ננו הדמיה של דגימות רקמה קלינית יכול לשפר את ההבנה של פתוגנזה מחלה. הרחבת פתולוגיה (ExPath) היא גרסה של התפשטות מיקרוסקופ (Expath), שונה עבור תאימות עם דגימות רקמה קלינית סטנדרטית, כדי לחקור את תצורת הננו-סקאלה של biomolecules באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונאלי עקיפה מוגבלת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה nanoscopic של מקטעים רקמות האדם באמצעות הרחבה גופנית איזוטרופית
במאמר זה
סיכום
תקציר
בפתולוגיה המודרנית, מיקרוסקופ אופטי ממלא תפקיד חשוב באבחון המחלה על ידי חשיפת מבנים מיקרוסקופיים של דגימות קליניות. עם זאת, מגבלת העקיפה הפיזית הבסיסית מונעת חקירה של אנטומיה ננו-סקאלה ושינויים פתולוגיים עדינים בעת שימוש בגישות הדמיה אופטית קונבנציונאלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וזול, הנקרא פתולוגיה הרחבה (ExPath), עבור הדמיה של ננו-סולם אופטי של סוגים נפוצים של דגימות הרקמה הראשונית קליני, כולל מוקפאו קבוע או formalin מוטבע הרקמה (FFPE) סעיפים. שיטה זו מרחיבה את מגבלת העקיפה האופטית באמצעות שינוי כימי של דגימות הרקמה לתוך רקמת-הידרוג'ל היברידית והרחבת הפיזית אותם באמצעות סולמות מרובים במים טהורים. בשל התרחבות, מולקולות שאינן פתירה בעבר מופרדות ובכך ניתן להבחין באמצעות מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי.
מבוא
חקירת הארגון המולקולרי של רקמות בהקשר תלת מימדי (3D) יכול לספק הבנה חדשה של פונקציות ביולוגיות ופיתוח מחלות. עם זאת, סביבות ננומטרי אלה הם מעבר ליכולות הפתרון של עקיפה מוגבלת של מיקרוסקופים קונבנציונאלי (200-300 ננומטר), שם מרחק מינימלי לפתירה, d מוגדר על ידי d α λ/NA. כאן λ הוא אורך הגל של האור na הוא הפתח המספרי (NA) של מערכת ההדמיה. לאחרונה, הדמיה ישירה של מולקולות בעלי תווית fluorescently התאפשרה על-ידי החדש שפותחו ברזולוציה סופר טכניקות הדמיה1,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת ריאגנטים מניות ופתרונות
-
הכן רכיבי פתרון.
הערה: ריכוזי פתרונות מקבלים g/mL (w/v אחוזים).- הפוך את פתרונות המניה הבאים: 38% (w/v) נתרן אקריל (SA), 50% (w/v) אקרילאמיד (AA), 2% (w/v) N, N′-מתיונין (Bis), ו 29.2% (w/v) נתרן כלוריד (הנאל). מפזר את התרכובות במים האחרים כפליים (ddH2O). השתמש בסכומים בטבלה 1 כהפניה; פתרונות מוכנים ניתן לשנות בנפח כנדרש. לדוגמה, כדי להפוך 10 mL של 38% (w/v) פתרון SA, להוסיף 1.9 g SA לגליל בוגר 10 mL ולהוסיף ddH2O לנפח של 5 מ ל.
- הכינו 9.4 mL של תמיסת מונומר בריכוז 1.06 x כפי שמוצג בטבלה 1.
הערה: פעולה זו תגרום לרי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אם הפרוטוקול בוצע בהצלחה (איור 1), דגימות יופיעו כג שטוח ושקוף לאחר המגון מכני הגון (איור 3א) והוא יכול להתרחב בפקטור של 3-4.5 x במים (איור 3ב), מתן רזולוציה אפקטיבית של ~ 70 ננומטר בהתאם לגורם ההתרחבות הסופי ומערכת הדמיה בשימוש5,16. איור 4 מציג תמונות לדוגמה של דגימת כליות ffpe עבה בעובי 5 יקרומטר המעובדות באמצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ExPath16, גרסה של proExM5 שניתן להחיל על הסוגים הנפוצים ביותר של דגימות ביופסיה קלינית בשימוש פתולוגיה, כולל ffpe, H & E ויטראז ', ויצורים קפואים טריים על שקופיות זכוכית. המרת עיצוב, שליפת אנטיגן, וכתמים חיסוני של הדגימות לעקוב אחר פרוטוקולים בשימוש נפוץ שאינם ספציפיים ExPath. בניגוד לפרוטוקול proExM המקורי9, expath מסתמך על ריכוז גבוה יותר של edta במאגר העיכול, אשר משפר את הרחבת הרקמות הקבועות של formalin, כפי שמתואר במחק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
YZ ו-OB הם שני ממציאים אשר הגישו והשיגו הגנה על פטנט על תת-ערכה של הטכנולוגיות המתוארות כאן (פטנטים בארה ב US20190064037A1, WO2018157074A1, ו WO2018157048A1).
תודות
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי קרן הסטארט-up של הפקולטה מאוניברסיטת קרנגי מלון (YZ) ו-NIH החדש של מנהל משנה פרס (DP2 OD025926-01 עד YZ).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מעכב 4-הידרוקסי-טמפו (4HT) | מעכב | 176141 סיגמא אולדריץ' | |
| צלחת זכוכית תחתונה 6 בארות (#1.5 כיסוי) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| אצטון | פישר Scientifc | A18-500 | |
| אקרילאמיד | סיגמא אולדריץ' | A8887 | |
| אקרילויל-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| אגרוז | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| אמוניום פרסולפט (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 נוגדן המיוצר בארנב | נוגדן Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV המיוצר בעכבר | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| נוגדן אנטי-וימנטין המיוצר בעוף | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II עט הידרופובי | מכשיר מדעי | 980402 | |
| מערך רקמות מחלות נפוצות בשד | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 מ"ג/מ"ל) | Thermo Scientific | 62248 | יהלום כתם גרעיני |
| מס' 88 ס"מ | General Tools | 31116 | |
| אתנול | פארמקו | 111000200 | |
| חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) 0.5 M | VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE דגימת כליה | USBiomax | HuFPT072 | |
| מלקחיים | |||
| עיזים נגד עוף IgY (H+L), CF488A | ביוטיום | 20020 | |
| נגד עוף IgY (H+L), CF633 ביוטיום סופח מאוד | 20121 | ||
| עז נגד ארנב IgG (H+L) אלקסה פלואור 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind צביעה מוטיב | פעיל | 15253 | ניתן להחליף במאגר סטנינג לא מסחרי לבחירה. |
| חסימת MAXblock | מוטיב פעיל | 15252 | ניתן להחליף במאגר חסימה לא מסחרי לבחירה. |
| MAXwash כביסה בינונית | פעילה מוטיב | 15254 | ניתן להחליף במאגר כביסה לא מסחרי לבחירה. |
| זכוכית כיסוי מיקרו #1 (24 מ"מ x 60 מ"מ) | VWR | 48393 106 | |
| זכוכית כיסוי מיקרו #1.5 (24 מ"מ x 60 מ"מ) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| סרום | עיזים רגילJackson Immunoresearch | 005-000-121 | להכנת מאגר חוסם. תלוי בפונדקאי של בעלי חיים של נוגדנים משניים. |
| Nunclon 4-Well x 5 מ"ל MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | צלחת תרבית פלסטית מרובת בארות |
| Nunclon 6-Well Cell | Dish Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 מ"ל | תרמו פישר | 339651 | |
| Nunc 50 מ"ל תרמו | חרוטי פישר | 339653 | |
| מברשת | |||
| שייקר | |||
| מטר | |||
| פוספט חוצץ מלח (PBS), 10x תמיסה | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| צלחת פטרי מפלסטיק (100 מ"מ) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K ( כיתה ביולוגיה מולקולרית) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| סכין גילוח | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 מ"ל | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 מ"ל | תרמו פישר | 3459 | |
| נתרן אקרילט | סיגמא אולדריץ' | 408220 | |
| נתרן כלורי | Sigma Aldrich | S6191 | |
| נתרן ציטראט tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| אגלוטינין נבט חיטה מסומן CF640R | ביוטיום | 29026 | |
| קסילנים | סיגמא אולדריץ' | 214736 |
מקורות
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
