS ומסנן עם 0.45μ m מסנן קרום | |
| צלחת תרבית רקמות | שונים | ||
| טריסודיום ציטראט | שונים | ||
| טריטון X-100 | סיגמא-אולדריץ' | SLBW6818 |
מקורות
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
- Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
- Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
- Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
- Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
- Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
- Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
- Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
- Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
- Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
- McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
