כאן אנו מתארים ולאמת שיטה כדי ליצור בעקביות באופן עקבי הנגרמת האנושי המושרה תא גזע מושרה ולאפיין את תפקידם. טכניקות אלה עשויות לסייע בפיתוח תובנה מכניסטית למסלולי איתות, לספק פלטפורמה לסינון תרופות בקנה מידה גדול ומחלות לב באופן אמין.
מאמר שיטה
כאן אנו מתארים ולאמת שיטה כדי ליצור בעקביות באופן עקבי הנגרמת האנושי המושרה תא גזע מושרה ולאפיין את תפקידם. טכניקות אלה עשויות לסייע בפיתוח תובנה מכניסטית למסלולי איתות, לספק פלטפורמה לסינון תרופות בקנה מידה גדול ומחלות לב באופן אמין.
תאי גזע הנגרמת על ידי האדם המושרה-הקרדיוציטים (iPSC-CMs) לספק מקור אנושי יקר ללמוד את המדע הבסיסי של סידן (Ca2 +) טיפול מסלולים איתות, כמו גם הקרנות התפוקה גבוהה הקרנת תרופות רעילות. להלן, אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיות המשמשות להפקת iPSC-CMs באיכות גבוהה שיכול לשחזר בעקביות מאפיינים מולקולריים ופונקציונליים על פני קווי תאים שונים. בנוסף, מתוארת שיטה להעריך באופן אמין את האפיון הפונקציונלי שלהם באמצעות הערכה של מאפייני Ca2 + טיפול. חמצן נמוך (O2) התנאים, בחירת לקטט, וזמן ממושך בתרבות לייצר טוהר גבוהה ואיכות גבוהה, המוח כמו הקרדיוציטים. בדומה מבודד עכברוש מבוגר חולדה (ARCMs), 3-חודש-התערוכה iPSC-CMs גבוה יותר Ca2 + משרעת, שיעור מהיר יותר של ca2 + קליטה (ריקבון-טאו), ו תגובה lusitropic חיובית β-אדראררגיות גירוי לעומת יום 30 ipsc-CMs. האסטרטגיה היא טכנית פשוטה, חסכונית, והיא מתוכמת. הוא מספק פלטפורמה חזקה למודל לב מחלות ועבור הקרנת סמים בקנה מידה גדול כדי למקד Ca2 + טיפול בחלבונים.
תא גזע הנגרמת על ידי האדם המושרה-הגוף הנגזר (ipsc-CMs) הם פלטפורמה מבוססת אדם אטרקטיבי למודל מגוון גדול של מחלות לב מבחנה1,2,3,4,5,6,7,8. יתר על כן, ipsc-CMs יכול לשמש לחיזוי של תגובות המטופל לתרופות הרומן או הקיים, כדי למסך תרכובות פגע, ולפתח תרופות אישיות חדשה בהתאמה אישית9,10. עם זאת, למרות ההתקדמות המשמעותית, יש לשקול מספר מגבלות ואתגרים בעת ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הניסויים בעזרת קרדיוקרדיציטים מבוגרים במחקר זה נערכו עם מאושר טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש (IACUC) פרוטוקולים של בית הספר Icahn לרפואה בהר סיני. הקרדיוציטים הבוגרים היו מבודדים מהלבבות העכברים של ספראג באמצעות השיטה המבוססת על לאנגדורף כמתואר בעבר16.
1. הכנת מדיה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הפרוטוקול המתואר באיור 1A שנוצר הקרדיוציטים טהור אשר לרכוש שיטת למבוגרים, כמו פניטיפ עם הזמן בתרבות. כפי שמוערך על ידי immunofluorescence כתמים עבור הפרפור ואת הרירן החדרית שרשרת האור הרגולציה 2 איזופורמים (MLC2A ו MLC2V, בהתאמה), רוב התאים שנוצר על ידי פרוטוקול זה היו MLC2A-חיוביים ביום 30 לאחר אינדוקציה של בידול הלב, בעוד MLC2V היה ביטאכמויותנמוכות בהרבה באותה נקודת זמן (איור 2 ככל שהזמן בתרבות גדל (היום 60 ו 90), בורר שלם של .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
שלבים קריטיים לשימוש ב-iPSC-CMs האנושי כמודלים ניסיוניים הם: 1) היוצרים הקרדיוציטים באיכות גבוהה (CMs) שיכולים להבטיח את הביצועים העקביים ואת התוצאות הנוזניות; 2) המאפשר לתאים להבשיל בתרבות לפחות 90 ימים כדי להעריך כראוי את פנוטיפ שלהם; 3) ביצוע מחקרים אלקטרולוגיים, למשל סידן (Ca2 +) מדידות ארעי, כדי לספק אפיון פונקציונלי הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית של Ipsc-CMs אנושי. פיתחנו שיטת בידול מבוססת מונאולייר המפיקה iPSC-CMs באיכות גבוהה. השיטה שלנו מסתמכת על כמה גורמים קריטיים והוא גרסה של הפרוטוקולים הקיימים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
. למחברים אין מה לגלות
מחקר זה נתמך על ידי המענק AHA מדען פיתוח מענק 17SDG33700093 (F.S.); פרס מKL2 של הר סיני לחקר המחקר הקליני והטרנסג KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 ו AHA 18TPA34170460 (סי סי).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אנטי אקטין, &אלפא - נוגדן שריר חלק, עכבר חד שבטי | סיגמא אולדריץ' | A5228 | |
| Alexa Fluor 488 עז אנטי עכבר | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 555 עז אנטי ארנב | Invitrogen | A21428 | |
| B27 תוסף | Gibco | 17504-044 | |
| B27 (-) תוסף אינסולין | Gibco | A18956-01 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DAPI כתם גרעיני | ThermoFisher | D1306 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- גלוטמין + 15 מ"מ Hepes | Gibco | 11330-032 | |
| מרים תאים כפול, להב שטוח ו-J-Hook | Celltreat | 229306 | |
| צלחת תרבית רקמות Falcon Multiwell, 6 בארות | Corning | 353046 | |
| מחמם מוטבע נוזלי | מכשיר תא חי | IL-H-10 | |
| Fura-2, AM | Invitrogen | F1221 | |
| מטריצה מוסמכת hESC | קורנינג | 354277 | מטריג'ל מטריצת |
| hPSC מדיה | Gibco | A33493-01 | StemFlex Basal Medium |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| תא הדמיה של תאים חיים | מכשיר תא חי | EC-B25 | |
| MLC-2A, נוגדן עכבר חד שבטי | מערכות סינפטיות | 311011 | |
| מערכת סידן והתכווצות מיוציטים | Ionoptix | ISW-400 | |
| Myosin Light Chain 2 נוגדן, ארנב פוליקלונלי (MLC2V) | Proteintech | 10906-1-AP | |
| Nalgene יחידות סינון חד פעמיות סטריליות סטריליות עם קרום | PESThermoFisher | 124-0045 | |
| PBS עם סידן ומגנזיום | קורנינג | 21-030-CV | |
| PBS ללא סידן ומגנזיום | קורנינג | 21-031-CV | |
| פרימיום כיסוי זכוכית מחליק | Lab Scientific | 7807 | |
| RPMI בינוני 1640 (-) D-גלוקוז (1X) | Gibco | 11879-020 | |
| RPMI בינוני 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| נתרן L-לקטט | סיגמא אולדריץ' | L7022 | |
| תוסף StemFlex | Gibco | A33492-01 | |
| Thiazovivin | Tocris | 3845 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| הפתרון של Tyrode | Boston Bioproducts | BSS-355w | התאם את ה-pH ב-7.2. הוסף 1.2 מ"מ סידן כלורי |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה