פרוטוקול לכידת מיקרודיסקציה (LCM) לכידה פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא
במאמר זה
סיכום
תקציר
התשואה והיושרה של RNA הם המכריע עבור ניתוח RNA. עם זאת, היא לעתים קרובות מאתגרת לשמור על שלמות RNA לאורך כל לכידת הלייזר (LCM) ההליך. מאז מחקרים LCM עבודה עם כמויות נמוכות של חומר, חששות בנוגע לתשואות RNA מוגבל הם גם חשובים. לכן, פרוטוקול LCM פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. ההשפעה של הפרוטוקול כתמים, עובי של קריודורים, כמות רקמת מיקרו, הוצאת RNA ערכת, ו LCM מערכת בשימוש על התשואה RNA ויושרה המתקבל מתאי עצם מיקרוגזור הוערך. שמונה-μm-עבה מפרקי עצם קפואים נעשו באמצעות סרט דביק מוכתם באמצעות פרוטוקול מהיר עבור כתם LCM מסחרי. המדגם היה דחוקה בין קרום פוליאתילן terאפרון (PET) ממברנה הסרט דבק. מערכת LCM המשתמשת בכוח הכבידה עבור אוסף דגימות ושיטת החילוץ של RNA המבוסס על עמודה שימשו כדי להשיג RNAs באיכות גבוהה של תשואה מספקת. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים באתרו בתאים של כל רקמה קשה הן בתנאים פיסיולוגיים ותהליכי המחלה.
מבוא
הרקמות מורכבת מסוגי תאים הטרוגנית ומבוזרים. סוגי תאים שונים ברקמה נתונה עלולים להגיב בצורה שונה לאותו אות. לכן, חיוני להיות מסוגל לבודד אוכלוסיות תאים מסוימות להערכת התפקיד של סוגי תאים שונים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. לכידת הלייזר (LCM) מציעה שיטה מהירה ומדויקת יחסית לבידוד והסרה של תאים שצוינו מרקמות מורכבות1. מערכות LCM להשתמש בכוחה של קרן לייזר כדי להפריד את התאים המעניינים סעיפים רקמות היסטולוגית ללא צורך בעיבוד אנזימטי או צמיחה בתרבות. משמעות הדבר היא כי התאים נמצאים בבית הגידול הטבעי שלהם רקמות, וכי ארכיטקטורת רקמות כולל הקשר המרחבי בין תאים שונים נשמרת. מורפולוגיה של שני התאים השבויים והרקמה השיורית נשמרת היטב, וניתן לדגום מספר רכיב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
רקמת העצם מעכברים שימש בהתאמה קפדנית עם הנחיות השוררים לטיפול בעלי חיים וכל המאמצים נעשו כדי למזער סבל בעלי חיים.
1. בעלי חיים והקפאת הטבעה
- חיות הבית בתנאים של טמפרטורת החדר קבוע (RT; 24 ° c) ו 12 h אור/12 h מחזור כהה עם גישה חופשית למזון ולמים.
הערה: רקמות העצם במחקר זה הושגו 3-חודש בן זכר פראי סוג C57BL/6 עכברים. - על נמק, לדימום עכברים מתוך הווריד הבטני הבטן תחת הרדמה כללית (קטמין/xylazine, 100/6 mg/ק"ג בתוך הצפק).
הערה: על מנת למנוע השפלה RNA, להשתמש RNase-מכשירים חינם וחומרים, ללבוש כפפות ולעבוד במהירות הימנעות אחסון של דגימות ב RT בכל הניסוי כולו. - מסירים את העצמות המק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול LCM פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם של העכבר femurs. בפרוטוקול אופטימיזציה, 8 μm-עבה מקטעים עצם קפואים נחתכו על סרט דביק מוכתם באמצעות פרוטוקול מהיר עבור כתם LCM מסחרי קפוא המקטע. הדגימה הייתה דחוקה בין קרום חיית המחמד לבין הסרט הדביק. תאי עצם העכבר היו מיקרובאמצעות מערכת LCM המשתמשת הכבידה עבור אוסף לדוגמה. שיטת הוצאת RNA מבוססת עמודה שימש להשגת רנ א באיכות גבוהה של תשואה מספקת. התשואה והשלמות של RNA מבודדים נמדדה באמצעות אלקטרופורזה מיקרו-נימי (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הן איכות וכמות RNA יכול להיות מושפע באופן שלילי בכל שלבי ההכנה לדוגמה כגון מניפולציה רקמות, תהליך LCM, ו-RNA חילוץ. לכן, פרוטוקול LCM פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנטי הבאים.
עבור lcm, רוב המעבדות משתמשות בסעיפים 7 עד 8 יקרומטר עבה2. חלקים עבים יותר יאפשרו לקצור חומר נוסף. עם זאת, אם הם עבים מדי, זה יכול להפחית את הרזולוציה המיקרוסקופית ואת הלייזר אולי לא יוכל לחתוך. סביר להניח כי עובי רקמות אופטימלי תלוי במערכת lcm (ואת סוג הלייזר והשקופית) משמש, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחברים מודים ליוץ ' ולניקוללה גיסנר על העזרה הטכנית המצוינת שלהם, כמו גם על הצוות האחראי על הטיפול בבעלי חיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-מרקפטואתנול | סיגמא | 63689-25ML-F | |
| אתנול מוחלט EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| סרט דבק (סרט LMD) | מעבדת חתך | C-FL001 | |
| Agilent 2100 מערכת ביואנלייזר | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico ערכת שבבים | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| כלי התאמת Cryofilm | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, צבע חתוך כתום חלבי | VWR מדעי החיים | 631-1559 | |
| תבניות רקמות היסטולוגיה PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 לייזר מיקרודיסקציה מערכת | Leica Microsystems | ||
| להבי מיקרוטום בפרופיל נמוך Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| מים נטולי גרעין | VWR Life Science | E476-500ML | |
| מגלשות ממברנה PET 1.4 μ m | מכונות מולקולריות & תעשיות GmbH | 50102 | |
| RNase Away משטח ניקוי | ביולוגי מולקולרי | 7002 | |
| RNeasy מיקרו קיט | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| קסילן | VWR מדעי החיים | 2,89,73,363 |
מקורות
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Ca....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
