מאמר שיטה

הדמיה nanoscopic של מקטעים רקמות האדם באמצעות הרחבה גופנית איזוטרופית

DOI:

10.3791/60195

⸱

25 בספטמבר 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University, 2QPathology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ננו הדמיה של דגימות רקמה קלינית יכול לשפר את ההבנה של פתוגנזה מחלה. הרחבת פתולוגיה (ExPath) היא גרסה של התפשטות מיקרוסקופ (Expath), שונה עבור תאימות עם דגימות רקמה קלינית סטנדרטית, כדי לחקור את תצורת הננו-סקאלה של biomolecules באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונאלי עקיפה מוגבלת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפתולוגיה המודרנית, מיקרוסקופ אופטי ממלא תפקיד חשוב באבחון המחלה על ידי חשיפת מבנים מיקרוסקופיים של דגימות קליניות. עם זאת, מגבלת העקיפה הפיזית הבסיסית מונעת חקירה של אנטומיה ננו-סקאלה ושינויים פתולוגיים עדינים בעת שימוש בגישות הדמיה אופטית קונבנציונאלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט וזול, הנקרא פתולוגיה הרחבה (ExPath), עבור הדמיה של ננו-סולם אופטי של סוגים נפוצים של דגימות הרקמה הראשונית קליני, כולל מוקפאו קבוע או formalin מוטבע הרקמה (FFPE) סעיפים. שיטה זו מרחיבה את מגבלת העקיפה האופטית באמצעות שינוי כימי של דגימות הרקמה לתוך רקמת-הידרוג'ל היברידית והרחבת הפיזית אותם באמצעות סולמות מרובים במים טהורים. בשל התרחבות, מולקולות שאינן פתירה בעבר מופרדות ובכך ניתן להבחין באמצעות מיקרוסקופ אופטי קונבנציונאלי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקירת הארגון המולקולרי של רקמות בהקשר תלת מימדי (3D) יכול לספק הבנה חדשה של פונקציות ביולוגיות ופיתוח מחלות. עם זאת, סביבות ננומטרי אלה הם מעבר ליכולות הפתרון של עקיפה מוגבלת של מיקרוסקופים קונבנציונאלי (200-300 ננומטר), שם מרחק מינימלי לפתירה, d מוגדר על ידי d α λ/NA. כאן λ הוא אורך הגל של האור na הוא הפתח המספרי (NA) של מערכת ההדמיה. לאחרונה, הדמיה ישירה של מולקולות בעלי תווית fluorescently התאפשרה על-ידי החדש שפותחו ברזולוציה סופר טכניקות הדמיה1,2,3, כולל ממריצים פליטה מאולצת (ההיסטד), מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-מופעל (PALM), מיקרוסקופ שחזור (סטורם) סטוכסטי, ומיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM). למרות טכניקות הדמיה אלה יש מהפכה הבנה של תפקוד ביולוגי בקנה המידה, בפועל, הם לעתים קרובות להסתמך על ציוד יקר ו/או מיוחדים ועיבוד התמונה שלבים, יכול להיות זמן הרכישה איטי יותר השוואת ל הדמיה אופטית קונבנציונאלי, דורשים fluorophores עם מאפיינים ספציפיים (כגון יכולת מיתוג תמונה ו/או פוטויציבות גבוהה). בנוסף, הוא נשאר אתגר לבצע 3D ברזולוציה סופר הדמיה על דגימות רקמות.

מיקרוסקופ הרחבה (ExM), הוצג לראשונה בשנת 20154, מספק אמצעי חלופי של תכונות ננו הדמיה (< 70 ננומטר) על ידי הרחבה פיזית דגימות שנשמרו מוטבע בתוך הידרו פוליליטי swellable. כאן, מפתח biomolecules ו/או תוויות מעוגנים באתרו לרשת פולימר שניתן isotopically מורחב לאחר עיבוד כימי. מכיוון שהרחבת הגוף מגבירה את הרזולוציה האפקטיבית הכוללת, ניתן לפתור את מולקולות הריבית באמצעות מערכות הדמיה מוגבלות-עקיפה. מאז הפרסום של הפרוטוקול המקורי, שם תוויות פלורסנט מסונתז מותאם אישית היו מעוגנים לרשת פולימר4, אסטרטגיות חדשות שימשו ישירות עוגן חלבונים (חלבון שימור exm, או proExM)5, 6,7,8,9 ו-RNA9,10,11,12 להידרוג'ל, והגדל את ההגדלה הפיזית באמצעות איטרטיבי התרחבות13 או התאמת הכימיה ג'ל8,14,15.

כאן אנו מציגים גרסה מותאמת של proExM, נקרא פתולוגיה הרחבה (ExPath)16, אשר כבר אופטימיזציה עבור תבניות פתולוגיה קלינית. הפרוטוקול ממיר דגימות קליניות, כולל פורמאלין קבוע-פרפין-מוטבע (FFPE), המטאוקסילין ו אאוזין (H & E) ויטראז, וטרי-קפואים רקמות האדם הרכוב על שקופיות זכוכית, למצב תואם ExM. חלבונים מעוגנים אז ההידרוג'ל והומוגון מכני מבוצעת (איור 1)16. עם 4-מקפלים הרחבה ליניארית של דגימות, ברזולוציה ססגוניות (~ 70 nm) תמונות ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית יקוד קונבנציונאלי שיש רק ברזולוציה של ~ 300 ננומטר והוא יכול גם להיות משולב עם טכניקות אחרות סופר ברזולוציה הדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ריאגנטים מניות ופתרונות

  1. הכן רכיבי פתרון.
    הערה:     ריכוזי פתרונות מקבלים g/mL (w/v אחוזים).
    1. הפוך את פתרונות המניה הבאים: 38% (w/v) נתרן אקריל (SA), 50% (w/v) אקרילאמיד (AA), 2% (w/v) N, N′-מתיונין (Bis), ו 29.2% (w/v) נתרן כלוריד (הנאל). מפזר את התרכובות במים האחרים כפליים (ddH2O). השתמש בסכומים בטבלה 1 כהפניה; פתרונות מוכנים ניתן לשנות בנפח כנדרש. לדוגמה, כדי להפוך 10 mL של 38% (w/v) פתרון SA, להוסיף 1.9 g SA לגליל בוגר 10 mL ולהוסיף ddH2O לנפח של 5 מ ל.
    2. הכינו 9.4 mL של תמיסת מונומר בריכוז 1.06 x כפי שמוצג בטבלה 1.
      הערה: פעולה זו תגרום לריכוז של 1 x לאחר הוספת יוזם, מאיץ ומעכב. ניתן לאחסן את מלאי המונומר ב-4 ° צ' עד 3 חודשים, או ב-20 ° c לאחסון לטווח ארוך.
    3. הכינו את פתרונות המניה הבאים בנפרד ב-ddh2O: 0.5% (w/v) של המעכב 4-הידרוxy-2, 2, 6, 6-טטרמתיד-1-אוקסיל (4ht), המעכב את הגגנציה כדי לאפשר דיפוזיה של הפתרון לרקמות, 10% (v/v) של ה מאתחל הטטרמתיליפילואמין (temed), אשר מאיצה את הדור הרדיקלי על ידי אמוניום פרסולפט (APS), ו 10% (w/v) גישה אשר יוזם את תהליך הגילינג.
      הערה: פתרונות מניות של 4HT ו-TEMED יכול להיות מוכן 1 mL ali, ומאוחסן ב-20 ° c לפחות 6 חודשים. APS נמצא לאבד את היעילות לאחר אחסון ארוך טווח והוא מוכן הטוב ביותר בכמויות קטנות (< 0.1 מ ל) מיד לפני הגילינג.
  2. הכנת מאגר העיכול (50 mM Tris pH 8.0, 25 מ"מ EDTA, 0.5% [w/v] nonionic סורסטנט, 0.8 M הנאל) על ידי שילוב של 25 מ ל של 1 M Tris pH 8 (3.03 g של בסיס טריס 25 מ ל של ddH2O), 25 מ ל של edta (0.5 M pH 8) , 2.25 גרם של הנאאוניסטנט nonionic, ו 23.38 g של הנאל. הוסף ddH2O עבור נפח כולל של 500 mL.
    הערה: ניתן לשנות את הפתרון למעלה או למטה לפי הצורך ולאחסנם ב-4 ° c. פרוטאינאז K (ProK) יתווספו מיד לפני שלב העיכול.
  3. הכינו 20 מ"מ תמיסת נתרן ציטראט על ידי שילוב 2.941 g של נתרן ציטראט tribasic dihydrate עם 500 mL של ddH2O והתאמת ה-pH ל8.0 בטמפרטורת החדר (RT). הרחב את נפח המניה לפי הצורך.
  4. להכין פתרון מניות של 6-((אקרילי) הקסאנואית חומצה, סוכנימידידיל אסתר (אקריל-X, SE; בכורה) AcX), מתחם עיגון. התמוססות AcX ב 500 μL של מסולפוקסיד (DMSO) עבור ריכוז סופי של 10 מ"ג/mL.
    הערה: הפתרון יכול להיות מאוחסן בסביבה מיובש ב-20 ° c ב 20 μL.
  5. אם לא נעשה שימוש במאגרים מסחריים זמינים לצורך כתמים, הכן מאגר חסימות. השתמש במאגר חסימה של 5% (v/v) סרום בעלי חיים רגיל ו 0.1% (w/v) nonionic החומרים ב-1x פוספט מאגר מלוחים (PBS) ולבחור את הנסיוב המבוסס על החיה המארחת של הנוגדנים המשני. לדוגמה, כדי להכין את מאגר חסימת 500 mL עבור נוגדנים שהועלו עזים, לשלב 25 מ ל של סרום עז, 0.45 g של nonionic סורסטנט, ו-1x PBS לנפח של 500 mL.

2. הכנת שקופיות רקמות קליניות מהארכיון וטריות עבור ExPath

  1. המר את הרקמה לתבנית תואמת ExPath. בחר באחד מארבעת השלבים הבאים (2.1.1-2.1.4) בהתבסס על אופן ההכנה של הדגימה: מגלשות FFPE, שקופיות מוכתמות של FFPE, או שקופיות של רקמות קפואות או קבועות מראש בתמיסה מיטבית לחיתוך טמפרטורה (OCT).
    הערה:     התקנים אלה מבוססים על שלבי שחזור סטנדרטיים עבור דגימות פתולוגיה ואינם ספציפיים לפרוטוקול ExPath.
    1. FFPE דגימות קליניות
      1. הכינו 30 מ ל של 95% אתנול, 70% אתנול, ו 50% אתנול. למדוד את 30 מ ל של קסילין, 100% אתנול, ו ddH2O.
      2. מניחים את השקופית עם המדגם ב 50 mL באמצעות מלקחיים ולהוסיף 15 מ ל של קסילין. Cap את הצינור ומניחים אותו אופקית על שייקר מסלולית ב כ 60 rpm ו-דגירה ב RT עבור 3 דקות עבור כל פתרון. . אני חוזר עם השאר 15 מ"ל
      3. חזור על שלב 2.1.1.2 עם 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול, 50% אתנול ו-ddH2O במקום xylene.
    2. שקופיות קבועות ומוכתמות
      1. מניחים את השקופית בצלחת פטרי 100 מ"מ ומכסה עם קסילן. הסר בזהירות את הכיסויים בעזרת להב גילוח. אם הכיסויים לא יוסרו בקלות, החזר את השקופית לקסילין עד שהפתק משתחרר.
      2. תהליך באמצעות השלבים עבור דגימות FFPE (שלבים 2.1.1.1-2.1.1.3).
        הערה: במקרה של H & E שקופיות ויטראז ', הכתמים מסולקים במהלך תהליך ההתרחבות.
    3. שקופיות רקמות קפואות שאינן קבועות בפתרון OCT
      1. תקן את הרקמה באצטון ב-20 ° c עבור 10 דקות.
      2. שטוף את הדגימות עם פתרון PBS 1x 3 פעמים עבור 10 דקות כל אחד ב RT.
    4. שקופיות של רקמה קלינית שתוקנה בעבר
      1. מודיית את השקופיות עבור 2 דקות ב-RT כדי להמיס את הפתרון OCT.
      2. שטוף את המדגם עם פתרון PBS 1x 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
  2. בצע טיפול בחום עבור אחזור אנטיגן על כל הדגימות לאחר ההמרה בפורמט.
    1. הוסף 20 מ"מ פתרון ציטראט (pH 8 בשעה RT) במיכל עמיד בחום, כגון צנצנת מכתים שקופיות.
      הערה: צריך להיות מספיק פתרון כדי לכסות את הרקמה רכוב על השקופית (50 mL עבור צנצנת מכתים שקופית רגילה).
    2. מחממים את התמיסה הציטראט ל 100 ° c במיקרוגל ומניחים את השקופית בתמיסה. מיד להעביר את המיכל לחדר הדגירה והדגירה ב 60 ° c עבור 30 דקות.
      הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. ניתן למקם שקופיות בצלחות פטרי ולכסות ב-1x PBS ולאחסן ב -4 ° c.
  3. הכתם את המדגם באמצעות הפרוטוקולים הסטנדרטיים של הimmunofluorescence (IF)/אימונוהיסטוכימיה (IHC) מכתים.
    הערה:     ריכוזי נוגדנים ראשיים ומשניים ומשכי זמן מכתים תלויים בריכוזים המוצעים על ידי היצרן או באמצעות אופטימיזציה לניסוי הספציפי.
    1. השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר גבול סביב הרקמה (s) בשקופית כדי למזער את נפח הפתרון הדרוש כדי לכסות את הרקמה. מקם את השקופית במנה גדולה מספיק כדי להתאים לשקופית. עבור שקופית סטנדרטית בגודל 3 אינץ ', השתמש בצלחת פטרי 100 מ"מ.
      הערה: עט ההידרופובי אינו מפריע לפילמור המדגם או לתהליך העיכול.
    2. מודלת את הרקמה עם חסימה מאגר עבור 1 h ב 37 ° צ', 2 h ב RT, או 4 ° צלזיוס ללילה כדי להפחית את הכריכה לא ספציפית.
    3. דלל את הנוגדנים הראשוניים לריכוז הרצוי בכמות המתאימה של מאגר חסימת מוכן (או מאגר כתמים מועדף אחר). דגירה את הרקמות עם פתרון הנוגדן העיקרי עבור לפחות 3 h ב RT או 37 ° c, או לילה ב 4 ° c.
      הערה: יש להניח דגימות במיכל מחולל לחות (כגון צלחת פטרי עם מחיקה לחה) כדי למנוע ייבוש של הרקמה. בדרך כלל, הנוגדנים מדוללים ל-1:100-1:500 ב 200 ל-500 μL של מאגר, בהתאם לגודל הרקמה והנוגדן המשמשים.
    4. שטוף את הרקמה עם מאגר חוסם מוכן (או מאגר כביסה מועדף אחר) 3 פעמים עבור 10 דקות ב RT.
    5. לדלל נוגדנים משניים (ו 300 nM 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול [DAPI] אם תרצה), במאגר מוכן חסימה (או מאגר כתמים אחרים מועדף) לריכוז של כ 10 μg/mL. מודטת את הרקמה בפתרון נוגדן משני עבור לפחות 1 h ב RT או 37 ° c.
      הערה: התזמון עשוי להיות מותאם בהתאם לנוגדנים המשמשים ואת עובי הרקמה. נוגדנים משניים המכילים cyanine צבעים (Cy3, Cy5, אלקסה 647) אינם תואמים לפרוטוקול ExM בעת החלתם מראש-פילמור. הצבעים המוצעים כוללים אלקסה 488 (ירוק), אלקסה 546 (כתום/אדום), ו Atto 647N או CF633 (הרחק-אדום). על DAPI להיות מוחלים מחודש לאחר התרחבות, מכיוון שהוא נשטף במהלך תהליך ההרחבה.
    6. שטוף את הרקמה עם מאגר חוסם מוכן (או מאגר כביסה מועדף אחר) 3 פעמים עבור 10 דקות כל אחד ב RT.
      הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. ניתן למקם שקופיות בצלחות פטרי ולכסות ב-1x PBS ולאחסן ב -4 ° c.
    7. לבצע דימות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ רגיל שדה רחב, מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, או מערכת הדמיה אחרת של הבחירה.
      הערה: שלב זה נדרש לקביעת אורך ביולוגי באמצעות מקדם ההרחבה על-ידי השוואת תמונות טרום ושלאחר הרחבה. כדי להקל על הדמיה פוסט-הרחבה, יש לבחור אזורי עניין בקלות, ותמונות בהגדלה הנמוכה והגבוהה יש לאסוף.

3. באתרו של דגימות

  1. דגירה הדגימה בעיגון פתרון.
    1. להכין את הפתרון עיגון (בדרך כלל 250 μL מספיק כדי לכסות את מקטע הרקמה) על ידי דילול הפתרון מניות AcX ב-1x PBS לריכוז של 0.03 mg/mL עבור דגימות קבוע עם שאינם אלדהיד fixatives או 0.1 mg/mL עבור דגימות קבוע עם מבצעים של אלדהיד , אשר יש פחות אמינים חופשי זמין להגיב עם acx.
    2. מניחים את השקופית בצלחת פטרי 100 מ"מ ופיפטה את הפתרון לגבי הרקמה. דגירה לפחות 3 h ב RT או לילה ב 4 ° c.
  2. מודאת הדגימות. בתמיסה של הגלינג
    1. הכינו לפחות את הנפח העודף של מ100 הפתרונות. לכל 200 μl, לשלב את הבאים, על מנת: 188 μl של פתרון מונומר, 4 μl של 0.5% 4ht פתרון מניות (1:50 דילול, ריכוז סופי: 0.01%), 4 μl של 10% מניות הפתרון temed (1:50 דילול, ריכוז סופי 0.2%), ו 4 μl של 10% פתרונות מניות APS (1:50 דילול, ריכוז סופי 0.2%).
      הערה: יש לעשות באופן מיידי את הפתרון של הגלינג. יש לשמור על הפתרון ב -4 ° c והפתרון APS צריך להתווסף אחרון, כדי למנוע הגלינג מוקדם.
    2. להסיר את הפתרון העודף מתוך מקטע הרקמה ולמקם את השקופית בצלחת פטרי 100 מ"מ. הוסיפו את התמיסה הטרייה והקרה למדגם, ומשם את התערובת על הרקמה למשך 30 דקות ב -4 ° c, כדי לאפשר דיפוזיה של פתרון לתוך הרקמה.
  3. בנו תא בשקופית סביב המדגם (איור 2א) מבלי להפריע לפתרון הגלינג.
    1. הפוך את הרווחים לחדר הגילינג באמצעות כיסוי דק של חתיכות זכוכית מכוסות בסכין יהלום.
      הערה: כדי להקל על הרחבת לאחר הדמיה, מרווחים צריך להיות קרוב עובי הדגימה כדי להפחית את כמות ג'ל ריק מעל הרקמה. מספר 1.5 זכוכית ניתן להשתמש עבור דגימות קליני סטנדרטי (5-10-0 μm). כיסוי חתיכות זכוכית יכול להיות מוערמים עבור דגימות עבות.
    2. אבטח את הרווחים משני צדי הרקמה באמצעות טיפות מים (~ 10 μL).
    3. הציבו בזהירות מכסה זכוכית מכסה על השקופית, והקפידו להימנע מהשמנה של בועות אוויר על הרקמה (איור 2ב').
  4. מודחת המדגם ב 37 ° c בסביבה מחולל לחות (כגון צלחת פטרי סגורה עם ניגוב לח) עבור 2 h.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. ניתן לאחסן את תא השקופיות בתוך צלחת פטרי אטומה ב -4 ° c.

4. לדוגמה העיכול

  1. הסר את המכסה של חדר הגילינג על ידי הזזת בעדינות להב תער מתחת לכיסוי ולהרים באיטיות את הכיסויים ממשטח ג'ל. חתוך את ג'ל ריק סביב הרקמה כדי למזער את עוצמת הקול. חותכים את ג'ל סימטרית כדי לעקוב אחר כיוון הג לאחר הומוגון, שכן המדגם יהפוך שקוף.
    1. לדלל ProK ידי 1:200 בתוך מאגר העיכול (ריכוז סופי 4 U/mL) לפני השימוש. הכינו פתרון מספיק כדי להטביע לחלוטין את הג; באר יחידה של לוח פלסטיק ארבע היטב התרבות תאים דורש לפחות 3 מ ל לכל טוב.
    2. מודג את המדגם במיכל סגור המכיל את מאגר העיכול עבור 3 h ב 60 ° c. אם המדגם אינו מתנתק מהשקופית במהלך העיכול, השתמש בלהב גילוח כדי להסיר בעדינות את המדגם.
      הערה: המדגם צריך להיות שקוע לחלוטין בתוך מאגר העיכול כדי למנוע את הדגימה מייבוש ולהציב מכולה מקורה (תיבת שקופית קטנה, היטב פלסטיק, צלחת פטרי, וכו ') כי ניתן לחתום עם הסרט.

5. מדגם הרחבה והדמיה

  1. השתמשו במברשת צבע רכה כדי להעביר את הדגימה לתוך 1x PBS במיכל התואם את מערכת ההדמיה הרצויה ומספיק גדול כדי להכיל את הג המורחב במלואו. ודא כי הרקמה ממוקמת עם המדגם-בצד למטה אם הדמיה על מערכת הפוכה או למעלה אם הדמיה על מערכת זקופה כדי למזער את המרחק ממטרת הדמיה למדגם. הפוך את הג באמצעות מברשת צבע רכה במידת הצורך.
    הערה: ניתן להשתמש בתאורה מתוך נורית LED כדי להפוך אותם לגלויים בנוזל. תקן 6-באר הצלחת יכול להכיל דגימות שיש להם קוטר מורחב מראש פחות מ 0.6 ס מ. צלחת זכוכית קרקעית היטב יש להשתמש עבור דימות על מערכת הפוכה.
  2. רוחצים את הדגימות ב-1x PBS ב RT עבור 10 דקות. במקרה הצורך, הכתם מחדש את המדגם עם 300 ננומטר DAPI כתהליך העיכול שוטף משם את הכתם DAPI. הסרת PBS וכתם עם 300 ננומטר DAPI מדולל 1 x PBS עבור 20 דקות ב RT, ואחריו 10 דקות לשטוף עם 1 x PBS ב RT.
    הערה: ניתן לכסות את הדגימות ב-1x PBS ומאוחסנות ב -4 ° c לפני שממשיכים לשלב הבא.
  3. כדי להרחיב את הדגימות, להחליף את ה-PBS ולשטוף עם נפח עודף של ddH2O (לפחות 10x הנפח ג'ל הסופי) 3-5 פעמים עבור 10 דקות כל אחד, ב RT.
    הערה: לאחר השטיפההשלישית אוהרביעית, הרחבת הדגימה צריכה להתחיל במישור. כדי לאחסן, כדי למנוע גידול חיידקי, את ddh2O יכול להיות שיושלם עם 0.002%-0.01% נתרן אזיד (נאן3). במקרה זה, מקדם ההתרחבות הסופי מופחת ב -10%.
  4. לבצע הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ רגיל שדה רחב, מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, או מערכת הדמיה אחרת של הבחירה.
    הערה: כדי למנוע מפני ג ' לים נסחף, עודף נוזל ניתן להסיר מן הבאר. ג ' לים יכולים גם להיות מקיבוע עם 1.5-2% נמוך-להמיס agarose. הכינו 1.5-2% (w/v) ממיסים במים במיכל 2 פי 4 מנפח הפתרון. חמם את הפתרון באמבט מים ב40 ° c או במיקרוגל במשך 10-20-עשרים להמיס את התמיסה. פיפטה את הצמח הנמס. מסביב לקצות הג לאחר התרת הצמח להרדן ב-RT או 4 ° צ', הוסיפו מים למדגם כדי למנוע התייבשות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אם הפרוטוקול בוצע בהצלחה (איור 1), דגימות יופיעו כג שטוח ושקוף לאחר המגון מכני הגון (איור 3א) והוא יכול להתרחב בפקטור של 3-4.5 x במים (איור 3ב), מתן רזולוציה אפקטיבית של ~ 70 ננומטר בהתאם לגורם ההתרחבות הסופי ומערכת הדמיה בשימוש5,16. איור 4 מציג תמונות לדוגמה של דגימת כליות ffpe עבה בעובי 5 יקרומטר המעובדות באמצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ExPath16, גרסה של proExM5 שניתן להחיל על הסוגים הנפוצים ביותר של דגימות ביופסיה קלינית בשימוש פתולוגיה, כולל ffpe, H & E ויטראז ', ויצורים קפואים טריים על שקופיות זכוכית. המרת עיצוב, שליפת אנטיגן, וכתמים חיסוני של הדגימות לעקוב אחר פרוטוקולים בשימוש נפוץ שאינם ספציפיים ExPath. בניגוד לפרוטוקול proExM המקורי9, expath מסתמך על ריכוז גבוה יותר של edta במאגר העיכול, אשר משפר את הרחבת הרקמות הקבועות של formalin, כפי שמתואר במחק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

YZ ו-OB הם שני ממציאים אשר הגישו והשיגו הגנה על פטנט על תת-ערכה של הטכנולוגיות המתוארות כאן (פטנטים בארה ב US20190064037A1, WO2018157074A1, ו WO2018157048A1).

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו הייתה נתמכת על ידי קרן הסטארט-up של הפקולטה מאוניברסיטת קרנגי מלון (YZ) ו-NIH החדש של מנהל משנה פרס (DP2 OD025926-01 עד YZ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מעכב 4-הידרוקסי-טמפו (4HT)מעכב176141 סיגמא אולדריץ'
צלחת זכוכית תחתונה 6 בארות (#1.5 כיסוי)CellvisP06-1.5H-N
אצטוןפישר ScientifcA18-500
אקרילאמידסיגמא אולדריץ'A8887
אקרילויל-X, SE (AcX)InvitrogenA20770
אגרוזFischer ScientifcBP160-100
אמוניום פרסולפט (APS)Sigma AldrichA3678Initiatior
Anti-ACTN4 נוגדן המיוצר בארנבנוגדן Sigma AldrichHPA001873
Anti-Collagen IV המיוצר בעכברSanta Cruz Biotechsc-59814
נוגדן אנטי-וימנטין המיוצר בעוףAbcamab24525
Aqua Hold II עט הידרופובימכשיר מדעי980402
מערך רקמות מחלות נפוצות בשדAbcamab178113
DAPI (1 מ"ג/מ"ל)Thermo Scientific62248יהלום כתם גרעיני
מס' 88 ס"מGeneral Tools31116
אתנולפארמקו111000200
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית
(EDTA) 0.5 M		VWRBDH7830-1
FFPE דגימת כליהUSBiomaxHuFPT072
מלקחיים
עיזים נגד עוף IgY (H+L), CF488Aביוטיום20020
נגד עוף IgY (H+L), CF633 ביוטיום סופח מאוד20121
עז נגד ארנב IgG (H+L) אלקסה פלואור 546InvitrogenA11010
MAXbind צביעה מוטיבפעיל15253ניתן להחליף במאגר סטנינג לא מסחרי לבחירה.
חסימת MAXblockמוטיב פעיל15252ניתן להחליף במאגר חסימה לא מסחרי לבחירה.
MAXwash כביסה בינוניתפעילה מוטיב15254ניתן להחליף במאגר כביסה לא מסחרי לבחירה.
זכוכית כיסוי מיקרו #1 (24 מ"מ x 60 מ"מ)VWR48393 106
זכוכית כיסוי מיקרו #1.5 (24 מ"מ x 60 מ"מ)VWR48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)		Sigma AldrichT9281Accelerator
N,N′-MethylenebisacrylamideSigma AldrichM7279
סרוםעיזים רגילJackson Immunoresearch005-000-121להכנת מאגר חוסם. תלוי בפונדקאי של בעלי חיים של נוגדנים משניים.
Nunclon 4-Well x 5 מ"ל MultiDish Cell Culture DishThermo Fisher167063צלחת תרבית פלסטית מרובת בארות
Nunclon 6-Well CellDish Thermo Fisher140675
Nunc 15 מ"ל  תרמו פישר339651
Nunc 50 מ"ל  תרמוחרוטי פישר339653
מברשת
שייקר
מטר
פוספט חוצץ מלח (PBS), 10x תמיסהFischer ScientifcBP399-1
צלחת פטרי מפלסטיק (100 מ"מ)Fischer ScientifcFB0875713
Proteinase K ( כיתה ביולוגיה מולקולרית)Thermo ScientificEO0491
סכין גילוחFischer Scientifc12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 מ"לThermo Fisher3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 מ"לתרמו פישר3459
נתרן אקרילטסיגמא אולדריץ'408220
נתרן כלוריSigma AldrichS6191
נתרן ציטראט tribasic dihydrateSigma AldrichC8532-1KG
Tris BaseFischer ScientifcBP152-1
Triton X-100Sigma AldrichT8787
אגלוטינין נבט חיטה מסומן CF640Rביוטיום29026
קסילניםסיגמא אולדריץ'214736
סכין עיזים בינוני בינוני Culture חרוטי צבעאורביטלי pH

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
  3. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).
  9. Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
  10. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  11. Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165(2016).
  12. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  13. Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  14. Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
  15. Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
  16. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Proteinase KFFPE

מאמרים קשורים